沈趙赟++符勝光++楊愛(ài)東++吳中華++李素云++帥玉葉++唐普仁

摘要：目的 觀察加味千金葦莖湯對(duì)大氣細(xì)顆粒物致肺組織損傷大鼠腫瘤壞死因子-α（TNF-α）和核因子-κB（NF-κB）的影響，探討其可能的作用機(jī)制。方法 大鼠氣管滴注15 mg/kg細(xì)顆粒物生理鹽水混懸液造模，隔日1次，共3次。將32只Wistar大鼠隨機(jī)分為正常組、模型組和加味千金葦莖湯高、低劑量組，每組8只，給藥組每日給予相應(yīng)劑量藥物灌胃。ELISA檢測(cè)支氣管肺泡灌洗液TNF-α水平，免疫組化檢測(cè)肺組織NF-κB蛋白表達(dá)，光鏡下觀察大鼠肺組織病理變化。結(jié)果 與正常組比較，模型組大鼠肺泡灌洗液TNF-α含量及肺組織NF-κB蛋白表達(dá)顯著升高（P<0.01）；與模型組比較，加味千金葦莖湯低、高劑量組大鼠肺泡灌洗液TNF-α含量及肺組織NF-κB蛋白表達(dá)顯著降低（P<0.05，P<0.01）。病理觀察結(jié)果顯示，模型組較正常組小氣管內(nèi)、肺泡及肺間質(zhì)內(nèi)有大量細(xì)顆粒物沉著，肺泡及肺間質(zhì)內(nèi)可見(jiàn)大量吞噬細(xì)顆粒物的巨噬細(xì)胞并伴有較多中性粒細(xì)胞和淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)；加味千金葦莖湯高、低劑量組肺組織病理改變明顯輕于模型組，高劑量組炎癥反應(yīng)較輕，肺泡及肺間質(zhì)內(nèi)可見(jiàn)吞噬細(xì)顆粒物的巨噬細(xì)胞、少量中性粒細(xì)胞和淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)。結(jié)論 加味千金葦莖湯可能通過(guò)降低TNF-α含量、下調(diào)NF-κB蛋白表達(dá)，以減輕模型大鼠的肺組織損傷，對(duì)肺組織有保護(hù)作用。

關(guān)鍵詞：加味千金葦莖湯；細(xì)顆粒物；肺損傷；腫瘤壞死因子-α；核因子-κB；大鼠

DOI：10.3969/j.issn.1005-5304.2018.01.009

中圖分類號(hào)：R285.5 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A 文章編號(hào)：1005-5304（2018）01-0038-05

Effects of Modified Qianjin Weijing Decoction on TNF-α and NF-κB

in Rats with Lung Injury Induced by Particulate Matter

SHEN Zhao-yun， FU Sheng-guang， YANG Ai-dong， WU Zhong-hua， LI Su-yun， SHUAI Yu-ye， TANG Pu-ren Shanghai University of Traditional Chinese Medicine， Shanghai 201203， China

Abstract： Objective To investigate the protective effect of modified Qianjin Weijing Decoction （MQJWJD） on TNF-α and NF-κB in rats with lung injury induced by particulate matter； To discuss relevant mechanism of action. Methods A tracheal drip 15 mg/kg fine particles of saline solution was used to establish modeling， every other day， three times. Thirty-two Wistar rats were randomly divided into normal group， model group and MQJWJD high-dose and low-dose groups， with eight rats in each group. Medication groups were given relevant medicine for gavage. The level of TNF-α in bronchoalveolar lavage fluid （BALF） was measured by ELISA. The expression of NF-κB protein in lung tissues was measured by immunohistochemistry. The histopathology of the lung injury was observed by light microscope. Results Compared with normal group， the level of TNF-α and the expression of NF-κB protein in the model group were higher than those in the normal group （P<0.01）. Compared with model group， the level of TNF-α and the expression of NF-κB protein in MQJWJD low-dose and high-dose groups were lower than those in the model group （P<0.05， P<0.01）. Pathological observation showed that， compared with normal group， model group showed intratracheal， alveolar and interstitial bacteria within a large number of fine particles calm， alveolar and pulmonary interstitial visible large amounts of phagocytic fine particles of macrophages and accompanied by more neutrophilsendprint

基金項(xiàng)目：國(guó)家自然科學(xué)金面上項(xiàng)目（81673855）；國(guó)家中醫(yī)藥管理局重點(diǎn)學(xué)科項(xiàng)目（2009年）；上海市重點(diǎn)學(xué)科建設(shè)資助項(xiàng)目（S30301）；上海中醫(yī)藥大學(xué)第9批大學(xué)生科創(chuàng)資助項(xiàng)目（SHUTCM2016177）；上海中醫(yī)藥大學(xué)名師研究室項(xiàng)目（A1-Z173020711）；上海中醫(yī)藥大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院與曙光醫(yī)院院院合作項(xiàng)目（2015年）；上海中醫(yī)藥大學(xué)德育滲透課題（A1-60102009）

通訊作者：楊愛(ài)東，E-mail：aidongy@126.com

and lymphocyte infiltration； Lung tissue pathological changes were significantly lighter in MQJWJD high-dose and low-dose groups than the model group. MQJWJD high-dose group showed mild inflammation， alveolar and pulmonary interstitial visible phagocytic fine particles of macrophages， a small amount of neutrophils and lymphocyte infiltration. Conclusion MQJWJD can reduce the pulmonary injury in rats induced by particulate matter and has protective effects on the rat model through decreasing the levels of TNF-α and the expressions of NF-κB protein in injured lung tissues.

Keywords： modified Qianjin Weijing Decoction； particulate matter； pulmonary injury； TNF-α； NF-κB； rats

研究表明，大氣細(xì)顆粒物暴露與肺癌具有明顯的相關(guān)性，大氣中細(xì)顆粒物濃度每增加10 μg/m3，肺癌死亡率可增加15%～27%[1]。有文獻(xiàn)報(bào)道，顆粒物致肺損傷的機(jī)制之一是導(dǎo)致機(jī)體發(fā)生炎性損傷[2]。腫瘤壞死因子-α（TNF-α）是炎癥反應(yīng)中重要的啟動(dòng)因子，核因子-κB（NF-κB）是免疫調(diào)控信號(hào)通路中重要的轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子，二者在炎性反應(yīng)過(guò)程中起著重要作用。前期研究表明，加味千金葦莖湯能夠減輕慢性阻塞性肺疾病模型大鼠的肺組織損傷[3]。本研究進(jìn)一步觀察其對(duì)大氣細(xì)顆粒物致肺損傷模型大鼠肺組織NF-κB蛋白表達(dá)和支氣管肺泡灌洗液TNF-α含量的影響，探討其可能的作用機(jī)制。

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 動(dòng)物

清潔級(jí)Wistar雄性大鼠32只，7～9周齡，體質(zhì)量（184±11）g，上海西普爾-必凱實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司，動(dòng)物合格證號(hào)2008001664259。飼養(yǎng)于上海中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心清潔級(jí)飼養(yǎng)區(qū)，溫度（21±2）℃，相對(duì)濕度45%～50%，晝夜光照節(jié)律，自由攝食飲水，適應(yīng)性喂養(yǎng)1周。

1.2 藥物

加味千金葦莖湯（蘆根30 g，冬瓜子30 g，桃仁12 g，薏苡仁15 g，魚腥草20 g，蒲公英20 g），飲片均購(gòu)自北京同仁堂上海藥店責(zé)任有限公司，制成含2 g原藥材/mL的藥液，高溫高壓滅菌，4 ℃冷藏備用。

1.3 主要試劑與儀器

大氣細(xì)顆粒物，直徑（31.9±0.6）?m，美國(guó)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)與技術(shù)研究院，批號(hào)P1192006。TNF-α ELISA試劑盒，美國(guó)Immunowaw公司，批號(hào)D15A631；NF-κB p65免疫組化試劑盒，美國(guó)Santa Cruz公司，批號(hào)E0205。低溫冷凍離心機(jī)（美國(guó)Sigma），生物安全柜（美國(guó)Sigma），BH2顯微鏡（日本OLYMPUS）。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 分組、造模和給藥

按隨機(jī)數(shù)字表法將32只Wistar雄性大鼠分為正常組、模型組和加味千金葦莖湯高、低劑量組，每組8只。正常組氣管滴注1 mL/kg生理鹽水，其他組大鼠氣管滴注1 mL/kg細(xì)顆粒物生理鹽水混懸液（相當(dāng)于15 mg/kg細(xì)顆粒物），隔日1次，共3次[4]。加味千金葦莖湯高、低劑量組每日分別給予10 mL/kg和5 mL/kg加味千金葦莖湯藥液灌胃，正常組和模型組給予等體積蒸餾水，連續(xù)7 d。加味千金葦莖湯用藥量按人與動(dòng)物的體表面積換算[5]。

2.2 一般觀察

實(shí)驗(yàn)期間觀察所有大鼠精神狀態(tài)、活動(dòng)情況、皮毛光澤度、死亡情況等，每日記錄大鼠體質(zhì)量。

2.3 標(biāo)本采集

最后1次灌胃結(jié)束后24 h，大鼠腹腔注射25%烏拉坦（4 mL/kg）麻醉，腹主動(dòng)脈抽血處死。大鼠頸部氣管縱行切口，用剝離針逐層分離組織，最終暴露氣管，鈍性分離出雙肺組織。用眼科剪在支氣管上剪一小口，用灌洗針從剪開的小口處插入氣管，抽取3 mL生理鹽水灌洗支氣管2次，每次反復(fù)回抽3次，回收灌洗液置于離心管。每只大鼠收集支氣管肺泡灌洗液6 mL，用于TNF-α含量檢測(cè)，分裝后于-80 ℃冰箱保存。剖去肺部周圍組織，取右肺上葉，生理鹽水沖洗后置于10%甲醛溶液中固定，用于光鏡病理觀察及肺組織NF-κB蛋白表達(dá)免疫組化檢測(cè)。

2.4 肺泡灌洗液腫瘤壞死因子-α含量測(cè)定

取支氣管肺泡灌洗液，3000 r/min離心10 min，取上清液，ELISA測(cè)定肺泡灌洗液TNF-α含量，嚴(yán)格按照試劑盒說(shuō)明書操作。

2.5 肺組織核因子-κB蛋白表達(dá)測(cè)定endprint

采用IMS細(xì)胞圖像分析系統(tǒng)醫(yī)學(xué)圖像分析軟件，對(duì)免疫組化結(jié)果進(jìn)行圖像采集和定量分析。高倍鏡下每張切片隨機(jī)選擇不相重疊的3個(gè)視野，細(xì)胞核為藍(lán)色，NF-κB陽(yáng)性細(xì)胞為棕黃色。計(jì)算每例樣本蛋白染色陽(yáng)性面積率（陽(yáng)性細(xì)胞面積÷總面積）作為比較參數(shù)。

2.6 病理觀察

取1 cm×1 cm×0.3 cm右上肺組織，常規(guī)10%甲醛固定，逐級(jí)脫水，石蠟包埋，切片，漂洗，常規(guī)HE染色，光鏡下觀察組織變化。

3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS21.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以—x±s表示，多組間均數(shù)比較采用方差分析，組間兩兩比較采用LSD法。P<0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

4 結(jié)果

4.1 一般狀況

實(shí)驗(yàn)期間未見(jiàn)大鼠死亡。模型組較正常組大鼠染毒后出現(xiàn)呼吸急促、活動(dòng)減少、皮毛無(wú)光澤，加味千金葦莖湯低、高劑量組大鼠活動(dòng)較模型組明顯活躍。實(shí)驗(yàn)開始前，各組大鼠體質(zhì)量無(wú)顯著差異。實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，模型組較正常組大鼠體質(zhì)量顯著減輕（P<0.01）；與模型組比較，加味千金葦莖湯低、高劑量組大鼠體質(zhì)量顯著增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05，P<0.01）。結(jié)果見(jiàn)表1。

4.2 肺大體形態(tài)

肉眼觀察可見(jiàn)正常組雙肺呈淡粉紅色，質(zhì)軟，彈性好，未見(jiàn)異常；模型組雙肺呈暗紅色，明顯充血，表面可見(jiàn)片狀灰黑色瘀斑，彈性差，呈實(shí)變感；加味千金葦莖湯低劑量組雙肺表面呈紅色，輕微充血，可見(jiàn)散在灰白色小斑點(diǎn)，彈性略差；加味千金葦莖湯高劑量組雙肺表面呈淡紅色，可見(jiàn)少量散在灰白色小斑點(diǎn)，質(zhì)地較軟，彈性較好，未見(jiàn)充血、水腫等。結(jié)果見(jiàn)圖1。

4.3 加味千金葦莖湯對(duì)模型大鼠支氣管肺泡灌洗液腫瘤壞死因子-α含量的影響

與正常組比較，模型組大鼠肺泡灌洗液TNF-α含量顯著升高（P<0.01）；與模型組比較，加味千金葦莖湯低、高劑量組大鼠肺泡灌洗液TNF-α含量顯著降低（P<0.05，P<0.01）。結(jié)果見(jiàn)表2。

4.4 加味千金葦莖湯對(duì)模型大鼠肺組織核因子-κB蛋白表達(dá)的影響

與正常組比較，模型組大鼠肺組織NF-κB蛋白表達(dá)陽(yáng)性面積率顯著升高（P<0.01）；與模型組比較，加味千金葦莖湯低、高劑量組大鼠肺組織NF-κB蛋白表達(dá)陽(yáng)性面積率顯著降低（P<0.05，P<0.01）。結(jié)果見(jiàn)表3、圖2。

4.5 肺組織病理變化

正常組肺組織示正常小氣道上皮、肺泡上皮及肺泡壁毛細(xì)血管，未見(jiàn)細(xì)顆粒物沉著及炎癥細(xì)胞；模型組肺組織小氣管內(nèi)、肺泡及肺間質(zhì)內(nèi)有大量細(xì)顆粒物沉著，小氣道內(nèi)可見(jiàn)脫落的上皮及大量炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，肺泡及肺間質(zhì)內(nèi)可見(jiàn)大量吞噬細(xì)顆粒物的巨噬細(xì)胞并伴有較多中性粒細(xì)胞和淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)；加味千金葦莖湯低劑量組肺組織小氣道內(nèi)、肺泡及肺間質(zhì)內(nèi)可見(jiàn)吞噬細(xì)顆粒物的巨噬細(xì)胞，肺間質(zhì)內(nèi)可見(jiàn)中性粒細(xì)胞和淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)；加味千金葦莖湯高劑量組肺組織炎癥反應(yīng)較輕，肺泡及肺間質(zhì)內(nèi)可見(jiàn)吞噬細(xì)顆粒物的巨噬細(xì)胞，肺間質(zhì)內(nèi)可見(jiàn)少量中性粒細(xì)胞和淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)。結(jié)果見(jiàn)圖3。

5 討論

流行病學(xué)研究表明，大氣細(xì)顆粒物濃度升高與哮喘、肺炎、肺癌等呼吸系統(tǒng)疾病的發(fā)病率、死亡率呈正相關(guān)[6-8]。大氣細(xì)顆粒物屬于濁邪，其致肺損傷屬中醫(yī)學(xué)“咳喘”“肺萎”“肺脹”等范疇。針對(duì)細(xì)顆粒物致肺損傷“熱（毒）、痰、瘀”之病機(jī)，我們認(rèn)為治宜用清肺化痰活血法，方選加味千金葦莖湯。千金葦莖湯系唐代醫(yī)家孫思邈所創(chuàng)，原方由蘆根、冬瓜子、桃仁、薏苡仁組成，具清肺化痰、逐瘀排膿之效。研究表明，千金葦莖湯被廣泛應(yīng)用于治療大葉性肺炎、慢性支氣管炎急性發(fā)作、慢性阻塞性肺疾病、小兒過(guò)敏性咳嗽、小兒急性化膿性扁桃體炎等多種熱毒蘊(yùn)滯、痰瘀互結(jié)之證[9]。另有研究發(fā)現(xiàn)，魚腥草和蒲公英能減輕急性肺損傷（ALT）動(dòng)物模型肺組織的炎癥反應(yīng)，對(duì)ALT動(dòng)物模型具有一定的保護(hù)作用[10-11]。

研究表明，大氣細(xì)顆粒物導(dǎo)致的肺病理變化主要表現(xiàn)為炎性改變[12]。TNF-α主要由被激活的巨噬細(xì)胞產(chǎn)生，是ALT早期產(chǎn)生的促炎癥因子之一[13]。NF-κB是最重要的轉(zhuǎn)錄因子之一，廣泛存在于各種細(xì)胞胞漿內(nèi)，在炎癥、免疫應(yīng)答、細(xì)胞黏附以及抗細(xì)胞凋亡中起重要作用[14]，二者作為炎癥反應(yīng)發(fā)生早期的前炎癥因子能夠刺激肺上皮細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞及成纖維母細(xì)胞等細(xì)胞因子和黏附分子，進(jìn)而誘導(dǎo)中性粒細(xì)胞、單核細(xì)胞、巨噬細(xì)胞和多形核白細(xì)胞等的聚集，最終導(dǎo)致炎癥的發(fā)生[2]。姜瑞雪等[15]研究表明，隨著PM2.5濃度的增加，大鼠肺組織TNF-α的表達(dá)水平顯著增高。姜智海等[16]用大氣細(xì)顆粒物染毒于Ⅱ型肺泡上皮細(xì)胞后，發(fā)現(xiàn)Ⅱ型肺泡上皮細(xì)胞增加釋放的一系列與炎癥反應(yīng)和炎癥細(xì)胞增殖相關(guān)的細(xì)胞因子或與NF-κB表達(dá)相關(guān)。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，與正常組比較，模型組大鼠支氣管肺泡灌洗液TNF-α含量和肺組織NF-κB蛋白表達(dá)水平升高，模型組肺組織小氣管內(nèi)、肺泡及肺間質(zhì)內(nèi)有大量細(xì)顆粒物沉著，小氣道內(nèi)可見(jiàn)脫落的上皮及大量炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，肺泡及肺間質(zhì)內(nèi)可見(jiàn)大量吞噬細(xì)顆粒物的巨噬細(xì)胞并伴有較多中性粒細(xì)胞和淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)，表明大氣細(xì)顆粒物致大鼠肺損傷模型建立成功；與模型組比較，加味千金葦莖湯各劑量組肺組織病理改變減輕，支氣管肺泡灌洗液TNF-α含量和肺組織NF-κB蛋白表達(dá)明顯降低，提示加味千金葦莖湯能夠減輕大氣細(xì)顆粒物致大鼠肺損傷模型大鼠的肺組織損傷，對(duì)該模型肺組織具有保護(hù)作用，其機(jī)制可能與其降低TNF-α含量、下調(diào)NF-κB蛋白表達(dá)有關(guān)。

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（收稿日期：2017-04-30）

（修回日期：2017-05-14；編輯：華強(qiáng)）endprint