王志鵬++封慧++郭茗++王長(zhǎng)松

摘要：目的 探討薤白皂苷對(duì)血小板聚集及血小板-中性粒細(xì)胞間相互作用的影響。方法 分別于在體和離體環(huán)境下觀察SD大鼠血小板聚集功能，采用玫瑰花環(huán)試驗(yàn)測(cè)定血小板與中性粒細(xì)胞的黏附能力，檢測(cè)細(xì)胞溶質(zhì)鈣離子的濃度。結(jié)果 薤白皂苷離體環(huán)境下呈濃度依賴性抑制花生四烯酸（AA）、腺苷二磷酸（ADP）或血小板活化因子（PAF）誘導(dǎo)的血小板聚集；薤白皂苷在體環(huán)境下呈濃度依賴性抑制PAF、ADP及AA誘導(dǎo)的血小板聚集，5 mg/kg薤白皂苷明顯抑制PAF、AA和ADP誘導(dǎo)的血小板聚集；薤白皂苷可降低洗滌血小板內(nèi)鈣離子濃度；薤白皂苷可降低中性粒細(xì)胞與凝血酶激活的血小板間的黏附，并抑制中性粒細(xì)胞上清液誘導(dǎo)的血小板聚集，其50%抑制濃度分別為2.7、9.6 μmol/L。結(jié)論 薤白皂苷體外和體內(nèi)均可抑制血小板聚焦，抑制血小板-中性粒細(xì)胞間的相互作用。

關(guān)鍵詞：薤白皂苷；血小板-中性粒細(xì)胞；血小板聚集

DOI：10.3969/j.issn.1005-5304.2018.01.008

中圖分類號(hào)：R285.5 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A 文章編號(hào)：1005-5304（2018）01-0033-05

Effects of Saponins from Allium Macrostemon Bunge Bulbs on Platelet Aggregation

and Interactions between Platelets and Neutrophils

WANG Zhi-peng， FENG Hui， GUO Ming， WANG Chang-song

Zhongda Hospital Affiliated to Southeast University， Nanjing 210009， China

Abstract： Objective To investigate the effects of saponins from Allium Macrostemon Bunge Bulbs （SMBB） on platelet aggregation and platelet-neutrophil-interactions. Methods The effects of SMBB on platelet aggregation in SD rats were observed in vivo and in vitro. The adhesion of platelets to neutrophils was measured by rosette test. The effect of SMBB on activated platelet calcium levels was detected. Results Platelet aggregation induced by platelet activating factor （PAF）， adenosine diphosphate （ADP） and arachidonic acid （AA） was significantly inhibited by SMBB in vitro concentration-dependent. Platelet aggregation induced by PAF， AA and ADP was significantly inhibited by 5 mg/kg of SMBB. SMBB could reduce the intracellular calcium concentration in the wash platelets. SMBB significantly reduced the adhesion between neutrophils and thrombin-activated platelets and inhibited neutrophil supernatant-induced platelet aggregation， with IC50 of 2.7 μmol/L and 9.6 μmol/L， respectively. Conclusion SMBB can inhibit platelet aggregation in vitro and ex vivo， and inhibit the interactions between platelets and neutrophils.

Keywords： saponins from Allium Macrostemon Bunge Bulbs； platelet-neutrophil interactions； platelet aggregation

傳統(tǒng)觀點(diǎn)認(rèn)為血小板是參與血栓形成的主要細(xì)胞，其與中性粒細(xì)胞的聯(lián)系并不十分密切。近年來(lái)，更多的研究顯示，中性粒細(xì)胞不僅參與了血小板聚集

基金項(xiàng)目：江蘇省中醫(yī)藥管理局資助項(xiàng)目（YB2015180）；南京市衛(wèi)生科技項(xiàng)目（YKK16281）

通訊作者：王長(zhǎng)松，E-mail：kingidoc@126.com

與血栓形成過(guò)程，還通過(guò)釋放多種細(xì)胞因子參與心肌梗死的整個(gè)病理機(jī)制，故認(rèn)為血小板和中性粒細(xì)胞的相互作用可能是冠心病及心肌梗死發(fā)生發(fā)展的關(guān)鍵因素之一[1-2]。薤白有行氣導(dǎo)滯、通陽(yáng)散瘀的功效，是治療胸痹、真心痛的要藥，相關(guān)方劑“瓜蔞薤白白酒湯”“瓜蔞薤白半夏湯”“枳實(shí)薤白桂枝湯”是臨床常用治療胸痹、真心痛的名方。研究表明，薤白中皂苷類化合物通過(guò)抗血小板聚集、抗氧化、降血脂參與冠狀動(dòng)脈粥樣硬化的整個(gè)過(guò)程[3]，但其具體微觀機(jī)制并未解釋。本研究旨在探討薤白皂苷分別于在體和離體環(huán)境下對(duì)血小板活化因子（PAF）、腺苷二磷酸（ADP）及花生四烯酸（AA）誘導(dǎo)的血小板聚集的干預(yù)及對(duì)血小板-中性粒細(xì)胞間相互作用的影響。endprint

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物

8周齡SPF級(jí)健康雄性SD大鼠30只，體質(zhì)量240～260 g，東南大學(xué)醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，動(dòng)物許可證號(hào)SYXK（蘇）2013-0037，飼養(yǎng)于東南大學(xué)醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心SPF級(jí)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物房。

1.2 藥物及制備

薤白皂苷：將新鮮薤白鱗莖（南京鶴齡藥事服務(wù)有限公司，產(chǎn)地：河南省平頂山市）搗碎，先用乙醇從中提取出薤白總皂苷，然后運(yùn)用多種色譜學(xué)方法分離出已知化學(xué)結(jié)構(gòu)的6種薤白皂苷的混合物[4-5]。阿司匹林片，吉林集安益盛藥業(yè)股份有限公司，批號(hào)20170407821，500 mg/片；維拉帕米片，江蘇恒瑞醫(yī)藥股份有限公司，批號(hào)2017010226，120 mg/片。使用前溶解于100 mmol/L Na2CO3。

1.3 主要試劑與儀器

ADP、AA、PAF和人凝血酶，Hoffmann-La Roche Ltd；鈣離子熒光探針（Fura-2-AM）、N-甲?；琢虬滨?亮氨酰-苯基-丙氨酸（fMLP）和二甲基亞砜（DMSO），Sigma Chemical Co.。AA和PAF溶解于PBS，于100 mmol/L Na2CO3和Tris-NaCl緩沖液分別加入0.25%牛血清白蛋白，fMLP溶解在DMSO中。高速離心機(jī)（型號(hào)GL10MA），湖南凱達(dá)科學(xué)儀器有限公司；微孔板振蕩器（型號(hào)MPS40），上海達(dá)姆實(shí)業(yè)有限公司；流式細(xì)胞儀，美國(guó)BD公司；生物發(fā)光凝集測(cè)定儀，ChronoLog Corp，Havertown。

1.4 血小板制備

收集大鼠頸動(dòng)脈血，用于血小板與中性粒細(xì)胞結(jié)合實(shí)驗(yàn)的動(dòng)脈血用2.7%乙二胺酸處理，用于抗血小板聚集實(shí)驗(yàn)的動(dòng)脈血用3.8%檸檬酸鈉抗凝。分別于180×g和1000×g離心10 min，得富血小板血漿（PRP）和貧血小板血漿（PPP），PRP再以1000×g離心10 min，然后將細(xì)胞重懸于PBS（含有1.0%牛血清白蛋白和1 mmol/L CaCl2）中洗滌，臺(tái)盼藍(lán)拒染實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞存活率高于95%，將細(xì)胞濃度調(diào)至108/mL。

1.5 中性粒細(xì)胞制備

從剩余血液中用葡聚糖沉淀法分離出中性粒細(xì)胞，置于Ficoll-Hy-paque細(xì)胞分離液（特異性密度1.077 g/mL）中，用低滲法去除紅細(xì)胞。將細(xì)胞沉淀重新懸浮于由155 mmol/L NH4Cl、2.96 mmol/L KHCO3和3.72 mmol/L乙酰膽堿組成的紅細(xì)胞溶解緩沖液中，將試管倒置，5 min后，將懸浮液350×g離心10 min，PBS洗滌細(xì)胞，再重懸于含1 mmol/L CaCl2的Hank's溶液中。將細(xì)胞濃度調(diào)整為2×106/mL備用。

1.6 血小板聚集

體外血小板聚集：PRP中血小板聚集率參照文獻(xiàn)[4]Born法進(jìn)行測(cè)量。用生物發(fā)光凝集測(cè)定儀監(jiān)測(cè)最大聚集率（誘導(dǎo)血小板聚集濃度為ADP 3 μmol/L、AA 0.35 mmol/L、PAF 7.2 nmol/L）。計(jì)算藥物抑制血小板聚集率。血小板聚集率（%）=（A-B）÷A×100%。公式中A為添加對(duì)照物（生理鹽水）時(shí)濁度的最大變化，B為加入藥物（薤白皂苷、阿司匹林）時(shí)濁度的最大變化。50%抑制濃度（IC50）=添加抑制物值÷不添加抑制物值。

體內(nèi)血小板聚集：實(shí)驗(yàn)大鼠隨機(jī)分為生理鹽水組、阿司匹林組和薤白皂苷組，每組6只，分別給予相應(yīng)溶液2 mL灌胃，PRP和PPP分別在給藥前和給藥后60、120、180、240 min制備。用生物發(fā)光凝集測(cè)定儀監(jiān)測(cè)ADP、AA或PAF誘導(dǎo)的血小板最大聚集率。

1.7 細(xì)胞溶質(zhì)鈣離子濃度測(cè)定

取上述血小板混懸液200 μL裝入試管，加Fluo-3使其終濃度為4 μmol/L，37 ℃孵育30 min，再加PBS稀釋50倍，流式細(xì)胞儀檢測(cè)10 000個(gè)血小板的熒光強(qiáng)度。在1 mmol/L CaCl2條件下加Triton X-100測(cè)定最大熒光值Fmax，加入20 mmol/L鈣離子螯合劑測(cè)定最小熒光值Fmin，分別加入1 mL AA（200 μmol/L），37 ℃孵育10 min，再加入0.5%DMSO、阿司匹林及0.16、0.8、4、20、100 μmol/L薤白皂苷，測(cè)定熒光值F。計(jì)算細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度[Kd（F-Fmin）÷（Fmax-F）]，其中Kd為解離常數(shù)450 nmol/L[6]。

1.8 玫瑰花環(huán)試驗(yàn)

將上述血小板懸浮液50 μL等分置于微量滴定孔中，加入（不攪拌）1.2 U/mL人凝血酶10 μL（終濃度為0.2 U/mL），靜置15 min，再加入50 μL 2%多聚甲醛固定血小板，靜置30 min，在凝血酶活化前加入0.5%DMSO、阿司匹林或薤白皂苷溶液50 μL。PBS洗滌胰蛋白酶3次并重懸于50 μL PBS中。然后向血小板懸浮液中加100 μL中性粒細(xì)胞，4 ℃搖擺孵育30 min。將攜帶2個(gè)或更多血小板的中性粒細(xì)胞定義為玫瑰花環(huán)。隨即尋找不重復(fù)視野評(píng)價(jià)100個(gè)中性粒細(xì)胞。每個(gè)標(biāo)本分3份進(jìn)行測(cè)試，2個(gè)不同的觀察者評(píng)估玫瑰花環(huán)百分比并取平均值[7]。

1.9 檢測(cè)中性粒細(xì)胞上清液誘導(dǎo)的血小板聚集

將fMLP（2 μmol/L）加中性粒細(xì)胞懸液37 ℃孵育10 min，3000×g離心1 min，獲得活化的中性粒細(xì)胞上清液。將洗滌的血小板與0.5%DMSO、阿司匹林或薤白皂苷溶液孵育10 min，37 ℃加入5 μL無(wú)活性的中性粒細(xì)胞上清液。按“1.6”項(xiàng)下方法測(cè)定。

1.10 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS18.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析。計(jì)量資料以—x±s表示，組間比較用LSD-t檢驗(yàn)。檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 薤白皂苷對(duì)體外血小板聚集的影響endprint

薤白皂苷呈濃度依賴性明顯抑制AA誘導(dǎo)的血小板聚集，IC50為2.4 μmol/L。對(duì)ADP或PAF誘導(dǎo)的血小板聚集，薤白皂苷也有顯著影響，IC50值分別為0.4、1.1 μmol/L；阿司匹林濃度依賴性地抑制AA誘導(dǎo)的血小板聚集（IC50為6.3 μmol/L），而不抑制ADP或PAF誘導(dǎo)的血小板聚集。結(jié)果見(jiàn)表1。

2.2 薤白皂苷對(duì)體內(nèi)血小板聚集的影響

與生理鹽水組比較，給藥后60、120、180 min，薤白皂苷和阿司匹林對(duì)AA誘導(dǎo)血小板聚集均有明顯的抑制作用，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01），薤白皂苷對(duì)ADP（給藥后60、120、180 min）和PAF（給藥后60、120 min）引起的血小板聚集有明顯的抑制作用，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01），但阿司匹林對(duì)ADP和PAF引起的血小板聚集無(wú)明顯影響。結(jié)果見(jiàn)表2。

2.3 薤白皂苷對(duì)血小板胞漿鈣離子水平的影響

AA刺激生理鹽水干預(yù)血小板內(nèi)游離[Ca2+]i的Fluo-3熒光強(qiáng)度流式細(xì)胞儀檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)圖1、圖2，100 μmol/L薤白皂苷干預(yù)血小板[Ca2+]i的Fluo-3熒光強(qiáng)度流式細(xì)胞儀檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)圖3、圖4。薤白皂苷呈濃度依賴降低血小板內(nèi)游離[Ca2+]i，20、100 μmol/L薤白皂苷干預(yù)血小板內(nèi)游離[Ca2+]i濃度顯著低于AA刺激生理鹽水干預(yù)血小板內(nèi)游離[Ca2+]i濃度（P<0.05）。結(jié)果見(jiàn)表3。

2.4 薤白皂苷對(duì)血小板和中性粒細(xì)胞間結(jié)合的影響

薤白皂苷抑制血小板和中性粒細(xì)胞結(jié)合的玫瑰花環(huán)率呈濃度依賴性，見(jiàn)表3。薤白皂苷和阿司匹林明顯降低IC50，分別為2.7、25.6 μmol/L的血小板與中性粒細(xì)胞的結(jié)合。

2.5 薤白皂苷對(duì)活化中性粒細(xì)胞上清液誘導(dǎo)血小板聚集的影響

薤白皂苷顯著抑制由fMLP激活的中性粒細(xì)胞誘導(dǎo)洗滌的血小板聚集，見(jiàn)表3。IC50為9.6 μmol/L，阿司匹林對(duì)fMLP激活的中性粒細(xì)胞誘導(dǎo)的血小板聚集無(wú)抑制作用。

3 討論

薤白中皂苷類化合物通過(guò)抗血小板聚集、抗氧化、降血脂參與冠狀動(dòng)脈粥樣硬化的整個(gè)過(guò)程。PAF、ADP和AA可引起血小板活化，并通過(guò)不同的途徑導(dǎo)致血小板聚集[8]。本研究結(jié)果顯示，薤白皂苷體外以濃度依賴方式抑制PAF、ADP和AA誘導(dǎo)的血小板聚集，給藥后60、120 min，薤白皂苷和阿司匹林對(duì)AA誘導(dǎo)的血小板聚集均有明顯的抑制作用，薤白皂苷也分別在給藥后60、120、180 min和60、120 min對(duì)ADP或PAF誘導(dǎo)的血小板聚集有明顯的抑制作用。有研究報(bào)道，血小板功能亢進(jìn)與血栓形成障礙相關(guān)[9]。而本研究表明，薤白皂苷對(duì)血小板聚集的抑制是非特異性的，可能對(duì)血栓形成過(guò)程有多靶點(diǎn)的抑制作用。

血小板凝血酶活化后，血小板選擇受體會(huì)迅速表達(dá)到細(xì)胞表面，并介導(dǎo)活化血小板與中性粒細(xì)胞的結(jié)合與黏附[10]。有研究報(bào)道，阿司匹林不抑制血小板選擇受體的表達(dá)，而會(huì)明顯抑制ADP刺激下的血小板釋放致密顆粒[11]。本研究結(jié)果顯示，阿司匹林可抑制血小板與中性粒細(xì)胞黏附，其機(jī)制可能為阿司匹林影響血小板表面其他黏附分子的繼發(fā)表達(dá)，降低血小板與中性粒細(xì)胞黏附。本研究結(jié)果顯示，薤白皂苷可顯著抑制血小板與中性粒細(xì)胞的結(jié)合，其IC50與阿司匹林相當(dāng)。研究發(fā)現(xiàn)，激活的血小板可增加中性粒細(xì)胞對(duì)外來(lái)信號(hào)的黏附，中性粒細(xì)胞聚集，溶酶體酶釋放，血小板衍生產(chǎn)物能促進(jìn)中性粒細(xì)胞趨化性、酶的釋放和吞噬作用并抑制氧化爆發(fā)[12]。另一方面，血小板與中性粒細(xì)胞的黏附參與血栓調(diào)節(jié)過(guò)程，中性粒細(xì)胞衍生的產(chǎn)物可促進(jìn)血小板聚集和血清素釋放，血栓形成也是由血小板-中性粒細(xì)胞相互作用介導(dǎo)[13]。臨床研究顯示，血栓形成性疾病患者血小板新生蓮花瓣數(shù)目明顯增加[11]。本研究結(jié)果表明，薤白皂苷能明顯抑制活化血小板與中性粒細(xì)胞結(jié)合的能力，可能有助于治療血栓栓塞性疾病。

活化的中性粒細(xì)胞上清液含有大量生物活性物質(zhì)，可影響血小板聚集、血栓形成和細(xì)胞內(nèi)外Ca2+的運(yùn)動(dòng)[14]。本研究結(jié)果顯示，阿司匹林對(duì)活化的中性粒細(xì)胞刺激的血小板聚集無(wú)影響，表明環(huán)氧合酶可能不直接參與中性粒細(xì)胞誘導(dǎo)的血小板聚集。有研究發(fā)現(xiàn)，毒性氧自由基、組織蛋白酶G、彈性蛋白酶和PAF是中性粒細(xì)胞依賴性血小板激活的介質(zhì)[10]。薤白皂苷對(duì)來(lái)自fMLP激活的中性粒細(xì)胞無(wú)細(xì)胞上清液誘導(dǎo)的血小板聚集呈濃度依賴性抑制，故薤白皂苷可能通過(guò)多個(gè)途徑抑制血小板-嗜中性粒細(xì)胞相互作用。

血小板內(nèi)[Ca2+]i的升高是血小板受外界不良刺激后受累范圍的第二信使，在血小板形狀發(fā)生變化、粘連、聚集時(shí)首先出現(xiàn)血小板內(nèi)鈣離子升高，[Ca2+]i又是血小板活化和血小板-中性粒細(xì)胞相互作用的重要介質(zhì)[15]。本研究結(jié)果顯示，AA誘導(dǎo)血小板內(nèi)[Ca2+]i遠(yuǎn)高于正常水平，即血小板處于明顯活化狀態(tài)，薤白皂苷濃度依賴性地降低AA刺激的血小板[Ca2+]i。表明薤白皂苷抑制細(xì)胞外鈣的流入和來(lái)自細(xì)胞外鈣的流出。減少細(xì)胞溶質(zhì)鈣是薤白皂苷抑制血小板聚集和血小板和中性粒細(xì)胞間相互作用的機(jī)制之一。

綜上，薤白皂苷體外和體內(nèi)均可抑制血小板聚集，降低血小板-中性粒細(xì)胞黏附，并抑制活化的中性粒細(xì)胞誘導(dǎo)的血小板聚集。由于其抗血小板作用和抑制血小板-中性粒細(xì)胞相互作用，可能為開(kāi)發(fā)血小板聚集類藥物提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

參考文獻(xiàn)：

[1] VON HUNDELSHAUSEN P， WEBER C. Platelets as immune cells：bridging inflammation and cardiovascular disease[J]. Circ Res，2007， 100（1）：27-40.

[2] LIEVENS D， ZERNECKE A， SEIJKENS T， et al. Platelet CD40L mediates thrombotic and inflammatory processes in atherosclerosis[J]. Blood，2010，116（20）：4317-4327.endprint

[3] 盛華剛.薤白的化學(xué)成分和藥理作用研究進(jìn)展[J].藥學(xué)研究，2013， 32（1）：42-44.

[4] 張占軍，王富花，曾曉雄.一種具有抑制細(xì)胞增殖的薤白多糖的分離及性質(zhì)[J].食品研究與開(kāi)發(fā)，2012，33（12）：178-183.

[5] 區(qū)文超，鐘赟，劉本榮，等.薤白皂苷化合物對(duì)CD40L表達(dá)及血小板中性粒細(xì)胞黏附的影響[J].廣東醫(yī)藥，2011，32（7）：833-835.

[6] CHEN P， LI F， HE B， et al. Effects of Geraniin on Platelet Aggre gation and Interactions between Platelets and Neutrophils[J]. Journal of Kunming Medical University，2012，33（5）：605-609.

[7] SHEN Z Q， WU L O， DUAN L， et al. Effect of polymorph-nuclear leukocytes on washed platelet aggregation[J]. Chin J Pathophysiol，2002，18（7）：801-803.

[8] PAPALAMBROS E， SIGALA F， TRAVLOU A， et al. P-selectin and antibodies against heparin-platelet factor 4 in patients with venous or arterial diseases after a 7-day heparin treatment[J]. J Am Coll Surg，2004，19（6）：69-77.

[9] CARON A， THEORET J F， MOUSA S A， et al. Antiplattelet effects of GPIIb/IIIa and P-selectin antagonism， platelet-activation， and binding to neutrophils[J]. J Cardio Pharmacol，2002，40：296- 306.

[10] OU W C， CHEN H F， ZHONG Y， et al. Inhibition of platelet activation and aggregation by furostanol saponins isolated from the bulbs of Alliums macrostemon Bunge[J]. Am J Med Sci，2012， 344（4）：261-267.

[11] HE P， ZHANG H， ZHU L， et al. Leukocyte-platelet aggregate adhesion and vascular permeability in intact micro vessels：role of activated endothelial cells[J]. Am J Physiol Heart Circ Physiol，2006，291（2）：591-599.

[12] VERMEHREN J， KAU A， GRTNER BC， et al. Differences between two real-time PCR-based hepatitis C virus（HCV） assays（Real Time HCV and Cocas Ampli Prep/Cobas Taq Man） and onesignal amplification assay （Versant HCV RNA 3.0） for RNA detection and quantification[J]. J Clin Microbiol，2008，46（12）：3880-3891.

[13] 朱欣佚，奚肇慶，張文曦.復(fù)方薤白膠囊抗內(nèi)皮細(xì)胞凋亡與信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的研究[J].南京中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報(bào)，2010，26（5）：359-361.

[14] XIE W， ZHANG Y， WANG N， et al. Novel effects of macrostemono- side A， a compound from Alliums macrostemon Bung， on hyperglycemia， hyperlipidemia， and visceral obesity in high-fat diet-fed C57BL/6 mice[J]. Eur J Pharmacol，2008，599（1/3）：159-165.

[15] HE X J， QIU F， SHOYAMA Y， et al. The active constituents from Gualou-xiebai-baijiu-tang part I：active saponins[J]. J Asian Nat Prod Res，2002，4（3）：189-196.

（收稿日期：2017-07-11）

（修回日期：2017-07-25；編輯：華強(qiáng)）endprint