華金雙，邵伯雍，傅 文

(1.河南中醫(yī)藥大學(xué)針灸推拿學(xué)院，河南 鄭州 450046； 2.河南中醫(yī)藥大學(xué)，河南 鄭州 450046)

·實(shí)驗(yàn)研究·

逆針灸對慢性疲勞大鼠行為學(xué)及IL-1β、IL-6的影響*

華金雙1，邵伯雍2，傅 文2

(1.河南中醫(yī)藥大學(xué)針灸推拿學(xué)院，河南 鄭州 450046； 2.河南中醫(yī)藥大學(xué)，河南 鄭州 450046)

目的：探討逆針灸對慢性疲勞大鼠IL-1β、IL-6的影響。方法：將40只SD大鼠隨機(jī)分為正常對照組、模型對照組、逆針灸1組、逆針灸2組,每組10只。模型對照組先平行飼養(yǎng)，然后通過多因素刺激相結(jié)合的辦法，制備慢性疲勞大鼠模型，共44 d。逆針灸1組、逆針灸2組在制備模型前依次先給予大鼠電針刺激10 d、20 d，然后再制備慢性疲勞大鼠模型。正常對照組不予任何處理，平行飼養(yǎng)。觀察大鼠力竭游泳時(shí)間，采用酶聯(lián)免疫法檢測各組大鼠血清 IL-1β、IL-6含量。結(jié)果：與正常對照組對比，模型對照組、逆針灸1組、逆針灸2組大鼠力竭游泳時(shí)間明顯縮短，血清IL-1β、IL-6含量明顯增加，差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05或P<0.01)。與模型對照組對比，逆針灸1組、逆針灸2組大鼠力竭游泳時(shí)間明顯延長，血清IL-1β、IL-6含量明顯降低，差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。逆針灸1組和逆針灸2組造模后力竭游泳時(shí)間、IL-6含量對比，差別無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，但血清IL-1β含量對比差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。結(jié)論：早期逆針灸干預(yù)能抑制慢性疲勞大鼠細(xì)胞因子的釋放，調(diào)節(jié)紊亂的免疫功能，發(fā)揮抗疲勞作用，對慢性疲勞大鼠具有一定的防治作用。

慢性疲勞綜合征/針灸療法；逆針灸；IL-1β；IL-6；動物模型；大鼠

慢性疲勞綜合征(chronic fatigue syndrome，CFS)指以慢性疲勞持續(xù)或反復(fù)發(fā)作6個(gè)月以上為主要表現(xiàn)，同時(shí)伴有低熱、頭痛、咽喉痛、肌痛、神經(jīng)精神癥狀等非特異性癥狀的一組癥候群，臨床檢查多無明顯器質(zhì)性改變。[1]CFS的發(fā)病機(jī)制比較復(fù)雜，目前比較認(rèn)同的觀點(diǎn)是應(yīng)激狀態(tài)下引起的神經(jīng)-內(nèi)分泌系統(tǒng)改變，除了下丘腦-垂體-腎上腺軸外，免疫系統(tǒng)中的細(xì)胞炎癥因子也參與了應(yīng)激反應(yīng)，這些細(xì)胞因子可以影響神經(jīng)-內(nèi)分泌系統(tǒng)，共同完成應(yīng)激反應(yīng)。Pall等[2]認(rèn)為細(xì)胞因子改變所致的表現(xiàn)與CFS患者的臨床癥狀有相似之處,故認(rèn)為細(xì)胞因子與CFS的病理有重要的聯(lián)系。根據(jù)美國疾病控制中心1994年制訂的慢性疲勞綜合征的診斷標(biāo)準(zhǔn)，本病在明確診斷前至少有6個(gè)月的潛伏時(shí)間。對于尚處于萌芽階段的疾病，若能積極采取預(yù)防措施，可能會延緩或防止病情的進(jìn)一步發(fā)展，促使疾病早期治愈。針灸是重要的治未病手段，能激發(fā)經(jīng)絡(luò)之氣，扶助正氣，提高機(jī)體抵御各種致病因子的能力，從而達(dá)到防止疾病的發(fā)生、減輕隨后疾病的損害的目的，是一種更加注重機(jī)體自身潛能激發(fā)與利用的方法[3]。本實(shí)驗(yàn)擬對慢性疲勞大鼠進(jìn)行超早期的針灸干預(yù)，初步揭示逆針灸對慢性疲勞大鼠細(xì)胞因子的影響，為慢性疲勞綜合征的超早期防治提供實(shí)驗(yàn)及理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 動 物

雄性SD大鼠，體質(zhì)量為(180±20)g，清潔級，由濟(jì)南朋悅實(shí)驗(yàn)動物繁育有限公司提供。除實(shí)驗(yàn)期間的特殊要求外，其余時(shí)間動物均飼養(yǎng)于溫度(18～25 ℃)、濕度(55%±2%)相對恒定的動物飼養(yǎng)室，可以自由進(jìn)食和飲水。

1.2 儀 器

華佗牌一次性針灸針，蘇州醫(yī)療用品有限公司產(chǎn)品，規(guī)格：直徑0.30 mm，長度25 mm。佳健CMNS6-Ⅰ型電子針灸治療儀，無錫佳健醫(yī)療器械股份有限公司產(chǎn)品。

1.3 動物分組

適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后，將40只大鼠隨機(jī)分為正常對照組、模型對照組、逆針灸1組和逆針灸2組，每組10只。

1.4 造模方法

模型對照組和預(yù)處理后的逆針灸組采用多因素刺激方法制備慢性疲勞大鼠模型。①冷水游泳：大鼠游泳桶寬40 cm，高50 cm。大鼠游泳時(shí)水深40 cm，水溫21 ℃左右，每次游泳30 min。②束縛法：束縛大鼠四肢，每次3 h。③晝夜顛倒1次。第1個(gè)2 4 h，無措施。第2個(gè)24 h，早8:30用晝夜顛倒鼠籠罩罩住鼠籠，模擬夜晚；晚8:30給予日光燈持續(xù)照明，模擬白晝。每次隨機(jī)安排1種，使動物不能預(yù)料刺激的發(fā)生，以避免產(chǎn)生適應(yīng)性。共21 d。

1.5 針刺方法

逆針灸2組：先給予大鼠電針刺激20 d，再制備慢性疲勞大鼠模型。穴位選取百會、足三里、三陰交、太沖。頭部穴位平刺進(jìn)針，四肢穴位直刺進(jìn)針，用30號1寸毫針，深度0.5～1 cm，電針頻率2 Hz，電流強(qiáng)度0.6 mA，以大鼠頭部微顫為宜。每次20 min。5 d為1個(gè)療程，中間休息1 d，共4個(gè)療程。

逆針灸1組：大鼠先平行飼養(yǎng)，再給予電針刺激10 d，然后制備慢性疲勞大鼠模型。針灸操作同逆針灸2組。

模型對照組和正常對照組同逆針灸組平行飼養(yǎng)，不做任何處理。

1.6 檢測指標(biāo)

1.6.1 體質(zhì)量

每周稱量動物的體質(zhì)量，對比實(shí)驗(yàn)第1天和最后1天動物的體質(zhì)量。

1.6.2 力竭游泳實(shí)驗(yàn)

分別于實(shí)驗(yàn)第1天和最后1天進(jìn)行。將各組大鼠分別放入游泳桶(寬40 cm，高50 cm)中，水位稍低于水桶深度，水溫(20±1) ℃，記錄其從入水到力竭(以頭部沉入水中10 s不能浮出水面為力竭標(biāo)準(zhǔn))的時(shí)間。

1.6.3 血清IL-1β、IL-6含量

實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，稱量大鼠體質(zhì)量并記錄，根據(jù)體質(zhì)量以3 μL/g 選用100 g/L水合氯醛對大鼠進(jìn)行腹腔麻醉。將麻醉后的大鼠仰臥位平鋪于操作臺上，用手術(shù)刀切開腹部，暴露下腔腹主動脈，用注射器抽取5 mL血液，迅速注入試管中，靜置2 h后，3 000 r/min離心10 min。取上清液血清，注入一次性EP管中，做好標(biāo)記,放入-70 ℃冰箱中保存待檢。采用酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)測定血清IL-1β、IL-6含量，操作步驟如下：①在酶標(biāo)包被板上分別設(shè)空白孔、標(biāo)準(zhǔn)品孔、待測樣品孔?？瞻讓φ湛咨喜患訕悠泛兔笜?biāo)試劑。標(biāo)準(zhǔn)品孔中加入稀釋好的標(biāo)準(zhǔn)品50 μL；待測樣品孔中先加樣品10 μL，再加待測樣品稀釋液40 μL。②標(biāo)準(zhǔn)品孔和樣本孔中每孔加入辣根過氧化物酶(HRP)標(biāo)記的檢測抗體100 μL，用封板膜封住反應(yīng)孔，37 ℃水浴鍋或恒溫箱溫育60 min。③棄去液體，吸水紙上拍干，每孔加滿洗滌液，靜置1 min，甩去洗滌液，吸水紙上拍干，如此重復(fù)洗板5次。④每孔加入顯色劑 A、B 各50 μL，振蕩混勻，37 ℃避光孵育15 min。⑤取出酶標(biāo)板，加入 50 μL 終止液，終止反應(yīng)。⑥迅速使用酶標(biāo)儀在 450 nm 波長下測量各孔的吸光度值(OD 值)。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié) 果

逆針灸1組、逆針灸2組的大鼠各死亡1只。

2.1 各組大鼠體質(zhì)量對比

實(shí)驗(yàn)前：各組大鼠的進(jìn)食量、飲水量、體質(zhì)量、活動等情況無明顯差異，說明各組基線情況一致，具有可比性。實(shí)驗(yàn)期間：正常對照組大鼠的進(jìn)食量、體質(zhì)量均持續(xù)增長，活動良好。模型對照組、逆針灸1組、逆針灸2組大鼠體質(zhì)量明顯下降，與正常對照組對比，差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。逆針灸1組大鼠體質(zhì)量下降明顯，與模型對照組對比，差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。逆針灸1組、逆針灸2組大鼠體質(zhì)量比較，差別無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見表1。

組 別動物數(shù)第1天第44天正常對照組10232.20±13.63327.50±19.67模型對照組10241.70±11.16290.40±33.25***逆針灸1組9234.00±6.25255.33±23.77***##逆針灸2組9240.33±15.44267.33±21.43***△

注：與正常對照組對比，***P<0.01;與模型對照組對比，##P<0.05;與逆針灸1組對比，△P>0.05。

2.2 各組大鼠力竭游泳時(shí)間對比

實(shí)驗(yàn)前各組大鼠力竭游泳時(shí)間對比，差別無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。實(shí)驗(yàn)后：與正常對照組對比，模型對照組、逆針灸1組、逆針灸2組大鼠力竭游泳時(shí)間明顯縮短，差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。與模型對照組對比，逆針灸1組、逆針灸2組大鼠力竭游泳時(shí)間明顯延長，差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。逆針灸1組和2組力竭游泳時(shí)間對比，差別無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見表2。

表2 各組大鼠力竭游泳時(shí)間對比±s

注：與正常對照組對比，**P<0.05；與模型對照組對比，###P<0.01;與逆針灸1組對比，△P>0.05。

2.3 各組大鼠血清IL-1β、IL-6含量對比

與正常對照組對比，模型對照組、逆針灸1組、逆針灸2組大鼠血清IL-1β、IL-6含量明顯增加，差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。與模型對照組對比，逆針灸1組、逆針灸2組大鼠血清IL-1β、IL-6含量明顯降低，差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。逆針灸1組、逆針灸2組血清IL-1β對比，差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，但兩組間IL-6含量對比，差別無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見表3。

組 別動物數(shù)IL-1βIL-6正常對照組1015.89±2.2751.86±6.16模型對照組1036.80±4.39***109.70±9.38***逆針灸1組923.63±1.75***###71.86±4.70***###逆針灸2組927.10±1.51***###ΔΔΔ79.65±5.19***###Δ

注：與正常對照組對比，***P<0.01；與模型對照組對比，###P<0.01；與逆針灸1組對比，ΔP>0.05,ΔΔΔP<0.01 。

3 討 論

研究表明：慢性疲勞綜合征患者存在免疫功能異常，其中細(xì)胞因子與CFS癥狀的出現(xiàn)關(guān)系密切，認(rèn)為慢性免疫激活狀態(tài)可導(dǎo)致細(xì)胞因子的釋放增多，從而擾亂神經(jīng)遞質(zhì)的功能，導(dǎo)致CFS的一系列征狀出現(xiàn)[4]。IL-1β和IL-6是其中最重要的細(xì)胞因子，在神經(jīng)-內(nèi)分泌-免疫系統(tǒng)應(yīng)激反應(yīng)的雙向調(diào)節(jié)中具有重要作用。IL-1β在應(yīng)激反應(yīng)中一方面調(diào)節(jié)下丘腦中促腎上腺皮質(zhì)激素釋放激素的分泌，從而影響垂體分泌促腎上腺皮質(zhì)激素；另一方面可以直接作用于垂體，促使其分泌促腎上腺皮質(zhì)激素。反之糖皮質(zhì)激素亦能反向控制IL-1β的分泌[5]。有報(bào)道認(rèn)為：大鼠大強(qiáng)度運(yùn)動加心理應(yīng)激后IL-1β水平呈持續(xù)升高趨勢，提示應(yīng)激后機(jī)體免疫調(diào)節(jié)功能下降[6]。IL-6被認(rèn)為是疲勞誘導(dǎo)細(xì)胞因子。體外實(shí)驗(yàn)[7]發(fā)現(xiàn)：在運(yùn)動過程中IL-6分泌增加，如給予 hrIL-6可使健康者的疲勞感增加，相反若給予抗 IL-6 受體的抗體則慢性疲勞癥狀減弱，提示 IL-6參與了CFS發(fā)生發(fā)展的過程，影響人體的情緒反應(yīng)，使人變得淡漠、抑郁、焦慮等，出現(xiàn)不良的心理情緒反應(yīng)。研究發(fā)現(xiàn)：IL-6在應(yīng)激反應(yīng)中不僅通過剌激淋巴細(xì)胞分化，促進(jìn)急性期的應(yīng)激反應(yīng)；還可以促進(jìn)促腎上腺皮質(zhì)激素釋放激素的分泌，進(jìn)而影響腎上腺皮質(zhì)激素的分泌[5]。大量實(shí)驗(yàn)研究表明:針灸對慢性疲勞大鼠細(xì)胞因子有良性調(diào)節(jié)作用[8-10]，提示針灸可能通過影響細(xì)胞因子，提高免疫力，從而達(dá)到治療CFS的目的。

逆針灸首見于明代高武的《針灸聚英》[11]，其載：“無病而先針灸曰逆。逆,未至而迎之也?！?指在機(jī)體健康無病、疾病即將發(fā)生之前或疾病輕淺之時(shí)預(yù)先應(yīng)用針灸方法激發(fā)經(jīng)絡(luò)之氣，提高正氣，平衡陰陽，防止疾病發(fā)生，以減輕疾病損害的程度。研究[12-13]發(fā)現(xiàn)：對未病機(jī)體預(yù)先給予針灸刺激，正是激發(fā)機(jī)體產(chǎn)生良性應(yīng)激的有效手段，可以啟動機(jī)體內(nèi)源性保護(hù)機(jī)制，對機(jī)體進(jìn)行調(diào)整，減輕或抵抗隨后疾病的損害，提高機(jī)體的抵抗與應(yīng)變能力，說明逆針灸確實(shí)對機(jī)體具有預(yù)防保護(hù)作用?；卺樉膶FS的良好的調(diào)節(jié)作用，本實(shí)驗(yàn)提出了在CFS的萌芽階段，給予逆針灸干預(yù)，探討逆針灸對慢性疲勞大鼠可能的作用機(jī)制，為CFS超早期防治提供實(shí)驗(yàn)及理論依據(jù)。

本研究結(jié)果顯示：模型對照組大鼠造模后力竭游泳時(shí)間明顯縮短，逆針灸1組、逆針灸2組大鼠造模后力竭游泳時(shí)間比模型對照組明顯延長，說明經(jīng)過21 d的多因素應(yīng)激刺激后，各組大鼠均有軀體和心理疲勞，但早期的逆針灸干預(yù)能明顯減輕大鼠疲勞絕望狀態(tài)，對其具有良性的調(diào)整作用。本研究結(jié)果還顯示：模型對照組大鼠血清IL-1β、IL-6明顯增加(P<0.01)，提示IL-1β、IL-6參與了慢性應(yīng)激反應(yīng)，長期慢性應(yīng)激導(dǎo)致大鼠免疫功能發(fā)生紊亂，細(xì)胞因子釋放明顯增多；逆針灸1組、逆針灸2組與模型對照組對比，血清IL-1β、IL-6顯著降低(P<0.01)，提示逆針灸作為一種良性應(yīng)激的有效手段，能調(diào)節(jié)大鼠紊亂的免疫功能，抑制細(xì)胞因子的釋放，減輕慢性疲勞大鼠細(xì)胞免疫功能的損害，從而發(fā)揮防治作用，這可能是逆針灸干預(yù)慢性疲勞綜合征的機(jī)制之一。

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(編輯 陶 珠)

1001-6910(2017)04-0073-04

R245.3

B

10.3969/j.issn.1001-6910.2017.04.31

華金雙(1974-)，女(漢族)，黑龍江大慶人，副教授，博士，研究方向：針灸防治神經(jīng)系統(tǒng)疾病的基礎(chǔ)研究。

河南省高等學(xué)校重點(diǎn)科研項(xiàng)目(15A360023)；國家中醫(yī)藥管理局河南邵氏針灸流派傳承工作室建設(shè)項(xiàng)目(國中醫(yī)藥人教函〔2012〕228號)

2017-01-19；

2017-03-02