馬升俊，鄭利平，楊蘭，朱旭

(南寧市第二人民醫(yī)院，南寧 530031)

廣西壯族代謝綜合征患者血清脂聯(lián)素水平及其基因多態(tài)性分析

馬升俊，鄭利平，楊蘭，朱旭

(南寧市第二人民醫(yī)院，南寧 530031)

目的 觀察廣西壯族代謝綜合征(MS)患者血清脂聯(lián)素(APN)水平及其基因多態(tài)性。方法 將100例廣西壯族MS患者作為觀察組，100例廣西壯族健康者作為對照組，采用酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)檢測兩組血清APN，采用聚合酶鏈反應(yīng)-限制性片段長度多態(tài)性技術(shù)觀察兩組APN基因位點(diǎn)+45 T/G、+276 G/T的多態(tài)性。結(jié)果 觀察組、對照組血清APN水平分別為(79.67±7.91)、(104.42±10.67)mg/L，兩組相比P<0.05。觀察組APN+45位點(diǎn)TT、TG、GG基因型分別為16、38、46例，對照組分別為20、59、21例，兩組GG基因型比例比較P<0.01。觀察組ANP+276位點(diǎn)GG、GT、TT基因型分別為61、30、9例，對照組分別為91、8、1例，兩組GT、TT基因型比例比較P均<0.01。觀察組APN+45位點(diǎn)TT、TG、GG基因型患者血清APN水平分別為(81.49±9.42)、(76.17±8.29)、(75.68±8.91)mg/L，TT與TG、GG基因型相比P均<0.05。觀察組APN+276位點(diǎn)GG、GT、TT基因型患者血清APN水平分別為(80.73±9.58)、(75.49±8.83)、(75.21±8.39)mg/L，GG與GT、TT基因型相比P均<0.05。結(jié)論 廣西壯族MS患者血清APN水平低；APN+45 G等位基因、APN+276 T等位基因可能是廣西壯族MS患者的易感基因。

代謝綜合征；脂聯(lián)素；基因多態(tài)性；廣西壯族

代謝綜合征(MS)是多種代謝成分異常聚集的一種病理狀態(tài)，是一組以腹型肥胖、脂代謝紊亂、糖耐量減低及血壓升高為特征的臨床綜合征。大量流行病學(xué)資料表明，MS與心血管疾病和糖尿病的發(fā)病率密切相關(guān)，已成為嚴(yán)重的公共衛(wèi)生問題[1]。脂聯(lián)素(APN)是由脂肪細(xì)胞特異性分泌的活性因子，具有抗炎、抗動脈粥樣硬化、抗血小板聚集等生物學(xué)作用[2]。近年來基因掃描發(fā)現(xiàn)APN所在基因區(qū)域與2型糖尿病和MS有關(guān)，且基因多態(tài)性具有地區(qū)、種族特異性[3]。本研究觀察了廣西壯族MS患者血清APN水平，并分析其基因多態(tài)性?，F(xiàn)將結(jié)果報告如下。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 將2013年2～10月在廣西馬山縣人民醫(yī)院和南寧市第二人民醫(yī)院就診的100例壯族MS患者作為觀察組，其中男52例、女48例，年齡46～75歲、平均53.1歲。另選擇壯族健康者100例作為對照組，其中男55例、女45例，年齡50～71歲、平均53.9歲。所有研究對象均來自廣西地區(qū)，三代中未有與外族通婚的壯族家族，且均為第三代；無遺傳性疾病家族史及其他相關(guān)疾病如肝炎、腎病綜合征、腎功能不全等急、慢性疾病史。MS診斷標(biāo)準(zhǔn)參照《中國成人血脂異常防治指南》[4]。觀察組與對照組年齡、性別具有可比性。觀察組、對照組BMI分別為(26.35±2.62)、(22.18±2.32)kg/m2，F(xiàn)PG分別為(5.67±2.01)、(4.38±0.68)mmol/L，收縮壓分別為(137.5±16.5)、(114.5±15.7)mmHg，舒張壓分別為(82.4±12.5)、(72.1±8.2)mmHg，TG分別為(2.85±0.61)、(1.13±0.52)mmol/L，TC分別為(5.51±1.69)、(4.27±1.12)mmol/L，LDL-C分別為(3.32±1.51)、(1.79±0.89)mmol/L，HDL-C分別為(1.29±0.42)、(1.62±0.54)mmol/L，兩組相比P均<0.05。所有研究對象知情同意，彼此無血緣關(guān)系。本研究經(jīng)馬山縣人民醫(yī)院和南寧市第二人民醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會批準(zhǔn)。

1.2 血清APN檢測 使用真空負(fù)壓采血技術(shù)，分別采集兩組空腹靜脈血3 mL于干燥試管中，靜置30 min后，低速(3 000 r/min)離心10 min分離血清。使用RT-6000酶標(biāo)儀(深圳雷杜公司)采用酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)檢測兩組血清APN，嚴(yán)格按照說明書進(jìn)行操作。

1.3 APN基因多態(tài)性觀察 采用聚合酶鏈反應(yīng)-限制性片段長度多態(tài)性技術(shù)。采集2 mL靜脈血于EDTA-K2抗凝管中，充分混勻后，取200 μL抗凝全血，使用DNA抽提試劑(北京天根生化科技有限公司)，按照試劑盒說明書提取DNA，用微量紫外分光光度儀(美國賽默飛世爾公司)檢查DNA的純度和濃度，取吸光度(A260 nm/A280 nm)值為1.8～2.0的樣本置-20 ℃冰箱保存。根據(jù)GenBank中APN基因的序列號(224589815)，用Primer Premier 5.0軟件設(shè)計引物。APN+45和APN+276兩個基因位點(diǎn)的上游引物序列分別為5′-CTTGGTGAGGAAAGGAGAC-3′，下游引物序列分別為5′-GAGGAATCAGAATATGAATG-3′，退火溫度為55 ℃，產(chǎn)物片段大小為745 bp。用ABI-9700擴(kuò)增儀(美國ABI公司)進(jìn)行擴(kuò)增，PCR總反應(yīng)體系包括PCR混合反應(yīng)液8 μL(含2 mmol/L dNTP 3 μL、PCR緩沖液5 μL)、5 U/μL Taq酶 0.5 μL、無菌水37.5 μL、DNA模版2 μL和10 pmol/L的上、下游引物各1 μL，共50 μL。經(jīng)過94 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃ 1 min，55 ℃ 45 s，72 ℃ 1 min，共35個循環(huán)；最后72 ℃延伸7 min。取PCR擴(kuò)展產(chǎn)物20 μL、限制性內(nèi)切酶1 μL，酶切緩沖液3 μL，無菌水6 μL，37 ℃酶切1 h。酶切后產(chǎn)物5 μL在2%瓊脂糖凝膠上點(diǎn)樣，經(jīng)電泳儀(北京六一儀器廠)用電壓100 V，電泳30 min后，在凝膠圖像分析儀(珠海黑馬生物公司)下觀察電泳結(jié)果并攝像保存。APN+45位點(diǎn)的PCR產(chǎn)物經(jīng)BspHⅠ 內(nèi)切酶酶切電泳后，GG基因型為745 bp單片段，GT基因型為745、291、454 bp的3個片段，TT基因型為291、454 bp的2個片段。APN+276位點(diǎn)的PCR產(chǎn)物經(jīng)BsmⅠ內(nèi)切酶酶切電泳后，TT基因型為745 bp單片段，TG基因型為745、225、520 bp的3個片段，GG基因型為225、520 bp的2個片段。

2 結(jié)果

2.1 兩組血清APN水平比較 觀察組、對照組血清APN水平分別為(79.67±7.91)、(104.42±10.67)mg/L，兩組相比P<0.05。

2.2 兩組APN+45、+276基因位點(diǎn)多態(tài)性比較 兩組APN+45和APN+276基因多態(tài)性經(jīng)H-W平衡檢驗(yàn)，P均>0.05。兩組APN+45、+276基因位點(diǎn)多態(tài)性比較見表1。

表1 兩組APN+45、+276基因位點(diǎn)多態(tài)性比較

注：與對照組相比，*P<0.01。

2.3 觀察組APN+45、+276位點(diǎn)不同基因型血清APN水平比較 觀察組APN+45位點(diǎn)TT、TG、GG基因型患者血清APN水平分別為(81.49±9.42)、(76.17±8.29)、(75.68±8.91)mg/L，TT與TG、GG基因型相比P均<0.05。觀察組APN+276位點(diǎn)GG、GT、TT基因型患者血清APN水平分別為(80.73±9.58)、(75.49±8.83)、(75.21±8.39)mg/L，GG與GT、TT基因型相比P均<0.05。

3 討論

MS是一組以中心肥胖、脂代謝紊亂、胰島素抵抗為特征的臨床綜合征。隨著社會經(jīng)濟(jì)和生活方式的改變，MS的患病率逐年上升，據(jù)統(tǒng)計中國MS患病率為14%～18%，在糖尿病患者為60%～80%[5]。MS的危害極大，其發(fā)生心血管疾病的概率為正常人的2倍[6]。因此，早期發(fā)現(xiàn)及預(yù)防MS非常重要。APN是脂肪細(xì)胞因子家族成員中一種重要的特異蛋白質(zhì)，有多種生物學(xué)功能，如增加胰島素的敏感性、降低血糖和甘油三酯、調(diào)節(jié)血管活性物質(zhì)的生成、參與免疫反應(yīng)、抑制動脈粥樣硬化的形成等。目前認(rèn)為APN水平下降是導(dǎo)致MS的一種新的發(fā)病因素[7]。本研究發(fā)現(xiàn)，觀察組血清APN水平較對照組降低，這與之前研究[8,9]結(jié)果相似，證實(shí)了血清中低APN水平可能與MS的發(fā)生密切相關(guān)，APN是拮抗MS發(fā)生發(fā)展的重要因素。

APN基因位于人染色體3q27區(qū)域，該區(qū)域有3個外顯子和2個內(nèi)含子，具有豐富的多態(tài)性[10]。此區(qū)域也是2型糖尿病、MS、冠心病的易感基因區(qū)域[11～13]。但APN基因多態(tài)性存在種族和地區(qū)差異，以致國內(nèi)外研究結(jié)果不一致，甚至對同一種族不同地區(qū)人群的研究也會有相互矛盾的結(jié)果產(chǎn)生[14]。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，觀察組APN+45位點(diǎn)的GG基因型頻率較對照組高，且G等位基因在壯族MS患者中較多見，說明APN+45 G基因可能是廣西壯族MS患者的易感基因。進(jìn)一步分析APN+45位點(diǎn)的多態(tài)性與血清APN水平相關(guān)性時發(fā)現(xiàn)，攜帶G等位基因的患者血清APN水平低，提示攜帶APN+45 G等位基因的個體所致的低水平APN可能是MS的一個危險因素，這與國內(nèi)外有關(guān)研究[8,15]相似。目前關(guān)于APN內(nèi)含子3第276位點(diǎn)G/T變異的研究結(jié)果不一致，部分研究[16]表明APN+276位點(diǎn)G/T變異與肥胖個體的低APN水平相關(guān)，而另一些研究[15]表明該變異位點(diǎn)與MS不相關(guān)。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，觀察組APN+276的GT、TT基因型頻率高于對照組，攜帶T等位基因的患者血清APN水平低，提示APN+276 T等位基因可能是廣西壯族MS患者的易感基因。

綜上所述，廣西壯族MS患者血清APN水平低；APN+45位點(diǎn)攜帶G等位基因患者血清APN水平低，APN+276位點(diǎn)攜帶T等位基因患者血清APN水平低。APN+45 G等位基因、APN+276 T等位基因可能是廣西壯族MS患者的易感基因。

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廣西壯放自治區(qū)南寧市科學(xué)研究與技術(shù)開發(fā)計劃項(xiàng)目(20123135)。

鄭利平(E-mail: lipingzheng88@163.com)

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