黎 殊，楊園園，付思源，楊 英，許乾麗(.貴州省食品檢驗(yàn)檢測(cè)所，貴陽(yáng) 550004； .貴陽(yáng)護(hù)理學(xué)院，貴陽(yáng) 550004； .貴州醫(yī)科大學(xué)，貴陽(yáng) 550004)

在線固相萃取-高效液相色譜法(HPLC)測(cè)定煎炸用植物油中苯并(a)芘的含量

黎 殊1，楊園園1，付思源2，楊 英3，許乾麗1
(1.貴州省食品檢驗(yàn)檢測(cè)所，貴陽(yáng) 550004； 2.貴陽(yáng)護(hù)理學(xué)院，貴陽(yáng) 550004； 3.貴州醫(yī)科大學(xué)，貴陽(yáng) 550004)

建立了在線固相萃取-高效液相色譜法(HPLC)測(cè)定煎炸用植物油中苯并(a)芘(BaP)含量的方法。樣品用異丙醇-環(huán)己烷(體積比1∶1)溶解，經(jīng)在線固相富集柱凈化濃縮后，C18色譜柱分離，熒光檢測(cè)器進(jìn)行檢測(cè)。結(jié)果表明：BaP在0.2～10 ng/mL質(zhì)量濃度范圍內(nèi)與峰面積呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系，相關(guān)系數(shù)0.999 9，方法的檢出限為0.50 μg/kg；在BaP加標(biāo)量為5～15 ng范圍內(nèi)，BaP加標(biāo)回收率為101%～106%，RSD為2.6%～3.2%。該方法具有操作簡(jiǎn)單、毒性低、耗時(shí)短、重復(fù)性好和準(zhǔn)確度高等優(yōu)點(diǎn)，適用于大批量煎炸用植物油中BaP的檢測(cè)。

苯并(a)芘；在線固相萃取；HPLC；煎炸用植物油

苯并(a)芘(BaP)是公認(rèn)的強(qiáng)致癌物之一，可誘發(fā)皮膚、肺、食道等部位的腫瘤和癌變，經(jīng)檢測(cè)，多次使用的煎炸用植物油、油炸過(guò)火的食品，由于油脂類和有機(jī)氨基酸在高溫條件下發(fā)生分解、環(huán)化、聚合而形成苯并(a)芘等致癌成分[1-2]。目前，有關(guān)苯并(a)芘的檢測(cè)方法多種多樣，其主要采用薄層層析法、熒光分析法、高效液相色譜法、聯(lián)用技術(shù)及免疫學(xué)檢測(cè)法等[3-15]。GB/T 22509—2008 《動(dòng)植物油脂 苯并(a)芘的測(cè)定 反相高效液相色譜法》，采用熒光檢測(cè)器檢測(cè)，試樣經(jīng)手工填充的氧化鋁層析柱凈化、濃縮、上機(jī)，前處理由于重現(xiàn)性差，耗時(shí)，該方法受到一定的限制。GB/T 5009.27—2003《食品中苯并(a)芘的測(cè)定》，采用熒光分光光度計(jì)法和目測(cè)比色法，操作過(guò)程復(fù)雜，費(fèi)時(shí)、溶劑毒性大、回收率不穩(wěn)定，對(duì)試劑和人員要求較高。高效液相色譜法是目前檢測(cè)最常用的方法，本文利用雙三元液相色譜儀，通過(guò)在線固相萃取技術(shù)，雙泵串聯(lián)使用，先將樣品保留在富集柱上，再用乙腈將苯并(a)芘洗脫進(jìn)入C18分析柱分離，降低基質(zhì)對(duì)苯并(a)芘測(cè)定的干擾。本實(shí)驗(yàn)方法可以將原來(lái)用4～5 h進(jìn)行固相萃取前處理樣品縮短到20 min左右，而且在線固相萃取富集柱可重復(fù)使用，降低成本，精密度和準(zhǔn)確度好，適用于大批量樣品的檢測(cè)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

貴州省食品檢驗(yàn)檢測(cè)所監(jiān)督抽查的煎炸用植物油樣品，包含色拉油、大豆油、菜籽調(diào)和油、起酥油。異丙醇(色譜純)，石油醚(分析純)，正己烷(色譜純)，環(huán)己烷(色譜純)，乙酸乙酯(色譜純)，乙腈(色譜純)，苯并(a)芘標(biāo)準(zhǔn)品(純度99.6%)。

Thermo Dionex Ultimate 3000型高效液相色譜儀(配雙三元梯度和熒光檢測(cè)器)，Mettler Toledo XS105DU分析天平，Millipore超純水機(jī)，Eppendorf臺(tái)式離心機(jī)。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 標(biāo)準(zhǔn)品溶液的制備及標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

準(zhǔn)確稱取苯并(a)芘標(biāo)準(zhǔn)品10.04 mg，置于100 mL棕色瓶中，以甲醇溶解定容至刻度線，該儲(chǔ)備液質(zhì)量濃度為99.998 μg/mL。然后精密移取1 mL 上述儲(chǔ)備液至100 mL容量瓶中，得999.98 ng/mL使用液；再精密移取10 mL使用液至100 mL容量瓶中，制得99.998 ng/mL苯并(a)芘標(biāo)準(zhǔn)溶液。分別移取標(biāo)準(zhǔn)溶液0.2、0.5、1、2、5、10 mL至100 mL容量瓶中，甲醇稀釋定容，其質(zhì)量濃度分別為0.2、0.5、1、2、5、10 ng/mL。以質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)、峰面積為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.2.2 樣品溶液制備

準(zhǔn)確稱取煎炸用植物油樣品1.000 0 g于10 mL容量瓶中，加入異丙醇-環(huán)己烷混合溶液(體積比1∶1)稀釋定容至10 mL，搖勻后過(guò)0.45 μm有機(jī)濾膜待測(cè)。

1.2.3 色譜條件

Agilent ChromSpher Pi富集柱(3.0 mm×80 mm)(P/N：CP28159，S/N：487765)；SinoChrom ODS-BP C18分析柱(5 μm，4.6 mm ×250 mm)(柱號(hào)：E2718139，批號(hào)：1DD29A0)。熒光檢測(cè)器測(cè)定參數(shù)：激發(fā)波長(zhǎng)384 nm，發(fā)射波長(zhǎng)406 nm；靈敏度4；柱溫30℃；進(jìn)樣量100 μL；流速1 mL/min。流動(dòng)相及閥切換：左泵為流動(dòng)相A乙腈，流動(dòng)相B水 ，流速1.0 mL/min；右泵為流動(dòng)相A乙腈，流動(dòng)相B水，流動(dòng)相C異丙醇， 流速1.0 mL/min。左泵和右泵流動(dòng)相梯度洗脫條件見(jiàn)表1。

表1 左泵和右泵流動(dòng)相梯度洗脫條件

2 結(jié)果與討論

2.1 樣品前處理方法優(yōu)化

本實(shí)驗(yàn)采用的煎炸用植物油包括色拉油、大豆油、菜籽調(diào)和油、起酥油4種油脂，經(jīng)過(guò)不同溶劑溶解上機(jī)測(cè)試發(fā)現(xiàn)，煎炸用色拉油雜質(zhì)最多，干擾目標(biāo)物質(zhì)的分離，因此在后續(xù)實(shí)驗(yàn)中，均以煎炸用色拉油為樣品優(yōu)化實(shí)驗(yàn)條件，以便該方法能廣泛適用于煎炸用植物油中。樣品采用異丙醇稀釋，可大大降低樣品黏度，但提取效率較低，部分樣品稀釋后放置較長(zhǎng)時(shí)間會(huì)發(fā)生分層現(xiàn)象，準(zhǔn)確性差。為了優(yōu)化提取條件，本實(shí)驗(yàn)分別采用了異丙醇-石油醚、異丙醇-正己烷、異丙醇-環(huán)己烷、異丙醇-乙酸乙酯4種混合溶劑(體積比1∶1)稀釋樣品。通過(guò)對(duì)比實(shí)驗(yàn)表明，同一樣品，相同條件下，4種混合溶劑苯并(a)芘峰面積有明顯差別，其中異丙醇-環(huán) 己烷的峰面積最大。石油醚揮發(fā)性較強(qiáng)，異丙醇-石油醚作為溶劑，測(cè)定結(jié)果精密度差。異丙醇-正己烷為溶劑測(cè)定結(jié)果不穩(wěn)定，重復(fù)性不好。采用異丙醇-環(huán)己烷作為溶劑測(cè)定結(jié)果穩(wěn)定，回收率好。考慮到異丙醇-環(huán)己烷不同比例對(duì)油脂溶解性和苯并(a)芘提取的影響，設(shè)計(jì)了異丙醇-環(huán)己烷體積比分別為6∶4、8∶2、6∶4、2∶8 4種情況，通過(guò)比較色譜圖，相同條件下，體積比為1∶1的峰面積最大，樣品溶液均勻，達(dá)到苯并(a)芘提取的最佳效果，回收率最好。

2.2 色譜條件的選擇

(1)色譜柱選擇：選用Capecell PAKMGⅡ C18和SinoChrom ODS-BP C18柱對(duì)樣品進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)，采用苯基柱分析，苯并(a)芘與其他干擾物質(zhì)分離度好，故選用SinoChrom ODS-BP作為分析柱。

(2)波長(zhǎng)的選擇：參考SC/T 3041—2008《水產(chǎn)品中苯并(a)芘的測(cè)定 高效液相色譜法》，苯并(a)芘最佳的激發(fā)/發(fā)射波長(zhǎng)為297 nm/405 nm，但實(shí)際測(cè)試過(guò)程中發(fā)現(xiàn)該波長(zhǎng)下，樣品中其他雜質(zhì)干擾較大，參照GB/T 22509—2008選擇激發(fā)/發(fā)射波長(zhǎng)為384 nm/406 nm后，雖靈敏度降低，但可大大降低基質(zhì)干擾。

(3)左泵流動(dòng)相體積比的選擇：通過(guò)左泵流動(dòng)相乙腈-水體積比為90∶10時(shí)，苯并(a)芘位置處前面有一個(gè)雜質(zhì)峰，其與苯并(a)芘的分離度為1.131，達(dá)不到定量分析要求，流動(dòng)相體積比為88∶12、85∶15的分離度均較大，但是前者的出峰時(shí)間早，故選擇流動(dòng)相乙腈-水的體積比為88∶12。

2.3 線性方程和方法檢出限

取不同質(zhì)量濃度標(biāo)準(zhǔn)溶液依次進(jìn)樣100 μL檢測(cè)，以苯并(a)芘質(zhì)量濃度(X)與峰面積(A)進(jìn)行線性回歸。得線性方程為A=162 109X-6 589.1，r=0.999 9。結(jié)果表明，苯并(a)芘在0.2～10 ng/mL質(zhì)量濃度范圍與峰面積具有良好線性關(guān)系。取質(zhì)量濃度為1 ng/mL標(biāo)準(zhǔn)溶液稀釋20倍，進(jìn)樣100 μL，信噪比約為3時(shí)，按稱樣量和定容體積折算，本方法苯并(a)芘的檢出限為0.50 μg/kg。

2.4 方法的重復(fù)性和回收率

取質(zhì)量濃度為1.0 ng/mL苯并(a)芘標(biāo)準(zhǔn)溶液連續(xù)進(jìn)樣6次，進(jìn)樣量100 μL，保留時(shí)間RSD為0.025%，峰面積RSD為0.22%。

按1.2.2方法，平行處理6份樣品，進(jìn)樣量100 μL，在優(yōu)化條件下測(cè)得樣品中苯并(a)芘含量平均值為1.19 μg/kg，RSD為3.17%。

選取重復(fù)性實(shí)驗(yàn)的樣品，取平均值1.19 μg/kg作為樣品的本底含量。向樣品中分別加入0.5、1.0、1.5 mL 10 ng/mL苯并(a)芘標(biāo)準(zhǔn)溶液，每個(gè)加標(biāo)量平行處理6份樣品，在優(yōu)化的色譜條件下測(cè)定苯并(a)芘含量，結(jié)果見(jiàn)表2。由表2可知，方法加標(biāo)回收率在101%～106%之間，RSD為2.6%～3.2%。

表2 苯并(a)芘加標(biāo)回收率及RSD(n=6)

3 結(jié) 論

本方法采用在線固相萃取技術(shù)對(duì)煎炸用植物油中的苯并(a)芘含量進(jìn)行測(cè)定，通過(guò)優(yōu)化前處理?xiàng)l件和儀器條件，簡(jiǎn)化了樣品的前處理，保證了較高的準(zhǔn)確度和精密度，縮短了實(shí)驗(yàn)時(shí)間。該方法具有操作簡(jiǎn)單、毒性低、耗時(shí)短等優(yōu)點(diǎn)，適用于大量煎炸用植物油樣品的快速檢測(cè)。

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Determinationofbenzo(a)pyrenecontentinfryingvegetableoilsbyon-linesolidphaseextraction-highperformanceliquidchromatography

LI Shu1，YANG Yuanyuan1，F(xiàn)U Siyuan2，YANG Ying3，XU Qianli1
(1.Guizhou Provincial Institute for Food Inspection,Guiyang 550004,China; 2.Guiyang Nursing Vocational College, Guiyang 550004, China; 3.Guizhou Medical University, Guiyang 550004, China)

A method for determining benzo(a)pyrene (BaP) content in frying vegetable oil by on-line solid phase extraction-high performance liquid chromatography was established. The samples were dissolved in isopropyl alcohol-cyclohexane(volume ratio 1∶1), cleaned up using on-line solid phase concentration column, and separated by C18column, then detected by fluorescence detector. The results showed that the BaP had good linear relationship in the range of 0.2-10 ng/mL, correlation coefficent was 0.999 9, and the limit of detection was 0.50 μg/kg. The recovery was 101%-106%, andRSDwas 2.6%-3.2% with addition of 5-15 ng BaP in samples.This method had the items of simple operation, low toxicity, short time-consumption, good repeatability and accuracy, and could be applied in the detection of BaP in multitudinous frying vegetable oils.

benzo(a)pyrene; on-line solid phase extraction; HPLC; frying vegetable oil

2017-01-25；

2017-06-20

黎 殊(1991)，男，助理工程師，主要從事食品檢測(cè)工作(E-mail)312238106@qq.com。

油脂安全

O657.7+2;TS227

A

1003-7969(2017)10-0074-03