孟令鍇 張朝立 高長(zhǎng)久 等

[摘要] 目的 建立同時(shí)測(cè)定百華花楸果實(shí)中金絲桃苷和蘆丁含量的高效液相色譜分析方法。 方法 采用高效液相色譜法，色譜柱為Zorbax SB-C18柱（5 μm，4.6 mm×250 mm），流動(dòng)相為甲醇∶乙腈∶0.025 mol/L磷酸（10∶20∶70），流速1.0 mL/min，檢測(cè)波長(zhǎng)363 nm，柱溫30℃。 結(jié)果 金絲桃苷和蘆丁分別在0.1～0.8 μg和0.16～1.28 μg范圍內(nèi)，進(jìn)樣量與色譜峰面積呈良好線性關(guān)系，相關(guān)系數(shù)分別為0.9994和0.9992；平均回收率（n = 9）分別為98.58%和98.22%，RSD分別為1.71%和1.81%；平均含量分別為0.473、0.342 mg/g。 結(jié)論 該法操作簡(jiǎn)便、準(zhǔn)確，穩(wěn)定性及重復(fù)性好，可用于對(duì)百華花楸果實(shí)中金絲桃苷和蘆丁成分的含量測(cè)定。

[關(guān)鍵詞] 百華花楸；金絲桃苷；蘆??；高效液相色譜法

[中圖分類號(hào)] R927.2 [文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼] A [文章編號(hào)] 1673-7210（2016）02（a）-0032-05

HPLC determination of content of hyperoside and rutin in fruit of Srobus pohuashanensis

MENG Lingkai1 ZHANG Chaoli1 GAO Changjiu1 LI Jie2

1.Natural Medicinal Chemistry and Pharmacognosy Teaching and Research Section， Mudanjiang Medical College， Heilongjiang Province， Mudanjiang 157011， China； 2.Department of Hematology， the Affiliated Hongqi Hospital of Mudanjiang Medical College， Heilongjiang Province， Mudanjiang 157011， China

[Abstract] Objective To establish HPLC method for the determination of hyperoside and rutin in fruit of Srobus pohuashanensis. Methods The Zorbax SB-C18 （5 μm， 4.6 mm×250 mm） column was adopted and eluted with mobile phase consisted of methanol∶acetonitrile∶0.025 mol/L aqueous phosphoic acid （10∶20∶70） at the column temperature of 30℃. The flow rate was 1.0 mL/min and detective wave length was 363 nm. Results Hyperoside was proved to be linear in the range of 0.16-1.28 μg with a regression coefficient of 0.9992， the average recovery was 98.22% with RSD of 1.71%； Rutin was proved to be linear in the range of 0.1-0.8 μg with a regression coefficient of 0.9994， the average recovery was 98.58% with RSD of 1.81%. The average content of hyperoside and rutin was 0.473 mg/g and 0.473 mg/g respectively. Conclusion The developed method is convenient and accurate with high repeatability and stability， which is suitable for the content determination.

[Key words] Srobus pohuashanensis； Hyperoside； Rutin； HPLC method

百華花楸（Srobus pohuashanensis）為薔薇科（Ros-aceae）花楸屬（Sorbus）植物，其果實(shí)稱“花楸果” [1]。薔薇科 （Rosaceae）花楸屬（Sorbus）在全世界有80余種，廣產(chǎn)于熱帶及亞熱帶地區(qū)，尤其在北半球，系為分布廣闊的大屬植物。我國(guó)有50余種，分布于東北、西北和東南等地區(qū)。該屬植物民間很早就入藥，藥用的花楸主要有西伯利亞花楸（S.aucu Paria）、百華花楸（S.pohuashanensis）、天山花楸（S.tianshanie）及變種天山毛花楸（S.tianshaniea.var.tomentosa）等[2]。研究表明，花楸屬植物中含有較豐富的黃酮、花青素、類山梨酸苷、生氰苷等成分，具有抗氧化、抗癌、抗輻射、降糖、保護(hù)心肌缺血和止咳平喘等藥理作用[2-5]?；ㄩ睂僦参锏墓麑?shí)也具有較高的藥用價(jià)值，研究證實(shí)其主要的活性成分為黃酮類化合物，主要為金絲桃苷、蘆丁等活性物質(zhì)[6-8]。百華花楸產(chǎn)自我國(guó)黑龍江、吉林、遼寧、內(nèi)蒙古等地區(qū)。民間常以果實(shí)、嫩枝葉及莖皮入藥。其果實(shí)味苦甘、性平；嫩枝葉及莖皮味苦、無毒，具有清熱利肺、補(bǔ)脾生津之功效[9]。百華花楸在黑龍江省資源豐富，但相關(guān)研究卻相對(duì)滯后，關(guān)于百華花楸的報(bào)道多集中在育苗、扦插繁殖等方面。對(duì)于其化學(xué)成分及藥理作用鮮有報(bào)道。近年來，本課題組對(duì)百華花楸果實(shí)進(jìn)行了系統(tǒng)研究，已初步探明了其抗炎、鎮(zhèn)咳、平喘等藥效物質(zhì)基礎(chǔ)及作用機(jī)制[10-12]。為了進(jìn)一步合理開發(fā)利用該植物藥材資源，控制其內(nèi)在質(zhì)量，本課題組以金絲桃苷和蘆丁作為指標(biāo)成分，采用高效液相色譜法同時(shí)測(cè)定其在百華花楸果實(shí)中的含量，以便建立一種簡(jiǎn)便易行，結(jié)果準(zhǔn)確可靠的金絲桃苷和蘆丁的測(cè)定方法，為該藥材藥用資源的系列開發(fā)提供參考資料。

1 儀器與試藥

Agilent 1100高效液相色譜儀（美國(guó)Agilent公司）；KQ5200超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；甲醇、乙腈為色譜純，水為重蒸水；金絲桃苷對(duì)照品（購(gòu)于中國(guó)藥品生物制品檢定所，批號(hào)：111521-200303），蘆丁對(duì)照品（購(gòu)于中國(guó)藥品生物制品檢定所，批號(hào)：100080-200306），其余試劑均為分析純。

百華花楸果實(shí)采自黑龍江省牡丹江地區(qū)，經(jīng)牡丹江醫(yī)學(xué)院天然藥物化學(xué)與生藥學(xué)教研室吳兆華教授鑒定為薔薇科（Rosaceae）花楸屬（Sorbus）百華花楸（Srobus pohuashanensis）干燥成熟的果實(shí)。

2 方法與結(jié)果

2.1 檢測(cè)波長(zhǎng)的確定

取適當(dāng)濃度的金絲桃苷與蘆丁混合對(duì)照品溶液進(jìn)行紫外掃描，在200～600 nm波長(zhǎng)下，金絲桃苷與蘆丁在363 nm波長(zhǎng)處有較強(qiáng)吸收，并且兩峰分離效果較好，故選定檢測(cè)波長(zhǎng)為363 nm。

2.2 色譜條件的確定

色譜柱：Zorbax SB-C18柱（5 μm，4.6 mm×250 mm），流動(dòng)相：甲醇︰乙腈︰0.025 mol/L磷酸（10∶20∶70），流速為1.0 mL/min，檢測(cè)波長(zhǎng)為363 nm，柱溫為30℃。在本色譜條件下，百華花楸果實(shí)中蘆丁和金絲桃苷的色譜峰與其他成分相鄰的色譜峰能夠達(dá)到很好的分離，理論塔板數(shù)按金絲桃苷和蘆丁色譜峰計(jì)算均不低于5000。結(jié)果見圖1。

2.3 樣品中金絲桃苷和蘆丁提取方法的考察

稱取百華花楸果實(shí)藥材9份，每份5 g，以甲醇超聲提取，選取溶劑用量（A）、提取時(shí)間（B）和提取次數(shù)（C）為考察因素，每個(gè)因素選取3個(gè)水平，因素水平表見表1，選用L9（34）正交試驗(yàn)表安排實(shí)驗(yàn)，以金絲桃苷提取率為考察指標(biāo)，將結(jié)果填入正交試驗(yàn)表中，進(jìn)行直觀分析和方差分析[13-15]。由表2、4可知，RC>RA>RB，表明提取率的影響從大到小分別為：提取次數(shù)>溶劑用量>提取時(shí)間；以蘆丁提取率為考察指標(biāo)，將結(jié)果填入正交試驗(yàn)表中，進(jìn)行直觀分析和方差分析。由表3、5可知，RC>RA>RB，表明提取率的影響從大到小分別為：提取次數(shù)>溶劑用量>提取時(shí)間；通過以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果，結(jié)合直觀分析、方差分析及實(shí)際實(shí)驗(yàn)情況，最終確定實(shí)驗(yàn)方案為：20倍提取溶劑，超聲提取3次，每次30 min。

表1 因素水平表

表2 金絲桃苷提取優(yōu)化正交試驗(yàn)結(jié)果

表3 蘆丁提取優(yōu)化正交試驗(yàn)結(jié)果

表4 金絲桃苷含量為指標(biāo)方差分析

注：*表示顯著性

2.4 溶液的制備

2.4.1 對(duì)照品溶液的制備 精密稱取4.0 mg金絲桃苷對(duì)照品，置于25 mL容量瓶中，加入少量甲醇超聲溶解并稀釋定容至刻度，制成160 μg/mL的金絲桃苷對(duì)照品儲(chǔ)備液；另精密稱取2.5 mg蘆丁對(duì)照品，置于25 mL容量瓶中，加入少量甲醇超聲溶解并稀釋定容至刻度，制成100 μg/mL的蘆丁對(duì)照品儲(chǔ)備液；分別精密吸取2 mL蘆丁對(duì)照品儲(chǔ)備液和2 mL金絲桃苷對(duì)照品儲(chǔ)備液置于10 mL容量瓶中，搖均，甲醇定容至刻度，制成含20 μg/mL蘆丁對(duì)照品和32 μg/mL金絲桃苷對(duì)照品的混合對(duì)照品儲(chǔ)備液。

2.4.2 樣品溶液的制備 稱取百華花楸果實(shí)藥材5 g，置于100 mL容量瓶中，加適量甲醇，超聲提取3次，每次30 min，再加甲醇定容至刻度，離心，取上清液經(jīng)0.45 μm的微孔濾膜過濾，即得。

2.5 線性關(guān)系考察

精密吸取金絲桃苷對(duì)照品儲(chǔ)備液1.0、2.0、4.0、6.0、8.0 mL于10 mL量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，按“2.2”項(xiàng)下條件，進(jìn)樣10 μL，測(cè)定峰面積，以峰面積值為縱坐標(biāo)，對(duì)照品量（μg）為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算回歸方程為：Y=4.08×104X +6.68×103，r = 0.9992，結(jié)果表明金絲桃苷在0.16～1.28 μg的范圍內(nèi)呈良好線性關(guān)系；另精密吸取蘆丁對(duì)照品儲(chǔ)備液1.0、2.0、4.0、6.0、8.0 mL于10 mL量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，按“2.2”項(xiàng)下條件，進(jìn)樣10 μL，測(cè)定峰面積，以峰面積值為縱坐標(biāo)，對(duì)照品量（μg）為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算回歸方程Y=3.87×104X+5.79×103，r = 0.9994，結(jié)果表明蘆丁在0.1～0.8 μg的范圍內(nèi)呈良好線性關(guān)系。

2.6 精密度試驗(yàn)

精密吸取金絲桃苷和蘆丁混合對(duì)照品儲(chǔ)備液，按“2.2”項(xiàng)下條件，重復(fù)進(jìn)樣6次，每次進(jìn)樣量10 μL，記錄峰面積，計(jì)算日內(nèi)精密度；連續(xù)進(jìn)樣3 d，計(jì)算日間精密度。結(jié)果表明，日內(nèi)精密度：金絲桃苷峰面積值的RSD=0.58%，蘆丁的RSD=0.76%；日間精密度：金絲桃苷峰面積值的RSD=0.77%，蘆丁的RSD=0.87%。以上結(jié)果表明儀器精密度較好。

2.7 穩(wěn)定性試驗(yàn)

取同一份供試品溶液，按“2.2”項(xiàng)下條件，分別于0、1、2、4、8 h分別進(jìn)樣測(cè)定，記錄金絲桃苷、蘆丁組分峰面積。結(jié)果金絲桃苷峰面積值的RSD=0.79%；蘆丁峰面積值的RSD=0.92%，表明金絲桃苷、蘆丁組分在8 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.8 重復(fù)性試驗(yàn)

取百華花楸果實(shí)藥材5 g，按“2.4.2”項(xiàng)下樣品溶液的制備方法進(jìn)行，平行制備供試液6份，按“2.2”項(xiàng)下條件測(cè)定含量，藥材中金絲桃苷和蘆丁的平均含量分別為0.47、0.34 mg/g。RSD分別為1.18%、1.59%。表明方法重復(fù)性較好。

2.9 回收率試驗(yàn)

精密稱取已測(cè)知含量的百華花楸果實(shí)藥材5 g，按照“2.4.2”項(xiàng)下樣品制備方法制備供試品溶液，吸取供試品溶液2、4、6 mL各3份，分別置于10 mL容量瓶中，再精密加入高、中、低濃度的金絲桃苷和蘆丁對(duì)照品溶液，加甲醇定容至刻度，按“2.2”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行進(jìn)樣測(cè)定，結(jié)果見表6、7。結(jié)果金絲桃苷回收率的RSD與蘆丁回收率的RSD均小于2%，表明該方法準(zhǔn)確度較高。

表6 金絲桃苷回收率測(cè)定結(jié)果（n = 9）

表7 蘆丁回收率測(cè)定結(jié)果（n = 9）

2.10 樣品測(cè)定

取百華花楸果實(shí)藥材樣品6份，精密稱定，置100 mL量瓶中加甲醇適量，超聲提取3次，每次30 min，放冷，用甲醇稀釋至刻度，搖均，過濾，取濾液再經(jīng)0.45 μm的微孔濾膜濾過，即得。精密吸取供試品溶液10 μL，注入高效液相色譜儀，按“2.2”項(xiàng)下條件測(cè)定，記錄色譜峰面積，采用標(biāo)準(zhǔn)曲線記錄含量。結(jié)果樣品中金絲桃苷與蘆丁的平均含量分別為0.473、0.342 mg/g；RSD分別為1.29%、1.28%。結(jié)果見表8。

表8 含量測(cè)定結(jié)果（n = 6）

1.蘆丁 2.金絲桃苷

圖1 混合對(duì)照品（A）與樣品溶液（B）高效液相色譜圖

3 討論

黑龍江省花楸屬植物資源較為豐富，花楸屬植物果實(shí)具有較高的藥用價(jià)值，其主要的活性成分為黃酮類化合物，主要為金絲桃苷、蘆丁等活性物質(zhì)，具有解痙、鎮(zhèn)咳、抗炎、抗病毒等作用。目前，對(duì)黑龍江省百華花楸果實(shí)相關(guān)研究較匱乏，尚未見有同時(shí)測(cè)定百華花楸果實(shí)中金絲桃苷、蘆丁兩組分的文獻(xiàn)報(bào)道。本研究采用高效液相色譜法同時(shí)測(cè)定金絲桃苷和蘆丁的含量，方法簡(jiǎn)便易行，結(jié)果準(zhǔn)確、可靠?？勺鳛榘偃A花楸果實(shí)中金絲桃苷和蘆丁的含量測(cè)定方法。

本實(shí)驗(yàn)對(duì)百華花楸果實(shí)中金絲桃苷和蘆丁成分的提取條件進(jìn)行了優(yōu)化，分別對(duì)提取溶劑用量（10、15、20倍）、提取時(shí)間（30、50、70 min）、提取次數(shù)（1、2、3次）進(jìn)行正交試驗(yàn)，最終確定20倍的甲醇為提取溶劑，超聲提取3次，每次30 min作為最佳提取工藝，該條件下金絲桃苷和蘆丁提取率較高，且方法簡(jiǎn)單，經(jīng)濟(jì)實(shí)用；在進(jìn)行金絲桃苷色譜條件優(yōu)化試驗(yàn)中，依據(jù)資料記載情況[16-23]，分別對(duì)甲醇-磷酸；乙腈-水；乙腈-磷酸；甲醇-乙腈-磷酸等多種流動(dòng)相進(jìn)行了考察，結(jié)果發(fā)現(xiàn)以甲醇-磷酸為流動(dòng)相條件下，金絲桃苷與蘆丁色譜峰不能達(dá)到很好的分離，基線漂移嚴(yán)重；以乙腈-水為流動(dòng)相條件下，金絲桃苷色譜峰存在拖尾現(xiàn)象；以乙腈-磷酸為流動(dòng)相條件下，金絲桃苷色譜峰出現(xiàn)拖尾，且基線不穩(wěn)；因此選擇甲醇-乙腈-磷酸為流動(dòng)相；考察了加入不同物質(zhì)量的磷酸（0.01、0.025、0.05、0.075 mol/L）的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，發(fā)現(xiàn)當(dāng)加入0.025 mol/L的磷酸進(jìn)行洗脫時(shí)的柱效和分離度最好，并能有效消除拖尾現(xiàn)象，因此最終確定以甲醇∶乙腈∶0.025 mol/L磷酸（10∶20∶70）為最佳流動(dòng)相。

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（收稿日期：2015-11-26 本文編輯：趙魯楓）