嚴(yán)國(guó)鴻++張玉琴++林雄++黃燕++翁淑琴++徐偉

摘要：目的 觀(guān)察雙藤痹痛凝膠膏劑對(duì)膠原誘導(dǎo)性關(guān)節(jié)炎（CIA）模型大鼠血漿炎性細(xì)胞因子和滑膜組織Toll樣受體4（TLR4）、髓樣分化因子88（MyD88）、核因子-κB（NF-κB）表達(dá)的影響，探討其相關(guān)作用機(jī)制。方法 大鼠尾部皮下注射膠原乳劑制作CIA模型。大鼠隨機(jī)分為正常組、模型組和雙藤痹痛凝膠高、低劑量組，ELISA檢測(cè)血漿腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、白細(xì)胞介素（IL）-1β及IL-6的含量，RT-PCR檢測(cè)滑膜組織TLR4、MyD88、NF-κB的mRNA表達(dá)，Western blot檢測(cè)滑膜組織TLR4、MyD88、NF-κB的蛋白表達(dá)。結(jié)果 與模型組比較，雙藤痹痛凝膠高、低劑量組大鼠血漿TNF-α、IL-1β及IL-6含量顯著降低，滑膜組織TLR4、MyD88、NF-κB mRNA和蛋白表達(dá)明顯降低。結(jié)論 雙藤痹痛凝膠膏劑可能是通過(guò)抑制炎癥反應(yīng)、調(diào)節(jié)滑膜組織TLR4/NF-κB信號(hào)通路相關(guān)靶點(diǎn)表達(dá)發(fā)揮抗炎作用。

關(guān)鍵詞：雙藤痹痛凝膠膏劑；膠原誘導(dǎo)性關(guān)節(jié)炎；Toll樣受體4；髓樣分化因子88；核因子-κB；大鼠

DOI：10.3969/j.issn.1005-5304.2018.01.010

中圖分類(lèi)號(hào)：R285.5 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A 文章編號(hào)：1005-5304（2018）01-0043-05

Effect of Shuangteng Bitong Cataplasm on Inflammatory Cytokines in Plasma and Relevant Factors of Rats with Collagen-induced Arthritis

YAN Guo-hong1， ZHANG Yu-qin2， LIN Xiong1， HUANG Yan1， WENG Shu-qin1， XU Wei2

1. Peoples Hospital Affiliated to Fujian University of Traditional Chinese Medicine， Fuzhou 300122， China；

2. School of Pharmacy， Fujian University of Traditional Chinese Medicine， Fuzhou 350108， China

Abstract： Objective To study the effect of Shuangteng Bitong Cataplasm on TLR4， MyD88 and NF-κB and inflammatory cytokines in rats with collagen-induced arthritis； To discuss relevant mechanism of action. Methods A CIA model was made by subcutaneous injection of collagen emulsion from rat tail. Rats were randomly divided into normal group， model group， Shuangteng Bitong Cataplasm high-dose and low-dose groups. The contents of TNF-α， IL-1β and IL-6 in plasma were evaluated by ELISA， and the expression levels of TLR4， MyD88 and NF-κB in synovial tissues were evaluated by RT-PCR and Western blot. Results Compared with the model group， the contents of TNF-α， IL-1β and IL-6 in serum decreased remarkably in the Shuangteng Bitong Cataplasm low-dose and high-dose group， and the expression levels of TLR4， MyD88 and NF-κB in synovial tissues decreased remarkably. Conclusion Shuangteng Bitong Cataplasm can inhibit inflammatory reaction and regulate the expressions of relevant factors in synovial tissues to realize the anti-flammatory effects.

Keywords： Shuangteng Bitong Cataplasm； collagen-induced arthritis； TLR4； MyD88； NF-κB； rats

類(lèi)風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎（rheumatoid arthritis，RA）是一種以各關(guān)節(jié)病變?yōu)橹?，同時(shí)伴多系統(tǒng)受累的慢性炎癥性的全身性自身免疫性疾病。其病理改變主要發(fā)生在關(guān)

基金項(xiàng)目：國(guó)家自然科學(xué)基金（81370096）；福建省科技廳引導(dǎo)性項(xiàng)目（2015Y0060）

通訊作者：徐偉，E-mail：xwfjlab@163.com

節(jié)，主要表現(xiàn)為關(guān)節(jié)腔積液、滑膜炎、炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)、微血管新生、血管翳的形成及軟骨和骨組織的破壞。目前RA的病因尚未完全闡明，一般認(rèn)為是多因素誘發(fā)機(jī)體自身免疫反應(yīng)而致病。Toll樣受體（TLRs）在免疫系統(tǒng)中發(fā)揮著重要的作用，能識(shí)別外源性病原相關(guān)分子模式及內(nèi)源性分子產(chǎn)生的組織損傷、炎癥反應(yīng)，通過(guò)跨膜結(jié)構(gòu)將病原相關(guān)分子刺激信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)入細(xì)胞內(nèi)，產(chǎn)生復(fù)雜的級(jí)聯(lián)信號(hào)反應(yīng)，導(dǎo)致核因子-κB（NF-κB）等轉(zhuǎn)錄因子活化，介導(dǎo)白細(xì)胞介素（IL）-1、IL-6及腫瘤壞死因子-α（TNF-α）等炎性介質(zhì)基因的表達(dá)，引起相應(yīng)炎癥介質(zhì)的合成和釋放，進(jìn)而趨化和激活嗜中性白細(xì)胞，活化淋巴細(xì)胞，啟動(dòng)先天和獲得性免疫。TNF-α、IL-1及IL-6等是RA炎癥過(guò)程中主要的破壞性細(xì)胞因子，抑制TNF-α、IL-1及IL-6活性對(duì)控制RA病情進(jìn)展有重要作用。雙藤痹痛凝膠膏劑是在福建中醫(yī)藥大學(xué)附屬人民醫(yī)院院內(nèi)制劑雙藤痹痛酊的基礎(chǔ)上研制而成的新型制劑，前期動(dòng)物實(shí)驗(yàn)顯示，其具有抑制膠原誘導(dǎo)性關(guān)節(jié)炎（collagen-induced arthritis，CIA）模型大鼠的足趾腫脹、改善關(guān)節(jié)組織病理學(xué)變化、降低CIA大鼠關(guān)節(jié)炎指數(shù)的作用[1]。本實(shí)驗(yàn)在前期研究的基礎(chǔ)上，從RA關(guān)節(jié)炎癥的重要信號(hào)傳導(dǎo)通路（TLR4/NF-κB信號(hào)通路）途徑入手，觀(guān)察雙藤痹痛凝膠膏劑對(duì)CIA大鼠血漿炎性因子及滑膜組織相關(guān)因子的影響，探討其相關(guān)作用機(jī)制。endprint

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 動(dòng)物

雄性Wistar大鼠40只，SPF級(jí)，鼠齡10～12周齡，體質(zhì)量（220±20）g，上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司，動(dòng)物許可證號(hào)SCXK（滬）2007-0005。飼養(yǎng)于福建中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心SPF級(jí)實(shí)驗(yàn)室，光暗周期12 h/12 h，溫度（25.0±0.5）℃，相對(duì)濕度50%～70%，大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后開(kāi)始實(shí)驗(yàn)。

1.2 藥物

雙藤痹痛凝膠膏劑（由雷公藤、青風(fēng)藤、穿山龍、甘草等組成，每貼8 cm×12 cm，含雷公藤甲素 246.59 μg，含青藤堿155.89 mg），福建中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，批號(hào)20140310；空白凝膠膏劑（NP700、卡波姆等水溶性高分子材料），福建中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，批號(hào)20140310-1。

1.3 主要試劑與儀器

完全弗氏佐劑（CFA）、不完全弗氏佐劑（IFA）、牛Ⅱ型膠原，美國(guó)Chondrex公司；TLR4、髓樣分化因子88（MyD88）和NF-κB一抗，Cell Signaling Technology；Trizol試劑（Invitrogen），RevertAidTM First Strand cDNA Synthesis Kit反轉(zhuǎn)錄試劑盒（Fermentas），DreamTaqTM Green PCR Master Mix（2X）試劑盒（Fermentas）。CS-1EAS型電子天平（北京市菲姆斯科技開(kāi)發(fā)公司），TD5A-WS臺(tái)式低速離心機(jī)（湘儀離心機(jī)儀器有限公司），C1000TM Thermal cycler PCR儀（美國(guó)Bio-RAD公司），ChemiDocTM XRS+核酸成像系統(tǒng)（美國(guó)Bio-RAD公司）。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 造模

參考文獻(xiàn)[2-3]方法建立CIA模型。將牛Ⅱ型膠原（2 mg/mL）與CFA等體積混合，研磨制成膠原乳劑。于大鼠尾部2 cm處皮下注射膠原乳劑0.2 mL/只，并于第7日在大鼠尾部3 cm處皮下注射牛Ⅱ型膠原與IFA等體積的混合乳液0.1 mL/只，進(jìn)行2次免疫。將關(guān)節(jié)炎指數(shù)評(píng)分>1的大鼠納入實(shí)驗(yàn)。

2.2 關(guān)節(jié)炎指數(shù)測(cè)定

大鼠初次免疫后第4日開(kāi)始（每隔3 d）觀(guān)察大鼠四肢關(guān)節(jié)病變程度。病變程度按0～4級(jí)評(píng)分法[1]評(píng)分，四肢關(guān)節(jié)炎指數(shù)之和代表每只大鼠關(guān)節(jié)炎指數(shù)，積分越高，關(guān)節(jié)癥狀越嚴(yán)重，最高分值為16分。評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)：0分，關(guān)節(jié)正常無(wú)紅腫；1分，趾關(guān)節(jié)紅腫；2分，趾關(guān)節(jié)和足趾腫脹；3分，踝關(guān)節(jié)以下的足爪腫脹；4分，包括踝關(guān)節(jié)在內(nèi)的全部足爪腫脹、關(guān)節(jié)嚴(yán)重變形。

2.3 分組及給藥

除正常組外，動(dòng)物初次注射膠原乳劑后第2日開(kāi)始，將雙藤痹痛凝膠膏劑貼于大鼠背部固定，每日1次（同一部位），連續(xù)28 d。其中模型組為空白凝膠膏劑，大小2 cm×3 cm；雙藤痹痛高、低劑量組分別給予3 cm×3 cm、1 cm×3 cm的雙藤痹痛凝膠膏劑。

2.4 血漿與滑膜組織的采集與處理

大鼠于最后一次給藥后，腹腔注射10%水合氯醛（1 mL/100 g）麻醉，腹主動(dòng)脈取血，收集大鼠新鮮血液約6 mL，室溫靜置1 h，3000 r/min離心15 min，將上清液移至Eppendorf管分裝，-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

處死大鼠后取右膝關(guān)節(jié)，沿膝關(guān)節(jié)正中縱行切開(kāi)皮膚，直至暴露以膝關(guān)節(jié)為中心約0.3 cm×0.3 cm 的區(qū)域，以有齒鑷提起髕骨。沿髕骨上緣向下切割直至股骨，再分別沿髕骨兩側(cè)向下分離至脛骨，此時(shí)即打開(kāi)了膝關(guān)節(jié)腔，可見(jiàn)由髕骨下緣向上有一層平滑光亮呈淡黃色的滑膜組織，用刀片完全剝離滑膜組織，并完整取下，投入液氮中保存，供指標(biāo)檢測(cè)。

2.5 ELISA檢測(cè)血漿腫瘤壞死因子-α、白細(xì)胞介素-1β和白細(xì)胞介素-6含量

取適量血漿樣本溶解后，根據(jù)TNF-α、IL-1β及IL-6試劑盒說(shuō)明書(shū)的實(shí)驗(yàn)步驟加入樣品、酶標(biāo)偶合液、顯色劑室溫孵育，反應(yīng)完全后加入終止液，于酶標(biāo)儀波長(zhǎng)450 nm處測(cè)定每孔的吸光度。

2.6 RT-PCR檢測(cè)滑膜組織Toll樣受體4、髓樣分化因子88和核因子-κB的mRNA表達(dá)

采用Trizol兩步法提取每只大鼠滑膜組織總RNA，每組10只。取總RNA 1 μg反轉(zhuǎn)錄成cDNA。反應(yīng)體系20 μL，擴(kuò)增條件為：95 ℃預(yù)變性4 min，94 ℃變性30 s，退火40 s，72 ℃延伸40 s，35個(gè)循環(huán)，72 ℃延伸10 min。PCR產(chǎn)物用1.5%瓊脂糖凝膠電泳后用凝膠成像分析系統(tǒng)進(jìn)行觀(guān)察及光密度掃描，以GAPDH基因?yàn)閮?nèi)參，各基因擴(kuò)增條帶的光密度值與各自?xún)?nèi)參的光密度值之比作為評(píng)價(jià)指標(biāo)。引物序列見(jiàn)表1。

2.7 Western blot檢測(cè)滑膜組織Toll樣受體4、髓樣分化因子88和核因子-κB的蛋白表達(dá)

滑膜組織加入RIPA裂解液后勻漿，10 000 r/min離心10 min，收集上清液，BCA法檢測(cè)其蛋白濃度，20 μL上樣，經(jīng)SDS-PAGE電泳分離，電轉(zhuǎn)至固相支持體PVDF膜上，分別加入一抗和二抗，發(fā)光試劑發(fā)光，成像。應(yīng)用Bio-Rad軟件對(duì)Western雜交蛋白區(qū)帶進(jìn)行積分光密度值分析。

3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS18.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以—x±s表示，組間比較采用方差分析。P<0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

4 結(jié)果

4.1 一般變化

初次免疫1周后大鼠關(guān)節(jié)無(wú)紅腫，活動(dòng)無(wú)明顯異常狀態(tài)出現(xiàn)。隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，造模組大鼠活動(dòng)和進(jìn)食量減少，毛發(fā)干枯，精神萎靡；后足趾關(guān)節(jié)開(kāi)始出現(xiàn)紅腫，逐步蔓延到尾部，少數(shù)可累及前肢，并且日趨嚴(yán)重，關(guān)節(jié)功能活動(dòng)障礙，不能正常行走；雙藤痹痛高、低劑量組大鼠上述癥狀明顯緩解，且背部連續(xù)給藥28 d未發(fā)現(xiàn)過(guò)敏反應(yīng)及皮損現(xiàn)象。endprint

4.2 雙藤痹痛凝膠膏劑對(duì)模型大鼠關(guān)節(jié)炎指數(shù)的影響

初次免疫后模型組大鼠各時(shí)點(diǎn)關(guān)節(jié)炎指數(shù)明顯升高；與模型組比較，第12日后雙藤痹痛低劑量組大鼠關(guān)節(jié)炎指數(shù)明顯降低（P<0.05，P<0.01）。結(jié)果見(jiàn)表2。

4.3 雙藤痹痛凝膠膏劑對(duì)模型大鼠血漿腫瘤壞死因子-α、白細(xì)胞介素-1β和白細(xì)胞介素-6含量的影響

與正常組比較，模型組大鼠血漿TNF-α、IL-1β和IL-6含量顯著升高（P<0.01）；與模型組比較，雙藤痹痛高劑量組大鼠血漿TNF-α、IL-1β和IL-6含量明顯降低（P<0.01），雙藤痹痛低劑量組大鼠血漿IL-1β和IL-6含量明顯降低（P<0.05，P<0.01），結(jié)果見(jiàn)表3。

注：與正常組比較，##P<0.01；與模型組比較，*P<0.05，**P<0.01

4.4 雙藤痹痛凝膠膏劑對(duì)模型大鼠滑膜組織Toll樣受體4、髓樣分化因子88和核因子-κB mRNA表達(dá)的影響

與正常組比較，模型組大鼠滑膜組織TLR4、MyD88、NF-κB mRNA表達(dá)均顯著升高（P<0.01）；與模型組比較，雙藤痹痛高劑量組大鼠滑膜組織TLR4、MyD88、NF-кB mRNA表達(dá)顯著降低（P<0.01），雙藤痹痛低劑量組大鼠滑膜組織TLR4、NF-кB mRNA表達(dá)顯著降低（P<0.05，P<0.01），結(jié)果見(jiàn)圖1。

4.5 雙藤痹痛凝膠膏劑對(duì)模型大鼠滑膜組織Toll樣受體4、髓樣分化因子88和核因子-κB蛋白表達(dá)的影響

與正常組比較，模型組大鼠滑膜組織TLR4、MyD88、NF-κB蛋白高度表達(dá)（P<0.01），陽(yáng)性表達(dá)條帶清晰；與模型組比較，雙藤痹痛高劑量組大鼠滑膜組織TLR4、MyD88、NF-κB蛋白表達(dá)顯著降低（P<0.01），雙藤痹痛低劑量組大鼠滑膜組織MyD88、NF-κB蛋白表達(dá)顯著降低（P<0.05，P<0.01）。結(jié)果見(jiàn)圖2。

圖2 各組大鼠滑膜組織TLR4、MyD88及NF-κB蛋白表達(dá)

5 討論

TLRs在免疫系統(tǒng)中發(fā)揮著重要的作用，能識(shí)別外源性病原相關(guān)分子模式及內(nèi)源性分子產(chǎn)生的組織損傷、炎癥反應(yīng)，通過(guò)跨膜結(jié)構(gòu)將病原相關(guān)分子刺激信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)入細(xì)胞內(nèi)，產(chǎn)生復(fù)雜的級(jí)聯(lián)信號(hào)反應(yīng)，導(dǎo)致NF-κB等轉(zhuǎn)錄因子活化，介導(dǎo)IL-1、IL-6及TNF-α等炎性介質(zhì)基因的表達(dá)，引起相應(yīng)炎癥介質(zhì)的合成和釋放，進(jìn)而趨化和激活中性粒細(xì)胞，活化淋巴細(xì)胞，啟動(dòng)先天和獲得性免疫；內(nèi)源性TLR配體被稱(chēng)為損傷相關(guān)分子模式，包括活化細(xì)胞和壞死細(xì)胞釋放的內(nèi)源性分子及細(xì)胞外基質(zhì)分子。多項(xiàng)研究表明，TLRs信號(hào)通路與RA的發(fā)病機(jī)理關(guān)系密切[4-5]。

NF-κB是一種常見(jiàn)的轉(zhuǎn)錄因子，炎癥反應(yīng)的核心調(diào)控因子。NF-κB由2類(lèi)亞基形成同源或異源二聚體，最常見(jiàn)的亞基組成形式為p65/p50或p65/p65。正常情況下，細(xì)胞內(nèi)外通路正、負(fù)反饋對(duì)NF-κB的活化精細(xì)調(diào)節(jié)使NF-κB的活化在適當(dāng)水平[6]。NF-κB未被激活時(shí)分布在細(xì)胞漿中，可以被炎癥因子（IL-1β、TNF-α等）、生長(zhǎng)因子或趨化因子等激活，通過(guò)1個(gè)或多個(gè)信號(hào)途徑使抑制性蛋白I-κB磷酸化、泛素化并進(jìn)一步降解，使NF-κB與I-κB解離，移位至胞核，與DNA上啟動(dòng)子區(qū)域相應(yīng)的靶基因位點(diǎn)結(jié)合，進(jìn)而啟動(dòng)一系列免疫相關(guān)基因如前炎癥介質(zhì)（如IL-1β、TNF-α、IL-6等）及一些炎性相關(guān)酶類(lèi)的轉(zhuǎn)錄程序，導(dǎo)致其表達(dá)增多，使大量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)于炎癥部位，從而引起或進(jìn)一步加重體內(nèi)炎癥反應(yīng)[7-8]。

有研究表明，NF-κB能促進(jìn)滑膜細(xì)胞的增殖并抑制其凋亡，導(dǎo)致滑膜增生肥厚，加重關(guān)節(jié)組織結(jié)構(gòu)的破壞[9]。RA患者滑膜組織NF-κB p65表達(dá)及活化水平均顯著高于正常對(duì)照組，IL-1β mRNA表達(dá)水平也高于正常組，并與NF-κB的活化水平呈正相關(guān)[10]。另有研究顯示，牛Ⅱ型膠原所致的CIA模型大鼠關(guān)節(jié)滑膜的NF-κB p65蛋白表達(dá)明顯高于正常對(duì)照組[11]。本研究結(jié)果表明，雙藤痹痛凝膠膏劑在一定劑量下可降低CIA大鼠血漿TNF-α、IL-1β及IL-6水平，降低CIA大鼠滑膜組織TLR4、MyD88、NF-κB的表達(dá)，提示雙藤痹痛凝膠膏劑可能通過(guò)抑制炎癥反應(yīng)、調(diào)節(jié)滑膜組織TLR4/NF-κB信號(hào)通路相關(guān)靶點(diǎn)蛋白表達(dá)發(fā)揮抗炎作用。

已有研究表明，雷公藤內(nèi)酯醇[12]、青藤堿[13]、穿山龍總皂苷[14]等均可抑制大鼠滑膜細(xì)胞增殖。雙藤痹痛凝膠膏劑是由多味中藥組成，含有成分較多，其作用機(jī)制可能與這些成分有關(guān)，有待今后進(jìn)一步研究。

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（收稿日期：2017-06-19）

（修回日期：2017-07-24；編輯：華強(qiáng)）endprint