周俊海，黃瑞雪

（中南大學(xué)湘雅公共衛(wèi)生學(xué)院勞動衛(wèi)生與環(huán)境衛(wèi)生學(xué)系，湖南長沙 410078）

肺纖維化是以成纖維細(xì)胞增殖及大量細(xì)胞外基質(zhì)沉積并伴炎癥損傷、組織結(jié)構(gòu)破壞為特征的一大類肺疾病的終末期改變。石棉、礦物粉塵、藥物和放射損傷等多種因素均可導(dǎo)致肺纖維化［1］。針對肺纖維化，現(xiàn)有措施主要是重在預(yù)防和改善肺功能，治療上尚無有效特異性藥物使用對策，長鏈非編碼RNA（long noncoding RNA，lncRNA），長度＞200核苷酸，缺少開放閱讀框，不編碼蛋白質(zhì)。研究發(fā)現(xiàn)，其在轉(zhuǎn)錄及轉(zhuǎn)錄后等多個層次發(fā)揮作用，調(diào)控基因的表達(dá)。近年來，關(guān)于lncRNA在肺纖維化中作用機制的研究逐漸增多［2］。為了進(jìn)一步了解其在肺纖維化中的功能意義，為肺纖維化的預(yù)防及治療提供參考，本文從lncRNA的角度出發(fā)，綜述其在肺纖維化發(fā)生發(fā)展過程中的作用機制。

1 lncRNA參與肺纖維化的調(diào)控

上皮細(xì)胞間充質(zhì)轉(zhuǎn)化（epithelial-mesenchymal transition，EMT）是上皮細(xì)胞通過特定程序轉(zhuǎn)化為具有間充質(zhì)表型細(xì)胞的生物學(xué)過程，是肺纖維化發(fā)病機制中的重要進(jìn)程。EMT發(fā)生時，肺泡上皮細(xì)胞受損，細(xì)胞失去極性，細(xì)胞原有的標(biāo)志物丟失或下調(diào)表達(dá)，而間充質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志物增多，導(dǎo)致細(xì)胞黏附能力減弱，細(xì)胞遷移性增加，細(xì)胞形態(tài)也發(fā)生改變，最終出現(xiàn)纖維化改變。目前EMT的發(fā)生機制比較清楚的是，在肺泡上皮細(xì)胞中，轉(zhuǎn)化生長因子β1（transforming growing factor-β1，TGF-β1）通過激活果蠅母系抗頭狀蛋白（drosophilamothers against decapentaplegic protein，Smad）通路促進(jìn)EMT過程。近年來，針對肺纖維化的表觀遺傳調(diào)控研究揭示了lncRNA在EMT過程中發(fā)揮重要作用。研究證實，lncRNA主要通過以下三種方式參與調(diào)控EMT進(jìn)程：一是lncRNA在轉(zhuǎn)錄水平調(diào)控EMT相關(guān)基因和蛋白的表達(dá)；二是lncRNA參與EMT相關(guān)信號通路；三是lncRNA通過競爭性內(nèi)源機制與miR?NA競爭性結(jié)合，從而影響miRNA下游與EMT相關(guān)基因的表達(dá)。

lncRNA在轉(zhuǎn)錄水平的調(diào)控主要是指lncRNA干擾信使RNA（messenger RNA，mRNA）的轉(zhuǎn)錄以及直接與蛋白結(jié)合，影響EMT相關(guān)蛋白的表達(dá)。Sun等［3］用博來霉素誘導(dǎo)小鼠產(chǎn)生肺纖維化，基因芯片檢測轉(zhuǎn)錄組表達(dá)改變情況，發(fā)現(xiàn)博來霉素誘導(dǎo)的小鼠特發(fā)性肺纖維化模型中，513條lncRNA表達(dá)上調(diào)，204條表達(dá)下調(diào)?；虮倔w分析（GeneOntology analysis，GO分析）發(fā)現(xiàn)這些lncRNA的表達(dá)改變與肺泡上皮形態(tài)，細(xì)胞分化相關(guān)聯(lián)，信號通路分析（Kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG分析）發(fā)現(xiàn)lncRNA的表達(dá)改變與EMT進(jìn)程密切相關(guān)，不僅如此，作者還鑒定出2條lncRNA：uc.77和2700086A05Rik通過調(diào)干擾鋅指E盒結(jié)合蛋白2（zinc finger E-box binding protein 2，Zeb2）和同源盒基因3（homeobtic gene3，Hoxa3）mRNA的表達(dá)而誘導(dǎo)肺上皮細(xì)胞產(chǎn)生EMT。He等［4］研究發(fā)現(xiàn)，lncRNA FEZF1-AS1在非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞株上表達(dá)降低時，能抑制細(xì)胞EMT進(jìn)程。機制研究表明，lncRNA FEZF1-AS1通過直接與組蛋白賴氨酸特異性去甲基酶1和組蛋白-賴氨酸N-甲基轉(zhuǎn)移酶蛋白結(jié)合后抑制EMT的進(jìn)程。

lncRNA能參與EMT相關(guān)信號通路，發(fā)揮對EMT的調(diào)控作用。Xiang等［5］針對lncRNA肺腺癌轉(zhuǎn)移相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子1（metastasis associated lung adenocarcinoma transcript 1，MALAT1）在EMT中的作用展開了研究，發(fā)現(xiàn)TGF-β1誘導(dǎo)血管內(nèi)皮祖細(xì)胞產(chǎn)生EMT的過程中伴隨著lncRNA MALAT1表達(dá)增高的現(xiàn)象，lncRNA MALAT1與miR-145結(jié)合后，引起下游重組人轉(zhuǎn)化生長因子β受體2（recom?binant human transforming growth factor beta receptorⅡ，TGFBR2）和SMAD3基因表達(dá)改變，激活TGF-β1表達(dá)，從而起到促進(jìn)EMT作用。研究者用二氧化硅染毒小鼠制作出肺纖維化模型，在動物和細(xì)胞實驗中發(fā)現(xiàn)，lncRNA MALAT1通過競爭性結(jié)合miR-503，對下游與EMT進(jìn)程密切相關(guān)的基因蛋白激酶B（protein kinase B，PKB）、哺乳動物西羅莫司（sirolimos，雷帕霉素）靶蛋白（mammalian target of Rapamycin，mTOR）、鋅指轉(zhuǎn)錄因子Snail等的表達(dá)產(chǎn)生影響，從而促進(jìn)二氧化硅誘導(dǎo)的肺纖維化發(fā)生發(fā)展［6］。Yang 等［7］研究了 lncRNA H19 在TGF-β1誘導(dǎo)的牛乳腺上皮細(xì)胞（bovine mammary epithelial cells，MAC-T）EMT中的作用，發(fā)現(xiàn)其在牛乳房炎癥組織和炎癥性MAC-T細(xì)胞中高表達(dá)，其通過參與PI3K/AKT信號通路，促進(jìn)TGF-β1介導(dǎo)的EMT進(jìn)程。該研究小組還對lncRNA-ATB在EMT中的作用展開了研究，發(fā)現(xiàn)M2巨噬細(xì)胞分泌的TGF-β1能激活肺上皮細(xì)胞中的lncRNA-ATB表達(dá)升高，而且后者通過競爭性結(jié)合miR-200C對下游EMT相關(guān)基因Zeb1起調(diào)節(jié)作用，從而促進(jìn)EMT過程［8］。以上信號通路研究說明，多個lncRNA可能參與同一EMT相關(guān)信號通路，如lncRNA MALAT1和lncRNA H19均能通過調(diào)節(jié)PI3K/AKT信號通路促進(jìn)TGF-β1介導(dǎo)的EMT進(jìn)程，但不同的lncRNA在同一信號通路中作用機制可能不同，如lncRNA MALAT1存在與miRNA的競爭性內(nèi)源機制，而lncRNA H19在該研究中未顯示與miRNA存在競爭性內(nèi)源機制。

lncRNA通過競爭性內(nèi)源機制與miRNA競爭性結(jié)合，從而影響miRNA下游與EMT相關(guān)基因的表達(dá)是目前EMT表觀調(diào)控機制研究的內(nèi)容。Song等［9］研究了lncRNA MRAK088388和MRAK081523在肺纖維化中的作用機制。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，前者通過競爭性結(jié)合miR-29b調(diào)控下游。N4bp2表達(dá)，而后者通過競爭性結(jié)合let-7i-5p調(diào)控下游Plxna4表達(dá)。作者認(rèn)為lncRNA在肺纖維化中促進(jìn)EMT的作用機制與競爭性內(nèi)源性結(jié)合miRNA相關(guān)。Liu等［10］運用基因芯片和生物信息學(xué)手段分析了TGF-β1誘導(dǎo)的肺上皮細(xì)胞EMT中mRNA，miRNA和lncRNA的表達(dá)改變情況，及三者的共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)，發(fā)現(xiàn)在EMT進(jìn)程中，三者均出現(xiàn)表達(dá)改變，其中24條mRNA、11條miRNA和33條lncRNA能共表達(dá)且相互影響，但三者之間不存在競爭性內(nèi)源機制。作者認(rèn)為可能的解釋是，生物在進(jìn)化過程中發(fā)展出來很多復(fù)雜的機制，而競爭性內(nèi)源機制學(xué)說可能僅起到調(diào)節(jié)作用而不能解釋三者之間的共表達(dá)關(guān)系。該實驗雖無發(fā)現(xiàn)競爭性內(nèi)源機制，但在肺纖維化的EMT進(jìn)程中作用不可忽視，今后需要更多實驗證據(jù)支撐lncRNA的競爭性內(nèi)源機制學(xué)說在EMT中所起的作用。

2 lncRNA參與肺纖維化的炎性-免疫反應(yīng)

肺泡上皮細(xì)胞是肺部抵御外界侵害和感染的第一道屏障，主要有2類細(xì)胞組成，包括90%的Ⅰ型細(xì)胞和10%的Ⅱ型細(xì)胞。炎癥-免疫反應(yīng)是肺纖維化的病理基礎(chǔ)過程。初期肺泡上皮細(xì)胞損傷，產(chǎn)生炎癥反應(yīng)，細(xì)胞結(jié)構(gòu)和膜蛋白調(diào)節(jié)改變，上皮黏附分子異常表達(dá)，細(xì)胞因子及其他蛋白酶等分泌增多，炎癥和異常修復(fù)導(dǎo)致肺間充質(zhì)細(xì)胞增殖，產(chǎn)生大量的膠原和細(xì)胞外基質(zhì)。隨著炎性-免疫反應(yīng)的進(jìn)展，免疫系統(tǒng)對外界刺激因素或細(xì)胞因子等進(jìn)行非特異或特異性識別以及清除，肺泡壁、氣道和血管最終發(fā)生不可逆的肺部纖維化。從lncRNA的角度深入了解肺炎癥-免疫反應(yīng)對肺纖維化的貢獻(xiàn)，有助于揭示肺纖維化的部分機制。Dai等［11］采用大鼠肺損傷模型研究lncRNA MALAT1在肺泡上皮細(xì)胞損傷中的作用，發(fā)現(xiàn)lncRNA MALAT1可激活脂多糖誘導(dǎo)的炎癥反應(yīng)通路以及促進(jìn)脂多糖誘導(dǎo)的肺損傷進(jìn)程，且通過競爭性結(jié)合miRNA-146a的機制發(fā)揮促進(jìn)細(xì)胞損傷的作用。

lncRNA通過調(diào)控炎性相關(guān)因子表達(dá)參與炎癥反應(yīng)過程，從而對肺纖維化炎癥發(fā)生發(fā)展進(jìn)程產(chǎn)生影響。Wang等［12］運用機械通風(fēng)誘導(dǎo)的小鼠肺損傷和肺纖維化模型，發(fā)現(xiàn)332條lncRNA表達(dá)出現(xiàn)改變，GO分析發(fā)現(xiàn)，表達(dá)改變的lncRNA功能富集在細(xì)胞炎癥反應(yīng)和纖維化上；KEGG分析發(fā)現(xiàn)，lncRNA可能通過Wnt、缺氧誘導(dǎo)因子和Toll樣受體等免疫反應(yīng)通路介導(dǎo)纖維化進(jìn)程。已知長期吸入香煙煙霧與肺纖維化發(fā)病明顯相關(guān)，Liu等［13］發(fā)現(xiàn)，香煙煙霧誘導(dǎo)人支氣管上皮細(xì)胞出現(xiàn)纖維化，lncRNA HOTAIR和炎癥分子白細(xì)胞介素6（interleukin-6，IL-6）表達(dá)改變。ChIP實驗證實，lncRNA HOTAIR能直接和轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合，阻斷IL-6炎癥因子后，STAT3表達(dá)下調(diào)，lncRNA HOTAIR過表達(dá)，說明肺纖維化中的炎癥因子IL-6能通過STAT3信號通路上調(diào)lncRNA HOTAIR的表達(dá)，對肺纖維化的發(fā)生發(fā)展產(chǎn)生作用。Huang等［14］對PM2.5顆粒物引起肺纖維化的機制展開研究，發(fā)現(xiàn)PM2.5處理人支氣管上皮細(xì)胞后，lncRNA MALAT1表達(dá)改變與纖維化進(jìn)程呈現(xiàn)相關(guān)性，lncRNA MALAT1升高的程度與炎癥因子IL-6和IL-8表達(dá)升高也呈現(xiàn)一致性，說明lncRNA MALAT1通過調(diào)控炎癥因子參與PM2.5誘導(dǎo)的肺纖維化過程。

lncRNA BGas通過調(diào)控免疫反應(yīng)相關(guān)蛋白表達(dá)，參與肺纖維化免疫反應(yīng)。Duru等［15］在輻射誘導(dǎo)肺纖維化的綜述中指出，輻射誘導(dǎo)肺纖維化的發(fā)生與巨噬細(xì)胞極化、免疫調(diào)控以及l(fā)ncRNA之間關(guān)系密切。C57B/6小鼠接受輻照后，lncRNA LIRR1和lncRNA LIRR5表達(dá)升高，而lncRNA LIRR2，3和4表達(dá)降低。進(jìn)一步針對lncRNA LIRR1展開研究，發(fā)現(xiàn)支氣管上皮細(xì)胞株BEAS3B經(jīng)輻照后，lncRNA LIRR1在此細(xì)胞株上表達(dá)升高，細(xì)胞進(jìn)入G1期的數(shù)量增多，DNA修復(fù)蛋白如KU抗原和70 ku亞單位（70 ku subunit of KU antigen，KU70）表達(dá)下降。結(jié)果說明在輻射誘導(dǎo)肺纖維化過程中，lncRNA LIRR1介導(dǎo)輻射后細(xì)胞的DNA損傷免疫反應(yīng)。Balloy等［16］用銅綠色假單胞菌（綠膿桿菌）感染原代囊性纖維化患者的肺上皮細(xì)胞和正常人上皮細(xì)胞，對比分析2組之間轉(zhuǎn)錄組情況，發(fā)現(xiàn)lncRNA轉(zhuǎn)錄水平在該菌感染原代囊性纖維化患者的肺上皮細(xì)胞中顯著改變，GO分析發(fā)現(xiàn)改變表達(dá)的lncRNA與囊性纖維化的炎癥反應(yīng)通路密切相關(guān)，其中l(wèi)ncRNA LINC00862和lncRNA CTD-2619J13在上皮細(xì)胞感染的0，2，4和6 h均表達(dá)上調(diào)，可作為囊性纖維化的標(biāo)志物。Saayman等［17］鑒定發(fā)現(xiàn)了一條與囊性纖維化跨膜傳導(dǎo)調(diào)節(jié)因子（cystic fibrosis trans?membrane conductance regulator，CFTR）有關(guān)的lncRNA BGas，發(fā)現(xiàn)其過表達(dá)時，CFTR功能受抑制，反之，采用siRNA技術(shù)沉默lncRNA BGas后，CFTR活性激活。采用生物素標(biāo)記寡核苷酸實驗發(fā)現(xiàn)，lncRNA BGas能與高遷移率族蛋白14多克隆抗體、人高速泳動蛋白17和高遷移率族蛋白B1抗體及重組人良性的神經(jīng)細(xì)胞腫瘤同系物（within BGCN homolog）蛋白等幾種在肺纖維化進(jìn)程中調(diào)節(jié)炎癥-免疫反應(yīng)的蛋白結(jié)合，調(diào)控這些蛋白的表達(dá)。曹國紅等［18］通過觀察博霉素誘導(dǎo)的大鼠肺纖維化模型中l(wèi)ncRNA表達(dá)譜的變化，探討lncRNA在肺纖維化中的調(diào)控機制。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，表達(dá)上調(diào)的lncRNA 210個，表達(dá)下調(diào)358個，GO分析及KEGG分析發(fā)現(xiàn)，發(fā)生變化的lncRNA在生物學(xué)功能上主要涉及免疫反應(yīng)，參與的信號通路主要有細(xì)胞因子與細(xì)胞因子受體相互作用、趨化因子信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路、Janus激酶/信號轉(zhuǎn)導(dǎo)及轉(zhuǎn)錄激活因子信號通路和過氧化物酶體增殖物激活受體信號通路等［19］。

3 lncRNA參與肺纖維化的凋亡過程

細(xì)胞凋亡是細(xì)胞程序性死亡的方式，與肺纖維化發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。細(xì)胞凋亡涉及一系列蛋白的激活、表達(dá)以及調(diào)控的作用，其中，胱天蛋白酶家族蛋白、Bcl-2家族蛋白、P53蛋白以及某些受體扮演重要角色。常見細(xì)胞凋亡通路有線粒體通路、細(xì)胞膜通路以及內(nèi)質(zhì)網(wǎng)通路。細(xì)胞凋亡可刺激這3條通路的任何一條，也可激活多條通路，導(dǎo)致凋亡產(chǎn)生。目前研究發(fā)現(xiàn)肺泡上皮細(xì)胞凋亡是導(dǎo)致肺纖維化形成的主要原因。細(xì)胞凋亡增多直接導(dǎo)致肺泡塌陷，加速肺纖維化進(jìn)程。

lncRNA通過調(diào)控凋亡相關(guān)蛋白或通路參與凋亡過程。Gao等［20］對比分析了特發(fā)性纖維化患者和正常對照組外周血樣本lncRNA TERRA的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)其在特發(fā)性纖維化患者外周血中顯著升高，當(dāng)其被siRNA干擾沉默后，可改善線粒體相關(guān)細(xì)胞周期E基因，如基質(zhì)金屬蛋白酶，Bcl-2家族基因，增強線粒體功能，同時增強凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá)，如細(xì)胞色素c、胱天蛋白酶9和胱天蛋白酶3等。研究表明，lncRNA TERRA通過調(diào)節(jié)凋亡蛋白以及調(diào)控線粒體功能，從而對纖維化發(fā)生發(fā)展產(chǎn)生作用。Du等［21］研究對比分析24例特發(fā)性肺纖維化和配對24例正常人外周血中l(wèi)ncRNA的表達(dá)差異譜，發(fā)現(xiàn)440個lncRNA上調(diào)，1376個lncRNA下調(diào)。生物信息學(xué)發(fā)現(xiàn)，其中1個lncRNA CDKN2B-AS1的表達(dá)下調(diào)能激活P53信號通路，促進(jìn)肺癌的發(fā)生，說明在特發(fā)性肺纖維化患者中，肺癌的發(fā)生與lncRNA表達(dá)改變以及參與P53信號通路有關(guān)。Zhou等［22］研究了lncRNA-P21在肺纖維化中的作用，發(fā)現(xiàn)其低表達(dá)能激活HY3和H4在Thy-1啟動子上的乙?；磻?yīng)，以及激活Thy-1的活性，從而誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡增多，促進(jìn)肺纖維化發(fā)生發(fā)展。

4 展望

lncRNA雖不編碼蛋白質(zhì)，但能與同源DNA序列或RNA序列結(jié)合，也能折疊成復(fù)雜的二級結(jié)構(gòu)，與多種蛋白質(zhì)結(jié)合，參與轉(zhuǎn)錄前調(diào)控，如lncRNA的部分區(qū)域與DNA結(jié)合，然后其他部分折疊成高級結(jié)構(gòu)，再與表觀因子結(jié)合，調(diào)控下游基因轉(zhuǎn)錄。lncRNA還可參與轉(zhuǎn)錄過程的調(diào)控以及轉(zhuǎn)錄后調(diào)控，發(fā)揮多種重要生物學(xué)功能。綜上所述，在lncRNA與肺纖維化作用機制研究中，lncRNA主要通過某些信號通路或競爭性結(jié)合miRNA調(diào)控EMT進(jìn)程、參與纖維化炎癥-免疫反應(yīng)、調(diào)控凋亡相關(guān)蛋白或通路參與凋亡過程等發(fā)揮影響肺纖維化的發(fā)生發(fā)展作用。lncRNA在肺纖維化作用機制的研究，為揭示肺纖維化的發(fā)病機制提供了新的思路，也為今后肺纖維化的診斷和治療提供的有價值的生物學(xué)標(biāo)志物和治療干預(yù)靶點。但外界致肺纖維化因素的刺激、肺效應(yīng)分子、多個信號通路、細(xì)胞因子和蛋白參與，使得lncRNA調(diào)控肺纖維化的機制構(gòu)成了復(fù)雜的細(xì)胞-分子-通路-蛋白網(wǎng)絡(luò)。目前，針對lncRNA在肺纖維化中的研究還處在起始階段，很多機制還尚不清楚，如競爭性內(nèi)源結(jié)合機制具體是如何發(fā)揮作用，lncRNA是否能參與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)通路調(diào)控肺纖維化，lncRNA在轉(zhuǎn)錄前、轉(zhuǎn)錄中和轉(zhuǎn)錄后如何調(diào)控相關(guān)通路和基因。這些問題將引導(dǎo)我們繼續(xù)lncRNA的研究，深入探究其在肺纖維化中所起的作用。