姚麗琴++田明

摘要：目的 優(yōu)選從龍牙楤木藥材乙醇提取物中水解得皂苷元齊墩果酸的工藝。方法 采用Plackett-Burman設(shè)計聯(lián)用CCD效應(yīng)面法（方法1）與正交試驗設(shè)計（方法2）對龍牙楤木藥材中皂苷元齊墩果酸的水解工藝進(jìn)行優(yōu)選。方法1以皂苷元齊墩果酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)為因變量，水解時間、鹽酸濃度、料液比為自變量；方法2以皂苷元齊墩果酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)為因變量，以水解時間、水解溫度、鹽酸濃度、料液比為自變量。采用Design expert 8.0.6 Trial軟件進(jìn)行分析。結(jié)果 根據(jù)試驗結(jié)果并綜合考慮實際生產(chǎn)情況，方法1確定的最佳工藝為加15～18倍量10%～12%鹽酸回流水解45～70 min，方法2確定的最佳工藝為加15倍量10%鹽酸回流水解60 min。結(jié)論 2種方法優(yōu)選的最佳工藝所得齊墩果酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)相差不大，但方法1直觀方便、精密度和重復(fù)性高、可預(yù)測性好。

關(guān)鍵詞：Plackett-Burman設(shè)計；CCD效應(yīng)面法；正交設(shè)計；龍牙楤木；齊墩果酸；水解工藝

DOI：10.3969/j.issn.1005-5304.2018.01.013

中圖分類號：R284.2 文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A 文章編號：1005-5304（2018）01-0059-05

Technology Optimization of Hydrolyzing Aralia Saponins from Alcohol Extracts of Aralia elata

YAO Li-qin， TIAN Ming

Key Laboratory of Chinese Materia Medica， Heilongjiang University of Chinese Medicine， Harbin 150040， China

Abstract： Objective To optimize process of hydrolyzed oleanolic acid from Aralia elata medicinal alcohol extract. Methods Plackett-Burman combined with CCD response surface design method （method 1） and orthogonal experimental design method （method 2） were used to optimize process of hydrolyzed oleanolic acid from Aralia elata medicinal alcohol extract. In method 1， the content of oleanolic acid was the dependent variable， and the hydrolysis time， the hydrochloric acid concentration， and the ratio of material to liquid were set as the independent variables； In method 2， the content of oleanolic acid was the dependent variable， and the hydrolysis time， hydrolysis temperature， the hydrochloric acid concentration， and the ratio of material to liquid were set as the independent variables. Design expert 8.0.6 Trial software was used to analyze the data. Results Considering the actual production situation， method 1 determined the optimum process was to add 15–18 times the amount of 10% to 12% hydrochloric acid， reflux hydrolysis 45–70 min； method 2 determined the optimum process was 15 times the amount of 10% hydrochloric acid， reflux hydrolysis 60 min. Conclusion By comparing method 1 and method 2， the optimum process was selected， and the difference of the content of oleanolic acid is not great. However， the former is more intuitive and convenient， with high precision repeatability， and predictability.

Keywords： Plackett-Burman design； central composite design response surface methodology； orthogonal design； Aralia elata； oleanolic acid； hydrolysis technology

龍牙楤木Aralia elata（Miq.）Seem.又稱遼東楤木，是近年來國內(nèi)外研究頻繁的食藥材[1-2]，藥用部位主要是根皮、莖皮及葉，有效成分總皂苷可達(dá)7.0%以上[3-4]，研究表明，其主要含楤木皂苷A、B、C等140余種，其苷元多為齊墩果酸[5]，通過水解皂苷可endprint

通訊作者：田明，E-mail：326080371@qq.com

以得到大量皂苷元齊墩果酸，具有護(hù)肝、解毒、降糖、降脂、治療胃潰瘍、抗炎、抗HIV病毒、抗癌、抗氧化、抗突變、利尿等藥理作用[6]。齊墩果酸是一種五環(huán)三萜類化合物，結(jié)構(gòu)復(fù)雜，人工合成繁瑣，依賴于植物中提取的天然產(chǎn)物。目前尚無有關(guān)龍牙楤木先醇提取總皂苷再水解得到齊墩果酸的含量測定及其水解工藝的研究報道。本研究旨在優(yōu)化龍牙楤木藥材中齊墩果酸的提取工藝，為該植物資源的開發(fā)利用提供依據(jù)。

Plackett-Burman設(shè)計聯(lián)用CCD效應(yīng)面法基于非線性模型設(shè)計，以直觀、方便、精度高和預(yù)測性強著稱。目前國內(nèi)在藥學(xué)制劑工藝優(yōu)化和處方篩選過程中應(yīng)用比較成熟的方法為均勻設(shè)計和正交試驗設(shè)計方法。本研究分別采用正交設(shè)計和Plackett-Burman設(shè)計聯(lián)用CCD效應(yīng)面法，優(yōu)化龍牙楤木藥材中皂苷元齊墩果酸的水解工藝，并分析這2種試驗設(shè)計方法的差異性，為不同設(shè)計方法應(yīng)用于優(yōu)化中藥提取工藝中的可行性提供依據(jù)。

1 儀器與試藥

賽默飛UltiMate 3000型高效液相色譜儀（美國賽默飛世爾廠家），F(xiàn)Z102型粉碎機（北京巖征實驗儀器有限公司），JD1000-2電子天平（上海卓沈陽龍騰電子稱量儀器有限公司），AB204-N電子分析天平（梅特勒-托利多儀器上海有限公司）。

供試樣品于2016年2月采自黑龍江通河縣清河林業(yè)局，原藥材經(jīng)黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院王振月教授鑒定為龍芽楤木Aralia elata（Miq.）Seem.的根皮及莖皮，置陰涼處，通風(fēng)干燥后備用。齊墩果酸對照品（中國食品藥品檢定研究院，純度98.26%，批號MUST-16070406）；乙醇、鹽酸等均為分析純，乙腈為液相色譜純，水為去離子超純水。

2 方法與結(jié)果

2.1 齊墩果酸含量測定

2.1.1 色譜條件

ZORBAX SB-C18色譜柱（255 mm×4.6 mm，5 ?m），流動相為乙腈-水（90∶10），檢測波長210 nm；流速1.0 mL/min，柱溫20 ℃，進(jìn)樣量10 ?L。理論塔板數(shù)按齊墩果酸計算應(yīng)不低于4000。色譜圖見圖1。表明在此色譜條件下無干擾峰，專屬性強[7]。

2.1.2 溶液的制備

取干燥藥材適量，粉碎，取約200 g，加80%乙醇加熱回流提取2次，第1次加8倍量提取1.5 h，第2次加6倍量提取1 h，合并提取液，過濾，濾液減壓回收乙醇至無醇味后，濃縮至50 mL，作為貯備液（即龍牙楤木粗皂苷）。取貯備液1 mL，按各水解工藝水解后抽濾，50～60 ℃低溫干燥（鹽酸遇熱揮發(fā)，而且不用去除酸液[8]），加熱甲醇適量使溶解，轉(zhuǎn)移至25 mL量瓶中，并加甲醇稀釋至刻度，搖勻，定容，即得供試品溶液。

取齊墩果酸對照品適量，精密稱定，加甲醇制成每1 mL含0.5 mg的溶液，即得對照品溶液。

A

B

C

注：A.對照品；B.供試品；C.溶劑（甲醇）

圖1 龍芽楤木藥材醇提取物中齊墩果酸HPLC圖

2.1.3 線性關(guān)系考察

精密吸取齊墩果酸對照品溶液6、8、10、12、14、16 ?L，按上述色譜條件進(jìn)行測定，以對照品進(jìn)樣量（?g）為橫坐標(biāo)，峰面積積分值為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，計算得回歸方程Y=9.088 9X-1.632 5，r=0.999 9，齊墩果酸在3～8 ?g范圍內(nèi)與峰面積積分值具有良好的線性關(guān)系。

2.2 Plackett-Burman試驗設(shè)計聯(lián)用CCD效應(yīng)面法優(yōu)選水解工藝

2.2.1 Plackett-Burman試驗設(shè)計

選取對齊墩果酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)影響較大的水解方法（A）、酸濃度（B）、料液比（C）、水解溫度（D）、水解次數(shù)（E）、水解時間（F）為考察因素[9-10]，并設(shè)計3個空白因素，共進(jìn)行9次試驗。根據(jù)預(yù)試驗結(jié)果，確定每個因素2個水平。用Design expert 8.0.6 Trial軟件設(shè)計試驗并進(jìn)行數(shù)據(jù)處理[11]，Plackett-Burman設(shè)計因素水平見表1。

2.2.2 Plackett-Burman試驗結(jié)果及分析

按表1設(shè)計安排進(jìn)行12次試驗，每個試驗重復(fù)2次，分別測定齊墩果酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)。齊墩果酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)（%）=每1 mL龍牙楤木粗皂苷中齊墩果酸含量×稀釋倍數(shù)（50）÷龍牙楤木藥材取樣量×100%。取其平均數(shù)作為響應(yīng)值。運用Design expert 8.0.6 Trial軟件對各因素進(jìn)行顯著性分析，P<0.05表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。響應(yīng)值測定結(jié)果見表2，各因素顯著性分析結(jié)果見表3。

由表2、表3可知，各因素對響應(yīng)值（齊墩果酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)）影響大小順序為酸濃度>料液比>水解方法>水解時間>水解溫度>水解次數(shù)。其中酸濃度對齊墩果酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)有顯著影響（P<0.05）；雖然水解方法的影響稍大于水解時間，但是發(fā)現(xiàn)用硫酸水解后的龍牙楤木粗皂苷在干燥時易碳化，損毀化學(xué)結(jié)構(gòu)，且影響色澤，因此選鹽酸水解方法。此結(jié)論可為下一步CCD效應(yīng)面設(shè)計試驗提供可靠依據(jù)。

2.2.3 CCD效應(yīng)面試驗設(shè)計

根據(jù)“2.2.2”項下結(jié)果，選取酸濃度（X1）、料液比（X2）、水解時間（X3）為考察因素，每個試驗重復(fù)2次，分別測定齊墩果酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)，取其平均數(shù)作為響應(yīng)值，優(yōu)選水解工藝。CCD效應(yīng)面設(shè)計因素水平見表4，CCD效應(yīng)面試驗安排與結(jié)果見表5。

使用Statistica軟件對表5數(shù)據(jù)進(jìn)行多元線性和非線性擬合。多元線性回歸方程：Y=3.69+0.25X1+0.13X2+0.11X3，經(jīng)F檢驗，r=0.308 3，P=0.043 1，復(fù)相關(guān)系數(shù)較低，擬合度差，預(yù)測性差，因此線性模型不適合。多元非線性回歸方程：Y=4.08+0.25X1+0.13X2+0.11X3-0.12X1X2-0.24X2X3-0.20X1X3-0.31X12-0.12X22-0.13X32。經(jīng)t檢驗，模型方程具有顯著性（P<0.05）；r=0.986 6，表明該模型擬合良好，鹽酸濃度、料液比與提取時間交互作用顯著；預(yù)測系數(shù)為0.892 3，表明該模型具有較好的實際預(yù)測能力。響應(yīng)面圖見圖2～圖4。在圖上選取較佳水解工藝范圍：X1為10%～12%，X2為15～20倍，X3為45～70 min。根據(jù)Design expert 8.0.6軟件分析結(jié)果并綜合考慮實際生產(chǎn)情況，選取龍牙楤木最佳水解工藝為加15倍量10%鹽酸水解60 min。endprint

2.2.4 水解工藝驗證試驗

按優(yōu)選出的水解工藝進(jìn)行3次驗證試驗，比較齊墩果酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)的預(yù)測值與真實值。結(jié)果預(yù)測值為4.16%，真實值為（4.18±0.15）%，RSD=0.24%，預(yù)測值與真實值的偏差為-0.48%。

2.3 正交試驗設(shè)計優(yōu)選龍牙楤木粗皂苷水解工藝

根據(jù)預(yù)試驗，選取鹽酸濃度（A）、料液比（B）、水解時間（C）、水解溫度（D）為考察因素，每個因素選3個水平，以齊墩果酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)為評價指標(biāo)，采用L9（34）正交表安排試驗，優(yōu)選適宜的水解工藝。正交試驗因素水平見表6，試驗結(jié)果見表7，方差分析見表8。

由表7、表8可知，各因素對龍牙楤木提取物經(jīng)鹽酸水解后皂苷元齊墩果酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)影響的順序為A>B>C>D，考慮實際生產(chǎn)中的水解效率、能耗、生產(chǎn)成本等諸多因素，需對水解工藝進(jìn)行綜合評價，最終確定水解工藝為A2B2C2D3，即加15倍量10%鹽酸100 ℃回流水解1 h。

根據(jù)最終優(yōu)選出的水解工藝進(jìn)行3次驗證試驗，結(jié)果齊墩果酸平均質(zhì)量分?jǐn)?shù)為4.26%，RSD=1.85%。

3 討論

Plackett-Burman設(shè)計是基于因素間無交互影響時，優(yōu)選因素主效應(yīng)而進(jìn)行的多因素高、低2個水平的試驗設(shè)計；CCD效應(yīng)面設(shè)計是基于五水平的二次式試驗設(shè)計，是由二水平析因設(shè)計加軸點及中心點組成，該設(shè)計具有可旋轉(zhuǎn)性，因此試驗精密度高。兩設(shè)計聯(lián)用，集數(shù)學(xué)與統(tǒng)計學(xué)為一體，能快速有效地篩選最佳工藝。正交試驗設(shè)計是國內(nèi)比較成熟的試驗設(shè)計方法，雖可以滿足一般試驗的需求，在試驗處理時能夠取得佳點，但是試驗緊密度不夠高，建立的數(shù)學(xué)模型預(yù)測性較差。

迄今國內(nèi)關(guān)于龍牙楤木中皂苷元齊墩果酸含量測定的文獻(xiàn)報道較少[7，12]，且得率低。本研究先用乙醇溶媒提取龍牙楤木，得到粗皂苷，再對粗皂苷進(jìn)行鹽酸水解得皂苷元齊墩果酸工藝進(jìn)行了較為徹底的試驗研究，2種優(yōu)選水解工藝中龍牙楤木的質(zhì)量分?jǐn)?shù)均較高，均不低于4.0%，比傳統(tǒng)工藝[13]得率高2.55倍。經(jīng)比較發(fā)現(xiàn)，Plackett-Burman聯(lián)用CCD效應(yīng)面法工藝所得齊墩果酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)與正交試驗設(shè)計工藝結(jié)果差異不大，但前者試驗可預(yù)測性優(yōu)于后者，而且前者重復(fù)性（RSD=0.24%）較后者（RSD=1.85%）明顯提高。試驗結(jié)果顯示，在2種工藝優(yōu)選中鹽酸濃度均為主要影響因素（P<0.05）。預(yù)試驗也考察了超聲法與回流法的優(yōu)劣，發(fā)現(xiàn)回流法效果優(yōu)于超聲法。通過不同試驗設(shè)計及其比較，優(yōu)選出了龍牙楤木醇提取物可穩(wěn)定水解皂苷元齊墩果酸的最佳條件。

目前，龍牙楤木的研究主要集中在化學(xué)成分和藥理研究2個方面[14-17]，其開發(fā)利用主要集中在總皂苷藥理作用及提取的層面上，而對單體化合物開發(fā)利用極少，希望通過對各單體化合物相關(guān)藥理作用的物質(zhì)基礎(chǔ)和作用機制研究，為龍牙楤木的深度開發(fā)利用提供依據(jù)。

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（收稿日期：2017-08-09）

（修回日期：2017-08-30；編輯：陳靜）endprint