綜述 審校

近年來，甲狀腺結節(jié)發(fā)病率逐年上升，應用高分辨率超聲（ultrasound，US）篩查其在成人中的發(fā)病率高達68%［1］。引起發(fā)病率上升的原因是多方面的，有研究提出US診斷設備的不斷普及發(fā)展，高分辨率US及其他影像工具廣泛應用于甲狀腺是大量結節(jié)被檢出的重要因素［2］。雖然，甲狀腺結節(jié)發(fā)病率較高，但惡性結節(jié)比率卻較低，為1.6%～12%［3］。US是甲狀腺結節(jié)篩查與術前診斷的最佳影像學手段［2］，多個專業(yè)的學術組織及多篇文獻均認為甲狀腺結節(jié)的超聲特征較為廣泛［4］。因此，結節(jié)性質的確定往往需要超聲引導下細針穿刺細胞學檢查（fine needle aspiration biopsy，FNAB）。FNAB是甲狀腺結節(jié)術前良惡性鑒別診斷的最基本也是最佳手段［5］。目前，甲狀腺結節(jié)細胞病理學多采用Bethesda報告系統(tǒng)，雖然大樣本病例數據研究［6-8］支持Bethesda系統(tǒng)具有很好的組間一致性，89%～95%的樣本取材滿意，其中55%～74%判斷為良性病變，2%～5%判斷為惡性病變。但仍然有近30%的病變難以得出確切的判斷［4］，其中包括意義不明確的非典型病變（AUS）或是2%～18%非典型的濾泡性腫瘤（FLUS），2%～25%濾泡性腫瘤，1%～6%可疑惡性（suspicious for malignancy，SUSP）［8-9］。近年來，甲狀腺結節(jié)細針穿刺（fine needle aspiration，FNA）分子標志物檢測的出現為解決上述問題提供了一種新的特異性的輔助診斷方法［10］。目前研究較多的分子標志物主要為BRAF基因突變、RAS基因突變、RET/PTC基因重排和PAX8/PPARγ基因重排等；以及使用免疫組織化學（immunohistochemistry，IHC）檢測的半乳糖凝集素3（galectin-3，Gal-3）、細胞角蛋白19（cytokeratin-19，CK-19）、人類骨髓內皮細胞（human bone marrow endothelialcell-1，HBME-1）。本文對FNA分子標志物目前的一些研究進展進行綜述。

1 突變和重排基因

1.1 BRAF基因突變

BRAF基因位于第7號染色體，是RET-RAS的下游信號分子，通過激活絲裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinases，MAPK）通路和抑制促凋亡因子BIM，導致細胞異常增殖和分化。BRAF基因的致癌性轉換是甲狀腺乳頭狀癌（papillary thyroid cancer，PTC）最常見的遺傳性事件，約占45%［11］，在低分化甲狀腺癌（thyroid cancer，TC）和未分化甲狀腺癌（anaplastic cancer，ATC）中，分別占 33%和 45%［12］。90%以上的突變發(fā)生在15號外顯子的1 799密碼子上［11］，發(fā)生從胸腺嘧啶至腺嘌呤的顛換，導致殘基600（V600E）中谷氨酸替代為纈氨酸。有報道［13］提示在甲狀腺良性結節(jié)與甲狀腺正常組織中BRAF基因突變并不存在，其是PTC特異性的基因突變類型［13］，有著強大的致癌作用。有研究［14］表明，對于腺外侵犯、淋巴結轉移和分期較高等與PTC復發(fā)、死亡有關的因素，均與BRAF基因突變密切相關。Patel等［15］研究證明即使在Ⅰ期PTC中，BRAF基因突變與其復發(fā)也有較顯著的關系。高柱狀細胞亞型（tall cell variant，TCV）是PTC發(fā)生BRAF基因突變最為常見的病理亞型，而濾泡型甲狀腺乳頭狀癌（follicular variant of papillary thyroid carcinoma，FVPTC）較為少見。BRAF基因突變還可引起甲狀腺激素合成及碘代謝相關基因的表達下降［16］，導致鈉碘轉運體（sodium iodide symporter，NIS）的失調［14］，這可能與部分TC及其轉移病灶放射性碘攝取能力喪失相關。這表明BRAF基因突變也可作為患者的預后評價指標［17］。BRAF基因突變對TC的診斷特異度為＞99%［18］，尤其適用于FNAB診斷不能確定的情況，并提高其準確性［19］。一項包含了 47 項研究的薈萃分析顯示［20］，BRAFV600E在FNA穿刺物中的檢測率為52%（39%～64%）；在FNAB結果不確定組中，BRAF基因突變對惡性腫瘤的靈敏度僅為30%；但是，在可疑惡性組中為52%。可見，BRAF基因突變對于PTC的診斷靈敏度較低，特異度較高。此方法有其局限性：1）靈敏度較低［21］；2）BRAFV600E突變僅與PTC相關，與其他病理類型甲狀腺癌不相關［22］。

1.2 RAS基因突變

RAS家族成員包括HRAS、KRAS和NRAS，編碼3種不同的膜相關鳥苷酸結合調節(jié)蛋白，主要影響生長因子受體信號通路，參與調節(jié)細胞的生長和分化。激活后，RAS釋放GDP，GDP與GTP結合，進而增加MAPK通路和磷脂酰肌醇3-激酶/蛋白激酶B（PI3K/AKT）信號通路的轉導［23］，從而導致腫瘤形成。RAS基因突變是分化型甲狀腺癌（differentiated thyroid carcinoma，DTC）中第二個常見的遺傳性事件［11］，主要存在甲狀腺濾泡癌（follicular thyroid carcinoma，FTC）和FVPTC（40%～50%）中［24］，尤其常見于缺碘地區(qū)，而在典型的PTC（10%）中較少見［25］。同時，RAS基因突變也可見于20%～40%濾泡性腫瘤（follicular adenoma，FA）［12］，然而RAS基因突變陽性的FA是否更有可能進展為癌癥仍不清楚，因此不應單獨檢測RAS基因突變預測甲狀腺腫瘤的惡性風險［26］?？梢?，RAS基因的突變反映了甲狀腺腫瘤形成過程中的早期事件。已有研究證明，RAS基因突變的FTC患者更可能存在遠處轉移和擁有更高的死亡率［27-28］。一項薈萃分析顯示［29］，在FNAB診斷不能確定的情況下，FNA穿刺物RAS基因突變對惡性腫瘤的靈敏度為34.3%，特異度為93.5%。目前對FNA穿刺物應用RAS基因突變進行診斷性檢測尚有爭議：1）診斷難點為良性濾泡性腺瘤或增生與分化良好的濾泡性癌的鑒別；2）RAS基因突變可能誘發(fā)腺瘤或增生向甲狀腺濾泡性癌的轉變［24］。

1.3 RET/PTC基因重排

RET原癌基因在正常甲狀腺組織中濾泡旁C細胞高表達，并編碼一種細胞膜受體酪氨酸激酶。目前，已知的RET/PTC基因重排類型有13種，所有的形式均由3′部分的RET基因和5′部分不同的基因所融合。TC中最常見的重排類型是RET/PTC1和RET/PTC3，前者由H4（CCDC6）-RET融合而成，與高分化型有關，并且預后良好，而后者由NCOA4（RFG）-RET融合形成，與侵襲性腫瘤關系較密切［30］。RET原癌基因激活可導致甲狀腺濾泡細胞的惡變，可引起MAPK下游通路的持續(xù)激活，并增強信號轉導。RET/PTC基因重排不僅存在于幾乎所有的家族性甲狀腺髓樣癌（medullary thyroid carcinoma，MTC）、部分散發(fā)性MTC以及部分PTC中，也存在于甲狀腺良性結節(jié)中［31］。但涉及大量腫瘤細胞的RET/PTC基因重排對PTC而言具有特異性。只要有高質量RNA，通過逆轉錄PCR就可以在FNA穿刺物中檢測到RET/PTC重排。Ferraz等［32］證實了從常規(guī)FNA涂片中檢測RET/PTC重排的可行性。RET/PTC基因重排在PTC的FNA穿刺物中發(fā)生率為5%～35%，致使這種突變不適于單獨篩查甲狀腺癌［23］。并且，Wang等［33］研究發(fā)現，RET/PTC基因重排在中國人群PTC中發(fā)生率較低，與年齡相關（年齡越大發(fā)生率越低）；而且RET/PTC1和RET/PTC3均與不同的臨床病理特征有關，但與淋巴結轉移無關。Rodrigues等［34］綜合了95篇有關FNA樣本分子標志物的文獻，顯示FNA穿刺物中RET/PTC重排靈敏度為18.20%，特異度為88.73%。

1.4 PAX8/PPARγ基因重排

PAX8/PPARγ基因是由配對盒基因8（paired box 8，PAX8）與過氧化物酶增殖物激活受體（peroxisome proliferator activated receptor gamma，PPAR）γ融合而成，并被認為是FTC最常見的融合基因［35］。PAX8/PPARγ基因重排在FTC中陽性率為30%～35%、FVPTC中為38%，也可見于一些FA（2%～13%）中［36］，因此其不應單獨用于診斷甲狀腺惡性腫瘤。PAX8/PPARγ基因重排會引起細胞的過度增殖和分化，該基因陽性FTC傾向于發(fā)生在具有血管侵襲特征的年輕患者中［37］。Chia等［38］的研究中卻發(fā)現，FTC的PAX8/PPARγ陽性率僅11.1%，與以往西方人群中的統(tǒng)計數據差異較大，可能是由于種族及地區(qū)差異所致。與RAS陽性FA相似，PAX8/PPARγ陽性的FA可能實際上表示原位癌（浸潤前的FTC）。PAX8/PPARγ基因重排可通過逆轉錄PCR或FISH分析進行準確的檢測。因此，若在濾泡性腫瘤的FNA穿刺物中證實存在該改變，在病理診斷時一定要更仔細地檢查是否存在包膜血管浸潤。Rodrigues等［34］研究顯示FNA穿刺物中PAX8/PPARγ重排特異度為20%，靈敏度為100%。

2 免疫組織化學標志物

IHC已被廣泛用于臨床試驗，理論上是鑒別甲狀腺結節(jié)良惡性的理想方法之一。雖然，目前研究的IHC診斷標志物很多，但可應用于FNA標本的較少。盡管各研究中標志物的靈敏度及特異度并不穩(wěn)定，但其可作為診斷良惡性甲狀腺結節(jié)的輔助方法［39］。

2.1 Gal-3

Gal-3是分化良好的TC最準確的獨立標志物，也是目前應用最廣泛的標志物之一［40］。Gal-3是一種參與細胞生長、黏附、分化、腫瘤進展和凋亡的內源性凝集素，其在TC細胞核和細胞質中顯色［41］。Gal-3在FNA樣本中區(qū)分甲狀腺良惡性腫瘤方面的潛在診斷價值已在一項大型前瞻性國際多中心研究［42］中被證明，其在鑒別甲狀腺良惡性腫瘤中的靈敏度、特異度、陽性預測值和診斷準確性分別為99%、98%、92%和99%，這表明Gal-3表達分析是有效且可靠的。另一項多中心研究［43］顯示，Gal-3在應用FNA樣本區(qū)分FTC和FA中靈敏度、特異度、陽性預測值、陰性預測值以及精確度分別為78%、93%、82%、91%和88%。Gal-3在PTC的FNA樣本中同樣強烈表達［44］。此外，淋巴結反應性增生和轉移之間Gal-3表達有顯著性差異［45］，然而Gal-3在轉移病灶中的表達比原發(fā)病灶低。Gal-3表達與TC預后因素之間也有顯著相關性，FNA樣本中無Gal-3表達與PTC的早期階段（即低侵襲性）和淋巴結轉移較少相關［46］。Gal-3檢測并不能代替?zhèn)鹘y(tǒng)的FNAB檢查，但是可用于不確定的濾泡性腫物的補充診斷。

2.2 HBME-1

HBME-1是一種針對間皮細胞表面抗原的單克隆抗體，也被認為是輔助FNAB用以區(qū)分甲狀腺良惡性腫瘤的IHC標志物。HBME-1和CK-19清晰的細胞質和細胞膜著色具有診斷意義［41］。一項聚焦于濾泡性甲狀腺腫瘤的研究［47］顯示，應用FNA樣本檢測HBME-1對于鑒別其良惡性的靈敏度和特異度分別為66.7%和90.6%。另一項研究［48］應用FNA樣本檢測HBME-1，預測PTC的靈敏度和特異度分別為87.5%和86%。然而，FVPTC沒有經典型PTC明顯的細胞核改變，于是Ohta等［49］對HBME-1在FVPTC中的檢測效能進行了評估，其靈敏度和特異度分別為92%和89%。由此可見，HBME-1在鑒別甲狀腺良惡性腫瘤中為敏感性標志物。

2.3 CK-19

CK-19主要用于標記單層上皮細胞，更多的用于腺癌診斷。CK-19在PTC中彌漫表達，而在FTC和其他良性病變中是點灶狀表達、低表達或者不表達［50］。一項聚焦于濾泡性甲狀腺腫瘤的研究［47］顯示，應用FNA樣本檢測CK-19對于TC診斷的靈敏度和特異度分別為90.5%和75%。Saggiorato等［51］應用IHC檢測了125例FNAB不能明確診斷的FNA樣本，發(fā)現CK-19診斷TC的靈敏度為76%，特異度為90%；而當Gal-3和CK-19聯(lián)合用于診斷24例甲狀腺嗜酸性細胞瘤時，靈敏度和特異度可達100%。Ratour等［52］應用FNA樣本聯(lián)合檢測CK-19和HBME-1診斷TC的靈敏度、特異度、陰性預測值和陽性預測值分別為100.0%、85.2%、100.0%和87.2%。另外，Cochand-Priollet等［53］對150例FNA樣本進行HBME-1與CK-19聯(lián)合檢測時，發(fā)現其診斷TC的靈敏度為100%，特異度為85%?？梢?，聯(lián)合應用各種IHC標志物，有助于術前協(xié)助診斷TC。

3 結語

無論是IHC還是基因檢測對于FNAB不能確診的甲狀腺結節(jié)均有重要的臨床價值。但目前尚存在單一標志物靈敏度及特異度欠佳、檢測技術較高、花費較多等因素，大部分分子標志物檢測未在臨床廣泛開展。隨著分子生物學的不斷進步，多種分子標志物聯(lián)合檢測可提高FNAB診斷的靈敏度。現在，已經有各種針對FNA樣本多基因檢測的試劑盒面世，或可作為FNAB的輔助檢查，成為對結果為意義不明確的細胞非典型病變、可疑濾泡性腫瘤、可疑癌等的甲狀腺結節(jié)定性的重要工具。