李桂霞，李 欣，李 錚，王 穎，朱 杰*，張德權(quán),*

（1.西北農(nóng)林科技大學(xué)理學(xué)院，生物物理研究所生物力學(xué)與工程研究室，陜西 楊凌 712100；2.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品加工研究所，農(nóng)業(yè)部農(nóng)產(chǎn)品加工重點實驗室，北京 100193）

宰后僵直及成熟過程中羊背最長肌理化性質(zhì)的變化

李桂霞1,2，李 欣2，李 錚2，王 穎1,2，朱 杰1,*，張德權(quán)2,*

（1.西北農(nóng)林科技大學(xué)理學(xué)院，生物物理研究所生物力學(xué)與工程研究室，陜西 楊凌 712100；2.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品加工研究所，農(nóng)業(yè)部農(nóng)產(chǎn)品加工重點實驗室，北京 100193）

動物宰后從肌肉到肉品經(jīng)過僵直、成熟等一系列復(fù)雜的生理生化反應(yīng)。僵直及成熟過程的研究可為肉品質(zhì)改善及肉制品加工提供理論依據(jù)。選取雜交公羊（小尾寒羊×北京本地羊）雙側(cè)背最長肌在4 ℃成熟0.5、2.0、6.0、12.0、24.0、48.0、72.0、120.0、168.0 h，測定不同時間的pH值、剪切力、肌節(jié)長度、ATP含量、肌原纖維小片化指數(shù)（myofibril fragmentation index，MFI）、鈣蛋白酶活力。結(jié)果表明：宰后成熟過程中，pH值先下降后逐漸趨于穩(wěn)定，從第24小時后變化不顯著（P＞0.05）；剪切力先上升后下降，在第24小時達到最大值；肌節(jié)長度在宰后先縮短后逐漸變長，且在第48小時縮至最短；ATP含量先上升后下降，48 h后趨于穩(wěn)定；μ-鈣蛋白酶80 kD大亞基在宰后24 h基本降解完全，其降解的78 kD大亞基在第48小時降解完全；肌間線蛋白和肌鈣蛋白T作為μ-鈣蛋白酶的降解底物，在成熟過程中發(fā)生降解，第168小時幾乎觀察不到完整的蛋白條帶；隨著宰后時間的延長，羊背最長肌從第2小時開始僵直，到第24小時程度達到最大，從第48小時開始解僵，解僵后肉的嫩度逐漸改善。

羊背最長?。唤┲?；嫩度；成熟

僵直是宰后肌肉必經(jīng)階段，是體內(nèi)能量消耗的體現(xiàn)。解僵過程對肉嫩度的改善有很大影響，所以對僵直及成熟進程的研究可為肉品質(zhì)改善及肉制品加工提供理論依據(jù)。僵直進程受許多因素影響，主要包括年齡、性別、膠原蛋白含量、糖酵解速率、肌肉收縮和肌纖維蛋白降解等。因此，宰后肌肉所發(fā)生的各種反應(yīng)與活體肌肉完全處于不同狀態(tài)、進行著不同性質(zhì)的反應(yīng)，研究這些特性對于了解宰后不同僵直階段以及成熟過程中肉的性質(zhì)變化，改善肉的品質(zhì)以及指導(dǎo)肉制品加工有著重要意義。

畜禽屠宰后由于血液循環(huán)和呼吸終止，而細胞仍然進行著代謝活動，細胞內(nèi)很快變成無氧狀態(tài)，肌肉開始僵直。僵直是肌肉轉(zhuǎn)變?yōu)槿馄愤^程中發(fā)生的最顯著變化[1]。僵直過程主要分為3 個階段，即僵直遲滯期、僵直急速形成期和僵直后期[2-3]。畜禽宰后早期發(fā)生僵直，肉的硬度逐漸增加、嫩度變差，在僵直結(jié)束時嫩度最小，而在隨后的解僵成熟過程中肉的嫩度逐漸得到改善。大量研究表明，在宰后成熟過程中，Ca2+的釋放、肌動球蛋白解離、肌原纖維蛋白降解以及蛋白酶水解活性對肉的嫩度起到積極的作用[2-6]。張麗等[7]在研究牦牛肉品質(zhì)時，提出延長成熟期來提高肉的嫩度。Wu Gaojie等[8]發(fā)現(xiàn)肌原纖維蛋白的快速降解是肉嫩度改善的關(guān)鍵因素。賈小翠等[9]研究發(fā)現(xiàn)，禁食組以僵直后的肉加工的雞肉腸質(zhì)構(gòu)特性劣于以僵直和僵直前的肉加工的雞肉腸，僵直前制成的雞肉腸表現(xiàn)出較高的持水力和較好的彈性、黏聚性和膠黏性，硬度和咀嚼性稍高，但總體上未禁食組僵直前制成的肉糜制品加工特性較好，表明不同僵直階段肉的加工特性存在差異。因此，了解肉品在宰后不同僵直階段和成熟過程的特性對于肉品質(zhì)改善和肉制品加工有指導(dǎo)意義。

本研究采用雜交公羊（小尾寒羊×北京本地羊）的背最長肌為原料，分析了宰后不同時間pH值、ATP含量、肌節(jié)長度、剪切力、肌原纖維小片化指數(shù)（myofibril fragmentation index，MFI）、鈣蛋白酶活性以及肌間線蛋白和肌鈣蛋白T的降解程度，明確了宰后羊肉在不同時間的僵直程度以及成熟過程，可為預(yù)測和控制宰后肌肉嫩化的速度和程度提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

選用12 月齡、胴體質(zhì)量25 kg左右的6 只雜交公羊（小尾寒羊×北京本地羊），未去勢，清真屠宰放血開始計時，宰后0.5 h后迅速取出兩側(cè)的背最長肌，裝入標記好的自封袋，置于冰盒中并在2 h內(nèi)運回實驗室，將樣品取出用保鮮膜包裝于4 ℃保藏。

蛋白酶抑制劑 瑞士Roche公司；蛋白濃度測定試劑盒 美國Pierce公司；肌間線蛋白單克隆抗體（D1033）、二抗（辣根過氧化酶標記的羊抗鼠免疫球蛋白G）、三羥甲基氨基甲烷（tris base，Tris）、十二烷基硫酸鈉（sodium dodecyl sulfate，SDS）、丙烯酰胺、甲叉雙丙烯酰胺、過硫酸銨、四甲基乙二胺（tetramethylethylenediamine，TEMED） 美國Sigma公司；ATP含量測試盒 南京建成生物工程研究所；肌鈣蛋白T單克隆抗體（ab130003） 英國Abcam公司；乙醇、乙酸等（均為分析純） 北京化學(xué)試劑公司。

1.2 儀器與設(shè)備

205便攜式pH計 德國德圖公司；TA-XT2i質(zhì)構(gòu)儀英國Stable Micro Systems公司；Ultra Turrax Disperser S25分散器 德國IKA公司；Neofuge高效冷凍離心機上海力申科學(xué)儀器有限公司；UV-1800紫外-可見分光光度計 島津儀器（蘇州）有限公司；ML204/02電子天平 梅特勒-托利多（上海）有限公司；Chameleon V多功能酶標儀 芬蘭Hidex公司；電泳設(shè)備（Mini-PROTEAN Tetra System）、全自動半干轉(zhuǎn)印儀（Trans-Blot Turbo System） 美國Bio-Rad公司；Typhoon Trio多功能激光成像系統(tǒng) 美國GE公司；HH-4數(shù)顯恒溫水浴鍋 江蘇省金壇市榮華儀器制造有限公司；MJ-Ⅱ霉菌培養(yǎng)箱 上海一恒科技有限公司。

1.3 方法

1.3.1 樣品處理

羊背最長肌于宰后0.5、2.0、6.0、12.0、24.0、48.0、72.0、120.0、168.0 h測定pH值；于2.0、12.0、24.0、48.0、72.0、120.0 h測定剪切力；并在各時間點取2 mm×2 mm×5 mm的細條置于戊二醛中，一部分用于測定肌節(jié)長度，另一部分液氮速凍，于-80 ℃貯藏備用以測定ATP含量、MFI、μ-鈣蛋白酶活力和肌原纖維蛋白的變化。

1.3.2 pH值測定

采用便攜式pH計插入肌肉2 cm深處，避開脂肪和筋膜。連續(xù)測定3 次，結(jié)果取平均值。

1.3.3 ATP含量測定

稱取1 g樣品，加入9 mL的沸水并勻漿1 min，之后在沸水中煮10 min，3 000×g離心10 min，可得到質(zhì)量分數(shù)為10%的組織勻漿液，再用雙蒸水稀釋20 倍，獲得質(zhì)量分數(shù)為0.5%的組織勻漿液，從其中取30 μL，采用ATP含量測試盒測定羊肉宰后0.5、2.0、6.0、12.0、24.0、48.0、72.0、120.0、168.0 h ATP含量的變化，使用二喹啉甲酸（bicinchoninic acid，BCA）試劑盒測定蛋白質(zhì)量濃度。以每克蛋白含有ATP的物質(zhì)的量作為ATP含量單位。

1.3.4 剪切力測定

用質(zhì)構(gòu)儀測定剪切力。取體積約3 cm×6 cm×6 cm肉塊除去表面的脂肪和筋膜，裝入蒸煮袋中，將溫濕度記錄儀的探頭沿肌纖維方向插入肉的中心，置于水浴鍋在80 ℃溫度條件下加熱至中心溫度為70 ℃后立即取出，擦去表面滲出的水分，待溫度降到室溫，沿肌纖維方向切成1.0 cm×1.0 cm×1.5 cm的肉塊。

質(zhì)構(gòu)儀測定條件：探頭型號為HDP/BSW探頭，測前速率1.0 mm/s，測中速率1.0 mm/s，測后速率5.0 mm/s，時間間隔5 s。每個樣品7～10 次重復(fù)，取平均值。

1.3.5 肌原纖維超微結(jié)構(gòu)測定

參考王欣[10]和宋潔[11]等的方法并作修改。宰后立即取羊背最長肌，在不同宰后時間沿肌纖維方向切成1 mm×1 mm×3 mm規(guī)格的肉條，取樣時避免牽拉和鉗夾，以免增大實驗誤差，放入體積分數(shù)為2.5%的戊二醛溶液中，在室溫（25℃）條件下固定。室溫條件下用0.1 mol/L的磷酸鹽緩沖液（pH 7.3）沖洗，質(zhì)量分數(shù)為1%的四氧化鋨固定，放置2 h，磷酸鹽緩沖液沖洗后，采用30%、50%、70%、85%、96%的乙醇溶液和無水乙醇梯度脫水以及無水丙酮置換3次。樹脂包埋完放入烘箱進行聚合，采用超薄切片機切片，醋酸鈾-檸檬酸鉛雙染色，透射電鏡觀察拍照。Image-Pro Plus 6.0軟件分析透射電子顯微鏡圖片，測量肌節(jié)長度。

1.3.6 MFI測定

參照Culler等[12]的方法并稍作調(diào)整。稱取0.5 g肉樣，切碎后加入5 mL預(yù)冷的MFI緩沖液（100 mmol/L KCl、20 mmol/L K2HPO4、1 mmol/L乙二胺四乙酸、1 mmol/L MgCl2），高速勻漿3 次，每次30 s，中間間隔1 min。于3 000×g、4 ℃條件下離心15 min，去除上清液，將沉淀用5 mL預(yù)冷的MFI緩沖液懸浮，在3 000×g、4℃條件下再次離心15 min，棄去上清液，用1.25 mL預(yù)冷的MFI緩沖液將沉淀充分懸浮。將懸浮液用20 目篩網(wǎng)過濾除去結(jié)締組織，再加1.25 mL預(yù)冷的MFI緩沖液清洗離心管，使肌原纖維通過篩孔。過濾后的懸浮液用雙縮脲法測定蛋白質(zhì)量濃度，然后用MFI緩沖液調(diào)整懸浮液蛋白質(zhì)量濃度為（0.50±0.05） mg/mL，在540 nm波長處測定吸光度，將所得結(jié)果乘200后即可得到MFI。

1.3.7 肌原纖維蛋白降解測定

肌鈣蛋白T和肌間線蛋白的降解測定采用蛋白質(zhì)免疫印跡技術(shù)。將1 g肌肉組織加入6 mL預(yù)冷的緩沖劑中（100 mmol/L Tris、10 mmol/L二硫蘇糖醇、蛋白酶抑制劑（50 mL緩沖液中添加一片），pH 8.3，需現(xiàn)配現(xiàn)用），用Ultra Turrax T25勻漿機4檔勻漿2 次，每次15 s，于-80 ℃溫度條件下保存。于10 000×g，4 ℃離心35 min，所得沉淀即肌原纖維蛋白。沉淀溶解于5% SDS溶液（60 ℃），然后用勻漿機3檔（約9 500 r/min）勻漿30 s，80 ℃加熱20 min。

提取的肌原纖維蛋白樣品調(diào)整至統(tǒng)一濃度后，按體積比為1∶1加入樣品緩沖液（10% SDS、純甘油、0.5 mol/L Tris-HCl（pH 6.8）、1 mol/L二硫蘇糖醇、1 mol/L溴酚藍），沸水浴中加熱5 min，冷卻后于12 000×g離心1 min，取上清液上樣，上樣量為5 μg。SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳中肌間線蛋白和肌鈣蛋白T分別采用12%、15%的分離膠與4%的濃縮膠（質(zhì)量比為37.5∶1.0的丙烯酰胺和甲叉雙丙烯酰胺混合溶液）。電泳初始電壓為70 V，待蛋白進入分離膠后調(diào)整電壓為110 V，至蛋白到達離凝膠底部5 mm處停止電泳。肌鈣蛋白T采用濕法將凝膠上的蛋白條帶轉(zhuǎn)移至聚偏二氟乙烯（polyvinylidene fluoride，PVDF）膜上，100 V恒壓條件下，冰浴轉(zhuǎn)膜60 min；肌間線蛋白采用半干法，在全自動半干轉(zhuǎn)印儀中，于25 V、2.5 A條件下轉(zhuǎn)膜3 min。轉(zhuǎn)膜結(jié)束后，將PVDF膜在TBS緩沖液（0.01 mol/L Tris、0.15 mol/L NaCl，pH 7.5）中清洗3 次，每次1 min，在封閉液（含0.05%吐溫20、3%牛血清白蛋白的TBS溶液）中室溫封閉2 h。

一抗使用肌間線蛋白和肌鈣蛋白T單克隆抗體，稀釋1 000 倍，4 ℃過夜孵育；隨后將膜用TBST1溶液（含0.1%吐溫20的TBS溶液）漂洗3 次后與二抗（稀釋2 500倍）室溫孵育2 h；孵育結(jié)束后用TBST2溶液（0.05 mol/L Tris、0.15 mol/L NaCl、0.1%吐溫20，pH 7.5）漂洗PVDF膜3 次，每次10 min，電化學(xué)發(fā)光（electro-chemi-luminescence，ECL）法顯色曝光，并使用凝膠成像儀拍照。

1.3.8 鈣蛋白酶活力的測定

采用活性電泳的方法進行測定，參考Kadee[13]和Melody[14]等的方法并適當調(diào)整。取0.5 g樣品，加入3 倍體積的抽提液（100 mmol/L Tris、10 mmol/L 乙二胺四乙酸、0.05%巰基乙醇，pH 8.3），進行勻漿，然后于10 000×g 4 ℃離心35 min，上清液為所需蛋白樣品，采用BCA法測定蛋白質(zhì)量濃度，并調(diào)整至統(tǒng)一質(zhì)量濃度。按體積比為3∶2加入樣品緩沖液（150 mmol/L Tris-HCl（pH 6.8）、20%甘油、0.75%巰基乙醇、質(zhì)量分數(shù)0.02%溴酚藍），混勻后備用。采用12.5%的酪蛋白分離膠（質(zhì)量比75∶1的丙烯酰胺與甲叉雙丙烯酰胺混合溶液、375 mmol/L Tris-HCl（pH 8.8）、0.05 g/mL TEMED、0.05 g/mL過硫酸銨、2.1 mg/mL酪蛋白）和4%的濃縮膠（質(zhì)量比為37.5∶1的丙烯酰胺和甲叉雙丙烯酰胺混合溶液、125 mmol/L Tris-HCl（pH 6.8）、0.05 g/mL TEMED 、0.05 g/mL過硫酸銨，凝膠厚度為0.75 mm。上樣前，在冰浴中，100 V恒壓預(yù)電泳15 min，上樣量為40 μg，在相同電泳緩沖液（25 mmol/L Tris-HCl、0.53 g/L巰基乙醇、192 mmol/L甘氨酸、1 mmol/L乙二胺四乙酸，pH 8.3）中冰浴，于100 V恒壓條件下電泳7 h。電泳結(jié)束后更換3 次孵育緩沖液（50 mmol/L Tris、0.53 g/L巰基乙醇、4 mmol/L CaCl2，pH 7.5），每次室溫孵育20 min，并在上述相同的緩沖液中室溫孵育16 h。凝膠經(jīng)考馬斯亮藍染色脫色后，使用凝膠成像系統(tǒng)照相。

1.4 統(tǒng)計分析

實驗結(jié)果用SPSS 22.0和Excel 2010軟件進行處理，同一處理組的不同時間點之間采用F檢驗進行差異顯著性分析，采用Duncan多重比較法進行差異顯著性分析，顯著水平為P＜0.05。

2 結(jié)果與分析

2.1 pH值

圖1 宰后不同時間pH值的變化Fig. 1 Variation in pH during 168.0 h post-mortem

pH值反映肌肉內(nèi)乳酸和無機磷酸的沉積，間接反映糖酵解程度。由圖1可知，隨著宰后時間的延長，宰后24.0 h內(nèi)pH值逐漸下降且差異顯著（P＜0.05），24.0 h后變化趨于穩(wěn)定，說明糖酵解反應(yīng)幾乎終止，而在第168小時，pH值升高，可能是由于微生物繁殖或者蛋白質(zhì)降解造成的。吳菊清等[15]采用了相同的方法研究牛肉和豬肉pH值變化，其變化趨勢與本研究結(jié)果相似。

2.2 ATP含量

ATP是肌肉運動的直接能量載體，肌肉收縮過程中ATP的狀態(tài)影響肌動蛋白和肌球蛋白的狀態(tài)。肌球蛋白和肌動蛋白結(jié)合形成肌動球蛋白，結(jié)合力取決于與核苷酸的結(jié)合狀態(tài)，未結(jié)合核苷酸的肌球蛋白與肌動蛋白的親和力最高。隨著宰后ATP的消耗，肌動蛋白和肌球蛋白之間形成強結(jié)合橫橋，即僵直狀態(tài)。

圖2 宰后不同時間ATP含量的變化Fig. 2 Variation in ATP content during 168.0 h post-mortem

由圖2可知，ATP含量先增大后逐漸下降，可能是宰后胴體供氧停止，啟動磷酸肌酸供能途徑，使得ATP含量逐漸上升。肌肉細胞的磷酸肌酸含量是ATP的3～4 倍，可貯存供短期活動用的、足夠的磷酸基團，在肌酸激酶的作用下很快供給ADP磷酸基，使之再合成ATP。磷酸肌酸耗盡時啟動糖酵解途徑，其產(chǎn)生速率迅速下降，而肌肉收縮需要不斷的能量供給，ATP含量逐漸下降。Frylinck[16]和徐昶[17]等研究發(fā)現(xiàn)牛背最長肌ATP含量隨宰后時間的延長而逐漸下降。到第48小時后ATP含量趨于穩(wěn)定，可能是糖酵解反應(yīng)終止，肌動球蛋白之間不再形成橫橋，僵直達到最大。綜上所述，ATP含量在宰后48.0h內(nèi)顯著下降（P＜0.05），從第48小時開始ATP含量趨于穩(wěn)定，說明僵直完成，推測解僵在宰后第2天發(fā)生。

2.3 肌原纖維的超微結(jié)構(gòu)及肌節(jié)長度

隨著宰后成熟時間的延長，肌原纖維的結(jié)構(gòu)被破壞，Z線結(jié)構(gòu)由原來的完整形態(tài)變得模糊，表明與Z線結(jié)構(gòu)相關(guān)的蛋白發(fā)生降解；M線的結(jié)構(gòu)相對穩(wěn)定，從宰后0.5～168.0 h均可觀察到（圖3）。

如圖4所示，宰后隨著成熟時間的延長，肌節(jié)長度第48小時最短，從第48小時開始肌節(jié)逐漸變長[18]，說明肌肉從第48小時開始解僵。宰后成熟過程中，肌肉經(jīng)過尸僵、解僵的過程，在這個過程中，肌節(jié)長度先變短后變長，與Geesink等[19]的研究結(jié)果相似。在動物宰后初期，磷酸肌酸提供高能磷酸鍵形成ATP，耗盡后由糖酵解提供ATP，其含量迅速下降，肌動蛋白和肌球蛋白之間形成不可逆橫橋，肌肉收縮至伸縮性幾乎完全消失，肌節(jié)長度最短。之后肌節(jié)逐漸變長，可能是肌原纖維蛋白降解和肌動球蛋白解離的共同作用造成的[20]。

圖3 宰后肌原纖維超微結(jié)構(gòu)變化Fig. 3 Variationin in the ultrastructure of myofibril during 168.0 h post-mortem

圖4 宰后不同時間肌節(jié)長度的變化Fig. 4 Variation in sarcomere length during 168.0 h post-mortem

2.4 剪切力

剪切力是衡量肌肉嫩度的一個重要指標，剪切力越大說明嫩度越差。宰后羊肉經(jīng)歷僵直、解僵和成熟的過程，剪切力在僵直開始后不斷升高。隨著宰后時間的延長，僵直解除，剪切力值開始下降，嫩度上升，肌肉成熟[21]。

圖5 宰后不同時間剪切力的變化Fig. 5 Variation in shear force during 120.0 h post-mortem

如圖5所示，隨著宰后時間的延長，剪切力顯著上升且在第24小時達到最大值，但是與宰后第48小時相比差異不顯著（P＞0.05），而肌節(jié)長度在宰后第24小時和第48小時較短，與剪切力結(jié)果相反，肌節(jié)長度越短，剪切力越大。表明僵直主要發(fā)生在宰后24.0 h內(nèi)，經(jīng)過一段僵直期在第48小時后開始解僵，剪切力逐漸減小，差異顯著（P＜0.05）。劉佳東[22]和Hopkins[23]等在研究牦牛肉排酸過程中剪切力的變化，其變化趨勢和本研究是相似的，但是在第4天達到最大值，說明不同物種的僵直時間不同。

2.5 肌原纖維小片化指數(shù)

MFI是反映肌纖維內(nèi)部肌原纖維及骨架蛋白完整程度的指標，μ-鈣蛋白酶是導(dǎo)致MFI升高最主要的內(nèi)源酶。MFI值越大，表明肌原纖維內(nèi)部結(jié)構(gòu)的完整性受到破壞的程度越大，嫩度越好。

圖6 宰后不同時間MFI的變化Fig. 6 Variation in MFI during 168.0 h post-mortem

如圖6所示，MFI在宰后12.0 h內(nèi)變化差異不顯著（P＞0.05），隨著宰后時間的延長，MFI值逐漸增大且在12.0～72.0 h顯著上升（P＜0.05），表明這期間肌原纖維骨架受到破壞，成熟過程可能主要完成于這段時間，第72小時以后MFI變化不顯著（P＞0.05），表明小片化程度趨于穩(wěn)定。師希雄等[24]在研究牦牛肉宰后成熟過程中MFI的變化表明，整體變化趨勢呈S形，與本實驗的結(jié)果相似，李培迪[25]和李誠[26]等研究在冰溫和冷藏貯存下羊背最長肌MFI的變化，也驗證了同樣的現(xiàn)象。

2.6 鈣蛋白酶活力

鈣蛋白酶分為μ-鈣蛋白酶和m-鈣蛋白酶兩類，自溶后才表現(xiàn)活性，其活性下降是其發(fā)揮蛋白水解作用的標志，其中μ-鈣蛋白酶是一種鈣激活中性半胱氨酸內(nèi)肽酶，主要分布在肌原纖維的Z盤附近[27-28]。體內(nèi)μ-鈣蛋白酶和m-鈣蛋白酶都能水解肌原纖維蛋白，但在宰后成熟的過程中m-鈣蛋白酶幾乎沒有水解活性，而μ-鈣蛋白酶在自溶中發(fā)揮活性后失活。

圖7 宰后不同時間鈣蛋白酶活力電泳分析Fig. 7 Casein zymography of calpain during 168.0 h post-mortem

由圖7所示，隨著宰后成熟時間的延長，m-鈣蛋白酶的活力從0.5～168.0 h變化不大，表明在宰后成熟過程中沒有發(fā)揮水解蛋白的作用；而μ-鈣蛋白酶的大亞基在自溶過程中發(fā)揮活性，由80 kD降解為78 kD，最終降解為76 kD。本實驗從宰后0.5 h開始，80 kD的大亞基活力逐漸下降，78 kD的大亞基活力先上升后下降，到第48小時活力完全消失。綜上所述，μ-鈣蛋白酶80 kD大亞基的初始含量高，但降解速度快，在宰后24.0 h失活，其降解的78 kD大亞基在48.0 h失活。對照上述結(jié)果，μ-鈣蛋白酶失活的時間點是解僵開始的時間點，μ-鈣蛋白酶發(fā)揮活力期間剪切力是上升的，表明其活力的發(fā)揮在宰后48.0 h內(nèi)對僵直進程的影響作用不明顯。

2.7 肌原纖維蛋白的降解分析

肌間線蛋白和肌鈣蛋白T作為μ-鈣蛋白酶的主要底物，其降解程度可反映肌原纖維蛋白整體降解程度。肌間線蛋白圍繞Z盤分布并延伸到Z盤內(nèi)部，是位于Z線以及Z線和肌細胞膜之間的骨架蛋白，其亞基的分子質(zhì)量約53 kD，在成熟的肌細胞中則起著連接每條肌原纖維并將其與細胞膜連結(jié)，起著固定肌原纖維的作用，進而維持整個骨骼肌細胞的有序性和完整性等。肌鈣蛋白T為肌細絲蛋白，主要結(jié)合原肌球蛋白，作為肉嫩度改善的一個標志，其降解破壞了肌細絲的完整性，改變了肌動蛋白和肌球蛋白之間的相互作用，導(dǎo)致了肌原纖維的片段化。

圖8 宰后不同時間肌間線蛋白降解的免疫印跡圖Fig. 8 Representative Western-blot pattern of desmin degradation during 168.0 h post-mortem

由圖8可知，隨著宰后時間的延長，肌間線蛋白的相對含量逐漸減小，特別是從宰后第48小時開始相對含量降低，到第168小時幾乎降解完全，表明Z線的結(jié)構(gòu)受到破壞。Lomiwes等[29]也發(fā)現(xiàn)了同樣的變化趨勢。

圖9 宰后不同時間肌鈣蛋白T的免疫印跡圖Fig. 9 Representative Western-blot profile of troponin T degradation during 168.0 h post-mortem

由圖9可知，肌鈣蛋白T在宰后隨著時間的延長發(fā)生降解，由完整的37 kD降解為30 kD的蛋白，特別是從宰后24.0 h后，降解條帶的相對含量逐漸增大，完整條帶的相對含量逐漸減小至消失。Marino等[30]在研究不同品種牛背最長肌也得出了相似的結(jié)果。Kim等[31]研究報道冷凍/解凍后肌間線蛋白和肌鈣蛋白T隨著成熟時間的延長，降解程度逐漸增大。由μ-鈣蛋白酶活力結(jié)果表明其蛋白水解活力主要在宰后48.0 h內(nèi)發(fā)揮作用，而肌間線蛋白和肌鈣蛋白T在第72小時后仍在降解，可能是肌原纖維蛋白的降解滯后于μ-鈣蛋白酶發(fā)揮活性的時間或者其他蛋白酶（如組織蛋白酶）發(fā)揮水解蛋白活性[32]。肌原纖維蛋白的降解生成了小肽段，推測可能是堿性基團暴露增多，從而導(dǎo)致pH值上升。綜上所述，宰后成熟過程中肌間線蛋白和肌鈣蛋白T發(fā)生降解，從第48小時開始，蛋白的降解速率加快，說明解僵也從此時開始。

3 結(jié) 論

隨著宰后時間的延長，羊背最長肌經(jīng)歷了從僵直到解僵的過程。pH值于宰后第24小時開始趨于穩(wěn)定；在第72小時剪切力顯著減小（P＜0.05），肌節(jié)長度顯著變長（P＜0.05），所以宰后第72小時是羊背最長肌肉品質(zhì)轉(zhuǎn)好的關(guān)鍵轉(zhuǎn)折。μ-鈣蛋白酶活力在宰后48.0 h消失，而肌間線蛋白和肌鈣蛋白T從第72小時開始大量下降，說明酶活力發(fā)揮和蛋白降解不同步?？傊?，羊背最長肌從宰后2.0 h開始進入僵直到24.0 h達到最大，經(jīng)過一段僵直后期，從第48小時開始解僵，嫩度逐漸改善。

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Changes of Physicochemical Characteristics of Lamb Longissimus dorsi Muscle during Rigor Development and Aging

LI Guixia1,2, LI Xin2, LI Zheng2, WANG Ying1,2, ZHU Jie1,*, ZHANG Dequan2,*
(1. Laboratory of Biomechanics and Engineering, Institute of Biophysics, College of Science, Northwest A & F University,Yangling 712100, China; 2. Key Laboratory of Agro-Products Processing, Ministry of Agriculture,Institute of Food Science and Technology, Chinese Academy of Agricultural Sciences, Beijing 100193, China)

The carcass undergoes a series of complicated physiological and biochemical processes driving the muscle to meat conversion after slaughter. Studying rigor development and postmortem aging is expected to provide theoretical supports for meat quality improvement and processing. Six crossbred rams (Small-tailed Han sheep × Beijing native sheep breed)were slaughtered, and both longissimus dorsi muscles (n = 12) from each carcass were excised and stored at 4 ℃ for 0.5,2.0, 6.0, 12.0, 24.0, 48.0, 72.0, 120.0 and 168.0 h to determine pH, ATP content, sarcomere length, shear force, myofibril fragmentation index (MFI), protein degradation and μ-calpain activity. During the conversion of muscle to meat, pH initially decreased and then remained not changed significantly at 24 h postmortem (P 〉 0.05). Shear force first increased until reaching a maximum value at 24 h after slaughter and then decreased. Sarcomere length was first shortened until reaching a minimum value at 48 h and then extended gradually. ATP content was initially increased, then decreased and finally tended to be stable. The 80 kD subunit of μ-calpain degraded almost completely disappeared at 24 h, and a 78 kD subunit was formed firstly and then degraded completely at 48 h after slaughter. Desmin and troponin T as the substrates of μ-calpain were degraded during ageing and intact proteins were scarcely be observed at 168 h. In conclusion, the development of rigor mortis in longissimus dorsi started at 2 h postmortem and reached a peak at 24 h, and it began to disappear at 48 h. The meat tenderness was improved greatly after the complete disappearance of rigor mortis.

lamb longissimus dorsi muscle; rigor; tenderness; aging

10.7506/spkx1002-6630-201721018

TS251.5+3

A

1002-6630（2017）21-0112-07

2016-09-01

國家農(nóng)業(yè)科技創(chuàng)新工程項目；公益性行業(yè)（農(nóng)業(yè)）科研專項（201303083）；國家現(xiàn)代農(nóng)業(yè)（肉羊）產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系建設(shè)專項（CARS-39）

李桂霞（1990—），女，碩士，研究方向為肉品科學(xué)與工程。E-mail：liguixia1990@163.com

*通信作者：朱杰（1980—），男，副教授，博士，研究方向為肉品科學(xué)與工程。E-mail：jiezhu@nwafu.edu.cn張德權(quán)（1972—），男，教授，博士，研究方向為肉品科學(xué)與工程。E-mail：dequan_zhang0118@126.com

李桂霞, 李欣, 李錚, 等. 宰后僵直及成熟過程中羊背最長肌理化性質(zhì)的變化[J]. 食品科學(xué), 2017, 38(21): 112-118.

10.7506/spkx1002-6630-201721018. http://www.spkx.net.cn

LI Guixia, LI Xin, LI Zheng, et al. Changes of physicochemical characteristics of lamb longissimus dorsi muscle during rigor development and aging[J]. Food Science, 2017, 38(21): 112-118. (in Chinese with English abstract) DOI:10.7506/spkx1002-6630-201721018. http://www.spkx.net.cn