姜華 吳國清?

嵌合抗原受體修飾T細(xì)胞在血液腫瘤中的研究進(jìn)展

姜華 吳國清?

嵌合抗原受體修飾T細(xì)胞（CAR-T）技術(shù)近年來在血液腫瘤的臨床研究中取得良好的療效。在美國基于CD19的CAR-T療法已經(jīng)進(jìn)入Ⅱ期臨床試驗階段，前景可觀。CAR-T靶向惡性腫瘤細(xì)胞抗原，將能夠識別該抗原的結(jié)構(gòu)通過基因工程技術(shù)的手段使其在患者T細(xì)胞的表面，進(jìn)而特異性的識別惡性腫瘤細(xì)胞，最終將其殺滅。

1 CAR的結(jié)構(gòu)

CAR是人為設(shè)計的結(jié)構(gòu)，主要包括胞外抗原結(jié)合區(qū)，跨膜區(qū)，胞內(nèi)信號區(qū)。胞外抗原結(jié)合區(qū)主要是來源于與腫瘤特異性抗原相對應(yīng)的單克隆抗體的單鏈可變區(qū)（single-chain variable fragment，scFv），通過跨膜區(qū)與胞內(nèi)的信號區(qū)相連。胞內(nèi)信號區(qū)最初包括TCR復(fù)合體的CD3ζ鏈，具有免疫受體酪氨酸活化基序（immunoreceptor tyrosine-based activation motifs，ITAMs）負(fù)責(zé)T細(xì)胞信號的轉(zhuǎn)導(dǎo)［1］。CAR-T的優(yōu)勢是通過MHC非限制性的方式識別腫瘤抗原，有效避免有些腫瘤細(xì)胞因MHC表達(dá)降低而造成的免疫逃逸［2］。1987年Kuwana課題組首次將免疫球蛋白的V區(qū)與T細(xì)胞受體（T cell receptor，TCR）的α鏈和β鏈的恒定區(qū)融合構(gòu)建可特異識別腫瘤細(xì)胞的CAR 原型［3］。隨后CAR 經(jīng)歷多種修飾（見圖1）。從最初的單一信號分子發(fā)展到加入共刺激分子［4-5］，再到將細(xì)胞因子的基因也一同導(dǎo)入，逐漸增強CAR-T的識別能力，使這項技術(shù)更為精準(zhǔn)、安全。加入細(xì)胞因子基因可以在T細(xì)胞殺傷腫瘤細(xì)胞的同時可以釋放大量的穿孔素、顆粒酶或表達(dá)FasL配體、腫瘤壞死因子（TNF）等［6］，從而誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞的凋亡。

CAR-T細(xì)胞制備的基本過程：通過淋巴細(xì)胞單采技術(shù)從患者體內(nèi)采集外周血單個核細(xì)胞（Peripheral Blood Mononuclear Cell，PBMC），并在體外用載體將CAR的基因?qū)隩細(xì)胞，并進(jìn)行大量擴增，再回輸入患者的體內(nèi)。通過基因工程技術(shù)改造的T細(xì)胞可特異性識別腫瘤細(xì)胞并通過釋放細(xì)胞因子誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞的凋亡。目前應(yīng)用于臨床試驗的導(dǎo)入外源基因的載體有病毒載體（逆轉(zhuǎn)錄病毒、慢病毒等）和非病毒載體（點穿孔技術(shù)、脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染等）。最早的CAR-T構(gòu)建時使用的是逆轉(zhuǎn)錄病毒，其安全性及穩(wěn)定性均可圈可點［7］。逆轉(zhuǎn)錄病毒感染主要是分裂期細(xì)胞，對于非分裂細(xì)胞感染能力較差，而慢病毒則對分裂和非分裂期細(xì)胞均具有較好的感染能力。因此絕大多數(shù)CAR-T細(xì)胞制備時使用的是慢病毒系統(tǒng)。除此之外，轉(zhuǎn)座子轉(zhuǎn)染以其低毒、不易引起插入突變和機體的免疫反應(yīng)等優(yōu)點，越來越多的被應(yīng)用在外源基因轉(zhuǎn)導(dǎo)中。被譽為“睡美人”（sleeping beauty，SB）的DNA轉(zhuǎn)座子是一種天然的、非病毒載體，可以攜帶特定的DNA片段進(jìn)行基因轉(zhuǎn)移。應(yīng)用SB轉(zhuǎn)座子能將目的基因轉(zhuǎn)移至體細(xì)胞、胚胎干細(xì)胞及分裂期細(xì)胞和非分裂期細(xì)胞，研究表明目的基因在整合到基因組后均能長期穩(wěn)定表達(dá)［8］。但其不足之處是SB的轉(zhuǎn)染效率不夠高。

2 CAR-T在血液腫瘤中的研究進(jìn)展

2.1 B系血液腫瘤 B細(xì)胞是來源于骨髓的多能造血干細(xì)胞。CD19表面抗原表達(dá)于除漿細(xì)胞外的幾乎所有的B細(xì)胞表面，成為B系血液腫瘤良好的表面標(biāo)志，基于CD19的CAR-T應(yīng)運而生。2011年，美國賓夕法尼亞州大學(xué)Carl H.June領(lǐng)導(dǎo)的團隊在新英格蘭醫(yī)學(xué)雜志報道采用針對CD19的CAR-T細(xì)胞治療1例難治性慢性B淋巴細(xì)胞白血病，獲得完全緩解，并持續(xù)6個月［9］，這是首次單獨用免疫治療對晚期白血病治療獲得成功，此后CAR-T迅速成為熱點的研究方向。Jena小組用逆轉(zhuǎn)錄病毒轉(zhuǎn)染CAR結(jié)構(gòu)序列應(yīng)用于急性和慢性B系淋巴細(xì)胞白血病患者，后期結(jié)果顯示，臨床應(yīng)用安全有效［10］。CD20這個靶點主要用于治療B細(xì)胞非霍奇金淋巴瘤（B-NHL），而CD22在急性淋巴細(xì)胞白血病（B-ALL）和成熟淋巴細(xì)胞惡性腫瘤上高表達(dá)，對于CD19低表達(dá)或CD19分子丟失的B-ALL細(xì)胞而言，CD22有希望成為CD19在B-ALL上的替代靶點。此外，將抗體藥物與CAR-T療法聯(lián)合應(yīng)用有可能增強T細(xì)胞的增殖能力，同時減輕移植物排斥反應(yīng)［11-12］。

2.2 急性髓細(xì)胞白血病（Acute Myeloid Leukemia，AML）對于AML，有研究應(yīng)用Lewis Y（LeY）抗原和NKG2D這兩種抗原作為治療的靶點進(jìn)行了探索。LeY寡糖抗原是腫瘤相關(guān)糖抗原，存在于erbB癌基因編碼的產(chǎn)物中。其被證實不表達(dá)于紅細(xì)胞表面，極少表達(dá)于正常組織的細(xì)胞表面，但表達(dá)于多數(shù)的血液腫瘤細(xì)胞表面，其中包括AML［13］。2013年一項研究中，4例AML高危患者應(yīng)用針對該抗原的二代CAR-T，其中3例患者有效。但CAR-T細(xì)胞持續(xù)存在的情況下，疾病依然緩慢進(jìn)展［14］。NKG2D是由NK細(xì)胞和T細(xì)胞表達(dá)的一種活化的受體，而NKG2D配體在正常組織中呈現(xiàn)限制性的表達(dá)，但其在惡性腫瘤和被感染的細(xì)胞內(nèi)通常是過表達(dá)。有研究嘗試基于NKG2D配體構(gòu)建CAR［15］，但依然受制于嚴(yán)重的細(xì)胞毒性［16］。在CD33和CD123的研究中，似乎靶向CD123的CAR-T對于正常細(xì)胞的殺傷更?。?7-19］。但兩者造成的細(xì)胞毒性同樣不可忽視。從抗原抗體親和力考慮，將特異性受體如葉酸等嵌入CAR-T結(jié)構(gòu)中，有望提高T細(xì)胞的抗腫瘤活性，降低毒副反應(yīng)。

2.3 多發(fā)性骨髓瘤（Multiple Myeloma，MM） MM是漿細(xì)胞異常增生的惡性腫瘤。由于最佳靶點CD19在漿細(xì)胞的缺失，研究人員致力于尋找漿細(xì)胞特異性的靶點，而骨髓瘤細(xì)胞表面糖蛋白CS1是其中之一。CS1表達(dá)于多數(shù)的惡性漿細(xì)胞和部分正常漿細(xì)胞，淋巴細(xì)胞、活化的單核細(xì)胞和樹突狀細(xì)胞也有較低水平的表達(dá)，但并未見于其他的正常組織［20］。目前應(yīng)用于MM晚期的一種可溶性抗體伊洛珠單抗elotuzumab，即是靶向CS1［21］。2014年 Chu J小組設(shè)計針對該抗原的CAR，其同時轉(zhuǎn)染T細(xì)胞和NK細(xì)胞，結(jié)果發(fā)現(xiàn)在小鼠模型中能夠有效抑制MM疾病進(jìn)程，顯著延長小鼠的生存期。因此CS1可能成為治療MM的有效靶點［22-23］。盡管如此，這種方法仍存在擔(dān)憂，因這種CAR可能會通過CS1攻擊活化的T細(xì)胞，從而損傷正常T細(xì)胞。此外，CS1是可溶性抗原，這對CAR-T在體內(nèi)發(fā)揮抗腫瘤作用也是一個挑戰(zhàn)。此外潛在的靶點還包括κ輕鏈、CD138、B細(xì)胞成熟抗原（B cell maturation antigen，BCMA）、細(xì)胞表面糖蛋白CD38、NKG2D 、CD44v6等［24-25］。目前，MM的治療受制于MM復(fù)雜性、表型和功能的異質(zhì)性及微環(huán)境，故療效并不理想［26-27］。

3 CAR-T細(xì)胞面臨的難題與未來的設(shè)想

CAR-T目前面臨的主要難題是“脫靶”效應(yīng)，即CAR-T對于正常細(xì)胞和組織的殺傷［28］。基于CD19的CAR-T對于正常B細(xì)胞的殺傷尤其嚴(yán)重。Rosenberg小組在2011年進(jìn)行臨床實驗來評估抗CD19-CAR-T造成的B系細(xì)胞的毒性，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，8例患者中有4例表現(xiàn)為長期的B系細(xì)胞發(fā)育不良，而此類的副作用屢見不鮮。另一個嚴(yán)重的毒副作用即細(xì)胞因子釋放綜合征（cytokine release syndrome，CRS），造成部分患者死亡，死亡患者中血清炎性介質(zhì)IFNγ和TNF的顯著升高［29］。引起CRS較常見的炎性細(xì)胞因子是白細(xì)胞介素6（Interleukin 6，IL-6），應(yīng)用抗IL-6的抗體可以緩解由于CRS引起的機體損傷，損傷嚴(yán)重時可以應(yīng)用甾體或激素類藥物，但需要明確的是這些藥物會顯著降低CAR-T的療效［30］。CRS引起的器官損傷，幾乎包括所有系統(tǒng)，比如神經(jīng)系統(tǒng)出現(xiàn)頭痛，高熱，譫妄，失語，甚至腦水腫，這可能與炎癥介質(zhì)IFNγ、IL-6有關(guān)；心血管毒性，可能由發(fā)熱引起的心動過速，低血壓，射血分?jǐn)?shù)下降，原因未知的心肌負(fù)荷加重，心臟停博；呼吸系統(tǒng)出現(xiàn)肺水腫，呼吸困難，窒息，肺炎；急性腎臟損傷，膽紅素的上升，三系細(xì)胞減少，乏力，肌痛，關(guān)節(jié)痛，食欲下降等。除此以外，變態(tài)反應(yīng)和移植物抗宿主病也危害機體甚至造成死亡［31］。

CAR-T發(fā)展至今已經(jīng)走過20+年，縱觀CAR-T的發(fā)展歷程，有幾點展望：首先，尋找最佳的腫瘤特異性抗原是解決目前較為嚴(yán)重的“脫靶” 效應(yīng)的關(guān)鍵；其次，探索最佳的CAR結(jié)構(gòu)，包括合理的CM，細(xì)胞因子，載體等；再次，如何克服T細(xì)胞回輸后在體內(nèi)持續(xù)增殖的問題，最后，尋找有效預(yù)防和治療CRS及其他副作用的方法。目前一些新嘗試包括：在CAR的基礎(chǔ)上引入自殺基因、分子開關(guān)或開發(fā)多靶點CAR-T技術(shù)；應(yīng)用非整合性的慢病毒載體、電穿孔、睡美人轉(zhuǎn)座子等技術(shù)解決潛在的插入突變問題，改善長期安全性；應(yīng)用CRISPR/cas9技術(shù)改造CAR-T細(xì)胞，即對回輸?shù)腃AR-T細(xì)胞敲除內(nèi)源性的TCR和MHC分子，避免引起宿主的免疫排斥反應(yīng)，提高CAR-T細(xì)胞識別的效率；CAR-T中加入趨向因子受體，增強其靶向性。綜上所述，目前的臨床研究發(fā)現(xiàn)CAR-T細(xì)胞治療血液腫瘤療效顯著，未來CAR-T細(xì)胞必將成為治療血液腫瘤的重要手段之一，但其安全性及特異性還有待進(jìn)一步提高。

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310053 浙江中醫(yī)藥大學(xué)（姜華）310000 浙江省人民醫(yī)院（吳國清）

*通信作者