張凱華　　左玲玲　　徐新　　王永東

[摘要] 目的 了解adeFGH系統(tǒng)在鮑曼不動桿菌的多重耐藥中發(fā)揮的作用。 方法 收集20株鮑曼不動桿菌耐藥株（含10株多重耐藥株），采用實時熒光定量PCR檢測adeFGH外排系統(tǒng)編碼基因adeF、adeG和adeH的mRNA表達水平，結(jié)合其耐藥譜，分析adeF、adeG和adeH的mRNA表達與鮑曼不動桿菌耐藥之間的關(guān)系。 結(jié)果 A、B和C組鮑曼不動桿菌的adeF基因和adeG基因的mRNA的表達水平在各組之間無明顯差異（P>0.05）；adeH基因的mRNA表達水平在A組和B組之間無明顯差異，A組和B組的adeH基因的mRNA表達水平明顯高于C組（P<0.05）。 結(jié)論 adeF、adeG、adeH基因共表達時，鮑曼不動桿菌adeFGH外排系統(tǒng)才能形成有效的抗生素外排通道；AdeFGH外排系統(tǒng)針對的外排底物有其局限性，主要針對氟喹諾酮類、β-內(nèi)酰胺類以及β-內(nèi)酰胺酶抑制劑等藥物。

[關(guān)鍵詞] 鮑曼不動桿菌；主動外排泵；多重耐藥；adeFGH；mRNA表達

[中圖分類號] R378 [文獻標識碼] A [文章編號] 1673-9701（2018）32-0005-03

Study on the mRNA expression of active efflux system gene adeFGH of multi-drug resistant Acinetobacter baumannii

ZHANG Kaihua1 ZUO Lingling1 XU Xin1 WANG Yongdong2

1.Department of Blood Transfusion， the Second Affiliated Hospital， University of South China， Hengyang 421001， China； 2.University of South China， Hengyang 421001， China

[Abstract] Objective To understand the role of the adeFGH system in multi-drug resistance of Acinetobacter baumannii. Methods A total of 20 Acinetobacter baumannii resistant strains（including 10 multi-drug resistant strains） were collected. Real-time quantitative PCR was used to detect the mRNA expression levels of the encoding genes of adeF， adeG and adeH in adeFGH efflux system. The relationship between mRNA expression of adeF， adeG and adeH and Acinetobacter baumannii resistance was analyzed in combination with its drug resistance spectrum. Results The mRNA expression levels of adeF gene and adeG gene of Acinetobacter baumannii in group A， B and C were not significantly different among groups（P>0.05）； the mRNA expression level of adeH gene was not significantly different between group A and group B. The mRNA expression levels of adeH gene in group A and group B were significantly higher than those in group C（P<0.05）. Conclusion When the adeF， adeG and adeH genes are co-expressed， the adeFGH efflux system of Acinetobacter baumannii can form an effective antibiotic efflux channel； the adeFGH efflux system has its limitations for efflux substrates， mainly for fluoroquinolones， β-lactams， and β-lactamase inhibitors.

[Key words] Acinetobacter baumannii； Active efflux pump； Multi-drug resistance； adeFGH； mRNA expression

抗生素的出現(xiàn)極大地推動了現(xiàn)代醫(yī)學的發(fā)展[1]。但是，隨著抗生素的廣泛和長期的使用，產(chǎn)生了耐藥菌，且隨著抗生素的持續(xù)濫用，出現(xiàn)了多重耐藥菌，這進一步加大了治療的難度[2，3]。統(tǒng)計表明，目前，全世界每年因抗生素耐藥而導致死亡的人數(shù)已達70萬，預計到2050年將達到100萬[4]。

鮑曼不動桿菌是一種非發(fā)酵革蘭陰性條件致病菌，能引起多種院內(nèi)感染，可能引起嚴重的后果，且鮑曼不動桿菌極易產(chǎn)生耐藥。在世界衛(wèi)生組織公布的對人類危害最大的耐藥菌中，耐碳青霉烯類抗生素的鮑曼不動桿菌位列第1位[5]。目前，鮑曼不動桿菌的耐藥率達89.6%，而對亞胺培南和美羅培南的耐藥率分別達62.8%和59.4%[6]。

多重耐藥鮑曼不動桿菌主要由外排泵介導。目前在鮑曼不動桿菌中發(fā)現(xiàn)了與耐藥有關(guān)的5類外排泵[7-10]，其中，RND家族是最普遍存在的，具有廣譜底物外排功能，與多重耐藥的關(guān)系最為密切。RND家族中，adeABC和adeFGH主要與外源獲得性耐藥有關(guān)，而adeIJK主要與內(nèi)源性耐藥有關(guān)[11-13]。

由于adeFGH是最近發(fā)現(xiàn)的鮑曼不動桿菌RND外排泵，對其作用機制尚不十分明確，本研究收集了20株鮑曼不動桿菌耐藥株，其中多重耐藥株為10株，采用熒光定量RT-PCR法檢測鮑曼不動桿菌的外排系統(tǒng)編碼基因adeF、adeG和adeH的mRNA表達水平，以了解外排泵adeFGH是否在鮑曼不動桿菌的多重耐藥中發(fā)揮作用，為深入研究鮑曼不動桿菌的耐藥機制提供參考。

1 材料與方法

1.1 菌株來源

從南華大學附屬第一醫(yī)院住院及門診患者送檢的各類臨床標本中收集鮑曼不動桿菌20株（含多重耐藥株10株）。標本來源主要為痰、傷口分泌物、血液、引流物、尿液和大便。編號及抗菌譜情況如下：4（B）、10（A）、15（A）、19（B）、20（A）、25（C）、27（C）、28（C）、29（C）、30（B）、32（C）、38（B）、39（C）、40（C）、42（C）、48（C）、49（C）、51（B）、55（B）、59（A），其中，A=全耐藥；B=氨基糖苷類和復方新諾明敏感，其他抗生素耐藥；C=阿莫西林和一、二代頭孢菌素類抗菌藥物耐藥，其他抗生素敏感。質(zhì)控標準菌株為大腸埃希菌ATCC 25922和銅綠假單胞菌ATCC 27853。

1.2培養(yǎng)基

采用血瓊脂平板對鮑曼不動桿菌進行培養(yǎng)。

1.3 主要試劑

超純RNA提取試劑盒、HiFi-MMLV cDNA第一鏈合成試劑盒、UltraSYBR Mixture（with Rox）、DNase等主要試劑均購自CWbio.Co.Ltd。

1.4 引物

根據(jù)GenBank上公布的基因序列，應用Lasergene 8.1.3軟件設計，由上海生物工程有限公司合成，引物序列見表1。

1.5 細菌總RNA的提取及cDNA的合成

用超純RNA提取試劑盒提取細菌總RNA，用第一鏈合成試劑盒反轉(zhuǎn)錄生成cDNA，并于-80℃條件下保存?zhèn)溆?。上述實驗操作均按產(chǎn)品說明書進行。

1.6 adeF、adeG和adeH的表達分析

1.6.1 反應體系及反應條件 采用Real-Time PCR擴增adeF、adeG和adeH基因和內(nèi)參基因——16S rDNA時，總反應體系為20 μL，含UltraSYBR Mixture（2×）10 μL，上、下游引物（10 μM）各0.4 μL，模板2 μL，ddH2O 7.2 μL。擴增程序為95℃ 10 min，（95℃ 15 s，60℃ 60 s）×40個循環(huán)。

1.6.2 標準曲線建立 取一個樣本的cDNA以5倍的梯度進行倍比稀釋，各取2 μL作模板擴增。在60℃～95℃進行融解曲線分析，并繪制目的基因和內(nèi)參基因的標準曲線，選擇擴增曲線和溶解曲線最好的稀釋倍數(shù)作為反應的模板濃度。

1.6.3 樣本擴增及數(shù)據(jù)分析 將各樣本的cDNA稀釋10倍，各取2 μL作模板進行擴增，每個反應均做3個復孔。以4號為對照，按照2-△△ct相對定量計算公式進行結(jié)果的計算，其中，ΔΔct=（ct目的基因-ct內(nèi)參基因）實驗組-（ct目的基因-ct內(nèi)參基因）對照組。

1.7 統(tǒng)計學方法

采用SPSS 20.0軟件對A、B和C組之間adeF、adeG和adeH的表達量分別進行單因素方差分析，P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 標準曲線及溶解曲線

標準曲線及溶解曲線見封三圖1～3。由圖可知，ade F、adeG、adeH的標準曲線R2均達到0.99，具有較高的線性相關(guān)度，基因擴增效率均大于90%，擴增產(chǎn)物的Tm值均一。這說明引物特異性很強，反應體系和反應條件設置合理。

2.2 ade F、adeG、adeH的Real-Time PCR擴增

各基因的產(chǎn)物溶解曲線見封三圖4～6。由圖可知，各基因的溶解曲線的波峰銳利，沒有出現(xiàn)其他異常波形，說明ade F、adeG、adeH的擴增具有很好的特異性，且峰值所對應的溫度和預期產(chǎn)物的Tm值一致。

2.3 各樣本相對定量結(jié)果

以4號樣本為對照，采用2-△△ct相對定量計算公式對Real Time-PCR的原始檢測結(jié)果進行計算，獲得各樣本中目的基因的相對定量結(jié)果（表2）。

對ade F、adeG、adeH基因的mRNA表達相對定量結(jié)果進行的統(tǒng)計分析表明，A、B和C組鮑曼不動桿菌的adeF基因和adeG基因的mRNA表達水平在各組之間無明顯差異（P>0.05）；adeH基因的mRNA表達水平在A組和B組之間無明顯差異（P>0.05），但A組和B組的adeH基因的mRNA表達水平明顯高于C組（P<0.05）。

3 討論

本文結(jié)果表明，A組和B組adeH基因的mRNA表達水平顯著高于C組（P<0.05），但C組也有部分菌株的adeH基因mRNA呈現(xiàn)高表達，如40號菌株，其adeH基因的相對表達量達到了1.86，是三組所有菌株中表達量最高的一株，但該菌株仍然是敏感株，所以adeH基因的單獨表達與鮑曼不動桿菌的多重耐藥性無明顯關(guān)系。研究發(fā)現(xiàn)，C組所有菌株均缺失adeF、adeG、adeH三個基因中的一個或兩個，這表明adeFGH外排系統(tǒng)發(fā)揮外排作用時，可能需要adeF、adeG、adeH基因共表達，才能形成有效的抗生素外排通道。而C組鮑曼不動桿菌之所以對阿莫西林以及一、二代頭孢菌素類抗菌藥物產(chǎn)生耐藥，應該是其他耐藥機制發(fā)揮了主要作用。與鮑曼不動桿菌adeABC外排系統(tǒng)的情況完全不同。對鮑曼不動桿菌adeABC外排系統(tǒng)的研究表明，當使adeB失活時，抗生素對菌株的最低抑菌濃度與原始菌相比下降了4～32倍，而使adeC失活時，菌株的耐藥特性與原始菌相比無區(qū)別。這說明adeC對于鮑曼不動桿菌的adeABC外排系統(tǒng)來說不是必需的[14]。

結(jié)果同時表明，鮑曼不動桿菌的adeFGH的過表達可降低其對氟喹諾酮類、β-內(nèi)酰胺類以及β-內(nèi)酰胺酶抑制劑的復合制劑等多種藥物的敏感性，但對氨基糖苷類和復方新諾明未造成明顯影響。而黃阿莉等[15]的研究表明，臨床分離出的鮑曼不動桿菌對氨基糖苷類和復方新諾明的耐藥率分別達到了50.41%和78.13%。這進一步說明，鮑曼不動桿菌存在多種耐藥機制，adeFGH外排系統(tǒng)針對的外排底物有其局限性。

綜上，本研究表明鮑曼不動桿菌adeFGH外排系統(tǒng)要形成有效的抗生素外排通道，需要adeF、adeG、adeH基因共表達，且鮑曼不動桿菌的adeFGH外排系統(tǒng)針對的外排底物有其局限性，主要針對氟喹諾酮類、β-內(nèi)酰胺類以及β-內(nèi)酰胺酶抑制劑等藥物。

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（收稿日期：2018-08-17）