雷一鳴 楊逸冬 譚嗣偉 林顯藝 吳斌

【摘要】目的研究腫瘤壞死因子α（TNFα）通過內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激信號通路對肝癌細胞自噬和增殖的作用。方法利用免疫組織化學(xué)檢測原發(fā)性肝細胞癌患者癌灶組織、配對的癌旁組織，以及肝血管瘤患者瘤旁正常肝組織中TNFα、BECN1、LC3B、PCNA的表達水平。用人源TNFα重組因子刺激肝癌細胞株HepG2后，通過蛋白免疫印跡法檢測自噬相關(guān)蛋白BECN1、LC3B以及細胞增殖標(biāo)志物PCNA表達水平，并利用自噬抑制劑3MA抑制HepG2細胞自噬后，檢測TNFα刺激后的細胞活性及PCNA蛋白水平的改變情況。通過蛋白免疫印跡法檢測TNFα刺激HepG2細胞后內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激通路相關(guān)蛋白eIF2α、peIF2α的表達水平。結(jié)果肝細胞癌患者癌灶和癌旁組織中TNFα、BECN1、LC3B、PCNA蛋白表達量均較正常人肝組織升高。TNFα刺激HepG2細胞后，細胞內(nèi)BECN1、LC3B、PCNA蛋白表達水平升高，細胞活性增強，使用3MA 抑制HepG2細胞自噬后，細胞PCNA蛋白表達水平以及細胞活性下降，TNFα刺激HepG2細胞后內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激活性標(biāo)志物eIF2α磷酸化水平明顯增加。結(jié)論 TNFα通過內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激信號通路誘導(dǎo)肝癌細胞自噬，從而促進肝癌細胞的增殖。

【關(guān)鍵詞】肝細胞癌；腫瘤壞死因子α；自噬；內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激

TNFα induces autophagy and promotes proliferation of liver cancer cells via ER stress signaling pathwayLei Yiming， Yang Yidong， Tan Siwei， Lin Xianyi， Wu Bin Department of Gastroenterology， the Third Affiliated Hospital of Sun Yatsen University， Guangzhou 510630， China

Corresponding author， Wu Bin， Email： binwu001@hotmailcom

【Abstract】ObjectiveTo investigate the effect of tumor necrosis factorα （TNFα） upon the autophagy and proliferation of liver cancer cells through endoplasmic reticulum stress signaling pathway MethodsThe expression levels of TNFα， BECN1， LC3B and PCNA in the cancerous and paracancerous tissues of patients with primary hepatocellular carcinoma， and the normal tissues adjacent to tumors of patients with hepatic hemangioma were determined by immunohistochemistry After the HepG2 was treated with recombinant human TNFα cytokine， the expression of autophagyrelated proteins of BECN1 and LC3B， and the cell proliferation marker of PCNA were quantitatively measured by Western blot After the treatment with autophagy inhibitor 3MA， the changes in the HepG2 cell viability and PCNA expression were observed following TNFα stimulation After the HepG2 cells were treated with TNFα， the expression levels of eIF2a and peIF2a related to the ER stress signaling pathway were detected by Western blot ResultsThe expression levels of TNFα， BECN1， LC3B and PCNA proteins in the cancerous and paracancerous tissues of hepatocellular carcinoma patients were significantly upregulated compared with those in the normal liver tissue Following the HepG2 cells were treated with TNFα， the expression levels of BECN1， LC3B and PCNA proteins were upregulated， and the cell viability was increased After the treatment with autophagy inhibitor 3MA， the expression of PCNA protein and cell viability were downregulated After the treatment with TNFα， the phosphorylated level of eIF2a was significantly enhanced ConclusionTNFα can induce the autophagy of liver cancer cells via the endoplasmic reticulum stress signaling pathway， thereby promoting the proliferation of liver cancer cells

【Key words】 Hepatocellular carcinoma； Tumor necrosis factorα； Autophagy；

Endoplasmic reticulum stress

原發(fā)性肝細胞癌是嚴(yán)重威脅人類生命健康的惡性腫瘤之一，盡管近年來該病的基礎(chǔ)研究和臨床研究均取得了巨大進展，但其防治效果仍不盡如人意，肝細胞癌相關(guān)分子機制仍未清楚是重要的原因之一。自噬是細胞在受到刺激后，吞噬體內(nèi)細胞質(zhì)或細胞器形成自噬體，自噬體內(nèi)的內(nèi)容物在溶酶體作用下降解、再利用的過程，可分為巨自噬、微自噬和分子伴侶介導(dǎo)的自噬[1]。近年大量研究發(fā)現(xiàn)自噬在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展、耐藥、轉(zhuǎn)移以及預(yù)后等過程中發(fā)揮著重要意義，腫瘤細胞可通過自噬抵御炎癥和藥物損傷，從而不斷異常分裂、增殖，甚至產(chǎn)生耐藥和逃逸[23]。腫瘤壞死因子α（TNFα）是一種主要由巨噬細胞和單核細胞產(chǎn)生的促炎細胞因子，具有多種生物活性。真核細胞中內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腔內(nèi)因錯誤折疊或未折疊蛋白聚集，或者鈣離子平衡紊亂可引起內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激，對于調(diào)控腫瘤細胞的生存、凋亡發(fā)揮著重要作用。研究已發(fā)現(xiàn)TNFα作為重要的炎癥因子，在肝癌細胞的發(fā)生和發(fā)展中發(fā)揮著重要的作用，但其對肝癌細胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激及自噬的作用報道較少[45]。本研究旨在觀察TNFα在肝癌細胞中對內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激、自噬及細胞增殖的作用，試圖探討可能存在的作用機制。

材料與方法

一、材料來源

收集2014年4月至12月在中山大學(xué)附屬第三醫(yī)院進行肝血管瘤或肝細胞癌手術(shù)切除標(biāo)本各10例，正常肝組織取自肝血管瘤患者距離血管瘤邊緣2 cm以上的部位組織，肝細胞癌患者配對癌旁組織選取自距離癌灶邊緣2 cm以上部位，所有組織標(biāo)本均經(jīng)蘇木素伊紅染色進行組織學(xué)確認。本研究遵循的程序符合中山大學(xué)附屬第三醫(yī)院臨床醫(yī)學(xué)研究倫理委員會所制定的倫理學(xué)標(biāo)準(zhǔn)，得到該委員會批準(zhǔn)，征得患者的知情同意并簽署知情同意書（中大附三醫(yī)倫[2014]27號）。

二、實驗試劑及儀器

1主要試劑及抗體

DMEM培養(yǎng)液（Gibco， US）、TNFα重組因子（Pepro Tech， US）、TNFα 抗體（Santa Cruz， US）、PCNA 抗體（Santa Cruz， US）、BECN1 抗體（Abcam， US）、LC3B抗體（Sigma， US）、βarrestin1抗體（Abcam， US）、GAPDH抗體（Santa Cruz， US）、eIF2α和peIF2α抗體（Cell Signaling Technology， US）、DAB顯色液（DAKO， Denmark）；CCK8試劑盒（Dojindo， Japan）。人肝癌細胞系HepG2由中山大學(xué)附屬第三醫(yī)院中心實驗室惠贈。

2主要儀器

顯微鏡（Leica ， Germany），SDSPAGE電泳槽（BIORAD， US），轉(zhuǎn)膜儀（BIORAD， US），PCR儀（Labnet， US ），Nanodrop 2000微量紫外分光光度計（Thermo Scientific， US），低溫高速冷凍離心機（Eppendorf 公司， Germany）等。

三、實驗方法

1免疫組織化學(xué)染色

人體組織標(biāo)本經(jīng)甲醛固定、乙醇梯度脫水、二甲苯透明以及浸蠟后制成石蠟切片。石蠟切片經(jīng)脫蠟和階梯水化后，置于3%雙氧水中10 min去除過氧化物酶，在pH 60的檸檬酸鈉修復(fù)液中高溫高壓修復(fù)2 min，血清封閉10 min，分別滴加一抗：抗TNFα（1∶100）、抗BECN1（1∶200）、抗LC3B（1∶200）、抗PCNA（1∶200）4℃孵育過夜；PBST浸泡5 min，二抗37℃孵育2 h，滴加DAB顯色，適時清水終止反應(yīng)，蘇木素伊紅染色后樹脂封片，顯微鏡下觀察。

2細胞培養(yǎng)及處理

接種細胞于6孔板中，用含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)，待細胞密度達80%時，將細胞分為4組。TNFα處理組：TNFα（40 ng/ml）處理細胞8 h；3MA組：3MA（10 mmol/L）處理細胞8 h；3MA+ TNFα處理組：同時用TNFα（40 ng/ml）和3MA（10 mmol/L）處理細胞8 h；空白組：加入DMEM。

3細胞總蛋白提取以及蛋白電泳

在6孔板中加入適量含有蛋白酶抑制劑的裂解液，用細胞刷輕輕刮下細胞，混勻裂解液，冰上作用30 min，BCA法測蛋白濃度，100℃加熱變性5 min后，-80℃保存。取適量蛋白進行蛋白電泳，牛奶封閉2 h，分別滴加一抗：抗BECN1（1∶2 000）、抗LC3B（1∶2 000）、抗PCNA（1∶2 000）、抗eIF2α（1∶2 000）、抗peIF2α（1∶2 000），4℃搖床孵育過夜，TBST洗滌15 min，滴加二抗常溫孵育2 h，TBST洗滌15 min，暗房壓片曝光。膠片條帶用Image J 圖像分析軟件進行灰度分析。

4細胞活性測定

將細胞接種于96孔板，每孔約1 000個細胞（200 μl/孔），每組設(shè)3個復(fù)孔，重復(fù)實驗3次。按照分組對細胞進行處理，一定時間后將培養(yǎng)基吸出，待測孔每孔加入10 μl CCK8溶液和90 μl DMEM培養(yǎng)液。在細胞培養(yǎng)箱繼續(xù)孵育3 h后，用酶標(biāo)儀測定在490 nm處的吸光值，記為該孔的細胞增殖活性。

四、統(tǒng)計學(xué)處理

應(yīng)用SPSS 200軟件進行統(tǒng)計學(xué)分析。計量資料以±s表示，2組獨立樣本間比較采用獨立樣本t檢驗，配對樣本間比較采用配對t檢驗，多組獨立樣本間比較應(yīng)用單因素方差分析法，進一步兩兩比較采用LSDt檢驗法分析，P<005為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié)果

一、 人肝癌癌灶組織、癌旁組織和正常肝組織相關(guān)蛋白分析

對3種人樣本組織進行石蠟包埋、切片、免疫組織化學(xué)染色，發(fā)現(xiàn)TNFα、自噬相關(guān)蛋白BECN1、LC3B主要在組織細胞胞漿中彌漫性表達，PCNA主要在胞核中表達，DAB染色為棕黃色陽性信號。TNFα在正常肝組織中的陽性信號少于癌旁和癌灶組織，BECN1、LC3B、PCNA蛋白在癌灶組織和癌旁組織中陽性信號明顯多于正常肝組織，見圖1。每組組織樣品各10例進行免疫組織化學(xué)染色隨機計數(shù)900個細胞，經(jīng)統(tǒng)計發(fā)現(xiàn)，TNFα在癌灶組織[（205±78）%]和癌旁組織[（243±102）%]中的表達高于正常肝組織[（34±52）%]；同樣的，自噬相關(guān)蛋白BECN1在癌灶組織[（751±83）%]和癌旁組織[（743±125）%]中的表達高于正常肝組織[（205±138）%]；LC3B在正常肝組織[（207±121）%]中表達少于癌灶組織[（806±96）%]和癌旁組織[（833±104）%]；PCNA在癌灶組織[（163±63）%]和癌旁組織[（178±94）%]中表達高于

圖1人肝癌癌灶、癌旁組織和正常肝組織中相關(guān)蛋白水平（×200）

A、B、C：正常肝組織（Normal）、癌旁組織（Paracancer）、肝癌癌灶組織（HCC）TNFα免疫組織化學(xué)染色；D、E、F：正常肝組織、癌旁組織、肝癌癌灶組織BECN1免疫組織化學(xué)染色；G、H、I：正常肝組織、癌旁組織、肝癌癌灶組織LC3B免疫組織化學(xué)染色；J、K、L：正常肝組織、癌旁組織、肝癌癌灶組織PCNA免疫組織化學(xué)染色

正常肝組織[（52±81）%]。癌灶組織與正常肝組織比較，tTNFα=862、tBECN1=743、tLC3B=628、tPCNA=881，P均<005；癌旁組織與正常肝組織比較，tTNFα=655、tBECN1=931、tLC3B=856、tPCNA=834，P均<005；癌旁組織與癌灶組織比較，tTNFα=206、tBECN1=168、tLC3B=197、tPCNA=853，PPCNA<005、PTNFα、PBECN1、PLC3B均>005。

二、 HepG2細胞相關(guān)蛋白分析及細胞活性檢測

利用TNFα刺激HepG2細胞8 h后提取蛋白，蛋白免疫印跡法分析顯示TNFα刺激組細胞中BECN1、LC3B、PCNA蛋白水平升高。相對TNFα刺激組而言，TNFα+3MA處理組中PCNA蛋白水平并未見明顯升高。利用CCK8試劑盒檢測細胞增殖活性，TNFα刺激組細胞活性較空白對照組明顯升高，然而加入自噬抑制劑3MA后細胞活性升高不明顯，見圖2。

三、HepG2細胞peIF2α/eIF2α蛋白表達情況

研究已顯示內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激會引起細胞自噬水平升高，而eIF2α蛋白磷酸化水平升高亦提示內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激增強。提取細胞蛋白，通過蛋白免疫印跡法和灰度分析檢測各分組中peIF2α及eIF2α蛋白表達量。實驗結(jié)果顯示，不論是否使用TNFα因子刺激細胞，細胞中eIF2α蛋白水平并無明顯改變。而對于未加TNFα刺激組，peIF2α表達量較低，eIF2α蛋白磷酸化水平低。在TNFα刺激下，細胞中eIF2α蛋白磷酸化水平明顯增強，peIF2α蛋白表達量升高，見圖3。

圖2不同處理條件下HepG2細胞相關(guān)蛋白檢測及細胞活性實驗

A：空白對照組和TNFα處理組中BECN1、LC3B、PCNA蛋白免疫印跡電泳圖；B：空白對照組、TNFα處理組、3MA處理組、TNFα+3MA處理組中PCNA蛋白水平；C：空白對照組（Vehicle）、TNFα處理組、3MA處理組、TNFα+3MA處理組細胞活性檢測，方差分析結(jié)果F值=821，與對照組比較， LSDtTNFα組=638，LSDt3MA組=412，LSDtTNFα+3MA組=356；與TNFα組比較，LSDtTNFα+3MA組=372；與空白對照組比較，*P<005；與TNFα處理組比較，#P<005

圖3HepG2細胞peIF2/eIF2蛋白表達情況

A：不同處理條件下HepG2細胞peIF2α/eIF2α蛋白免疫印跡電泳圖；B：peIF2α/eIF2α灰度值分析；與空白對照組（Vehicle）比較，*P<005

討論

原發(fā)性肝細胞癌的發(fā)病率和病死率均較高，其發(fā)生、發(fā)展的分子機制尚未明確是防治效果差的重要原因之一。大量研究已經(jīng)證實，在肝細胞癌的發(fā)生、發(fā)展過程中，炎癥反應(yīng)起到了重要的推動作用，長期持續(xù)的慢性炎癥刺激會促進肝細胞癌變，其中炎癥因子TNFα發(fā)揮著重要作用[67]。自噬是維持細胞正常生理代謝的重要信號通路，其作用具有雙面性，一方面自噬可以及時清除并再利用細胞內(nèi)無用的細胞成分、代謝產(chǎn)物而為細胞提供能量，維持細胞的正常功能而存活，但相反過強的自噬反應(yīng)將引起細胞損傷，導(dǎo)致細胞死亡，故也有人將其稱為凋亡與壞死外的第3種細胞“死亡”方式。相關(guān)研究顯示，腫瘤細胞在不利的細胞外環(huán)境刺激下，可以通過自噬去獲得維持生存所需的營養(yǎng)物質(zhì)，從而維持腫瘤細胞的生存、產(chǎn)生耐藥性，并促進腫瘤細胞的遠處轉(zhuǎn)移[8]。

既往研究已發(fā)現(xiàn)炎癥和自噬的發(fā)生有著密切關(guān)系，炎癥反應(yīng)可促進細胞內(nèi)自噬的發(fā)生以拮抗炎癥因子對細胞的損傷，促進細胞的損傷修復(fù)而維持細胞生存[910]。但是，炎癥因子TNFα是否可以通過自噬促進肝癌細胞的增殖卻不明確，本研究首先通過對人體肝癌樣本進行分析，發(fā)現(xiàn)在原發(fā)性肝細胞癌組織和癌旁組織中TNFα、自噬相關(guān)蛋白BENC1、LC3B以及增殖標(biāo)志物PCNA較正常肝組織均有升高，提示自噬在肝細胞癌的發(fā)生、發(fā)展過程中可能有著重要的意義，且自噬活動可能影響肝癌細胞增殖。為了進一步驗證上述觀點，我們用TNFα因子刺激HepG2肝癌細胞株，發(fā)現(xiàn)TNFα因子刺激后，HepG2細胞的自噬水平和增殖活性明顯上調(diào)，同時，利用自噬抑制劑3MA抑制HepG2細胞自噬后，和對照組比較發(fā)現(xiàn)，TNFα刺激未引起細胞增殖活性的明顯升高，提示TNFα可能通過誘導(dǎo)肝癌細胞的自噬促進其增殖。

大量研究已證實，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激與自噬有著密切的關(guān)系，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激激活并發(fā)生未折疊蛋白反應(yīng)將引起細胞內(nèi)自噬水平的上調(diào)[1112]。eIF2α作為內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激信號通路中的重要信號分子，參與了細胞凋亡、增殖以及炎癥調(diào)節(jié)，其蛋白的磷酸化水平（peIF2α）是提示內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激通路激活的標(biāo)志物之一。在本研究中，我們發(fā)現(xiàn)使用TNFα刺激肝癌細胞后，細胞中peIF2α蛋白水平明顯升高，提示TNFα誘導(dǎo)的炎癥反應(yīng)激活了HepG2細胞的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激信號通路。

綜上所述，TNFα可能通過激活內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激通路誘導(dǎo)肝癌細胞自噬而促進細胞增殖。該研究為肝癌細胞自噬的發(fā)生機制提供了新的依據(jù)，為通過調(diào)節(jié)自噬抑制肝癌的發(fā)生、發(fā)展提供科學(xué)依據(jù)。

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（收稿日期：20170506）

（本文編輯：楊江瑜）