潘建　　蔣自培

[摘要] 目的 探討燈盞花素注射液對角膜堿燒傷兔血管內(nèi)皮功能的影響。 方法 將40例角膜堿燒傷兔分為觀察組和對照組。對照組（20眼）采用常規(guī)對癥治療。觀察組（20眼）在對照組基礎上采用燈盞花素注射液治療。采用Ando計分法評估兔的角膜炎癥狀態(tài)，采用Trousdale計分法評估兔的角膜潰瘍狀態(tài)，檢測兩組治療前后血清VEGF、PEDF、NO的水平，記錄兩組的創(chuàng)面愈合時間，運用裂隙燈顯微鏡檢測兩組兔的角膜新生血管數(shù)量。 結(jié)果 觀察組的總有效率高于對照組，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）；兩組治療后角膜炎癥評分、角膜潰瘍評分明顯降低（P<0.05）；觀察組治療后的角膜炎癥評分、角膜潰瘍評分低于對照組，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）；兩組治療后VEGF、NO明顯降低，PEDF明顯升高（P<0.05）；觀察組治療后VEGF、NO低于對照組，PEDF高于對照組，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）；觀察組的創(chuàng)面愈合時間及新生血管數(shù)量低于對照組，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。 結(jié)論 燈盞花素注射液能顯著提高角膜堿燒傷的療效，調(diào)節(jié)兔血管內(nèi)皮功能。

[關鍵詞] 燈盞花素注射液；角膜堿燒傷；血管內(nèi)皮功能

[中圖分類號] R259 [文獻標識碼] A [文章編號] 1673-9701（2018）32-0034-03

Effect of breviscapine injection on vascular endothelial function in rabbits with corneal alkali burn

PAN Jian JIANG Zipei

Department of Ophthalmology，the First Affiliated Hospital of Wenzhou Medical University，Wenzhou 325000，China

[Abstract] Objective To investigate the effect of breviscapine injection on vascular endothelial function in rabbits with corneal alkali burn. Methods 40 cases of corneal alkali burned rabbits were divided into observation group and control group. The control group（20 eyes） was treated with conventional symptomatic treatment. The observation group（20 eyes）was treated with breviscapine injection based on the treatment of the control group. The corneal inflammatory state of rabbits was evaluated by Ando scoring method. The corneal ulcer status of rabbits was evaluated by Trousdale scoring method. The levels of serum VEGF， PEDF and NO before and after treatment were measured. The wound healing time of the two groups was recorded and the slit lamp microscope was used to detect the number of corneal neovascularization in the two groups of rabbits. Results The total effective rate of the observation group was higher than that of the control group， and the difference was statistically significant（P<0.05）. The corneal inflammation score and corneal ulcer score in two groups were significantly decreased after treatment（P<0.05）. The corneal inflammation score and corneal ulcer score after treatment in the observation group were lower than those in the control group， and the difference was statistically significant（P<0.05）. After treatment， VEGF and NO in two groups decreased significantly， and PEDF increased significantly（P<0.05）. VEGF and NO in the observation group after treatment were lower than those of the control group， and the PEDF in the observation group after treatment was higher than the control group， the difference was statistically significant（P<0.05）. The wound healing time and the number of new blood vessels in the observation group was lower than that in the control group（P<0.05）. Conclusion Breviscapine injection can significantly improve the efficacy of corneal alkali burn and regulate vascular endothelial function in rabbits.

[Key words] Breviscapine injection；Corneal alkali burn；Vascular endothelial function

堿性物質(zhì)刺激眼部，能迅速溶解眼部蛋白質(zhì)和脂肪，破壞組織結(jié)構(gòu)，還能滲透進入眼內(nèi)，引起眼部組織細胞壞死[1]。隨著現(xiàn)代經(jīng)濟建設的不斷發(fā)展，角膜堿燒傷的發(fā)病率呈上升趨勢，嚴重危及人的身心健康。目前西醫(yī)治療角膜堿燒傷以常規(guī)對癥治療為主，雖能改善人的臨床癥狀，但角膜創(chuàng)面修復較為緩慢，臨床療效不盡理想。近年來，中醫(yī)藥在眼科病變的治療中取得了較好的療效，逐漸受到廣大醫(yī)師的關注[2]。燈盞花素注射液是由燈盞花中提取的有效成分制成的復方制劑，具有抗血凝、擴張血管的功效，還能顯著改善血管內(nèi)皮功能[3]。本研究對角膜堿燒傷兔在常規(guī)對癥治療的基礎上，采用燈盞花素注射液治療，探討其治療效果。為進一步在臨床眼科中應用提供實驗依據(jù)，現(xiàn)報道如下。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

經(jīng)相關部門動物倫理委員會審查同意后（實驗動物使用許可證號：SYXK（浙）2014-0006），購買清潔級健康日本大耳白兔40只，雌雄不分，體重 2.0～2.5 kg，均排除眼疾，以右眼為實驗眼。

1.2 兔堿燒傷動物模型制備

將浸有1.0 mol/L NaOH溶液的環(huán)行濾紙（外徑12 mm，內(nèi)徑6 mm）覆蓋于健康日本大耳白兔右眼角膜緣約30 s，接著用生理鹽水沖洗30 s，刮除角膜中央上皮。結(jié)膜膜囊滴抗生素滴眼液，每日4次。1 d、3 d、1周、2周及1個月時裂隙燈檢查，觀察角膜潰瘍、熒光素染色、新生血管及混濁情況并評分。

1.3 動物分組

堿燒傷動物模型制備6周后，將40只日本大耳白兔隨機分為對照組和觀察組，每組20只。兩組兔齡、體重、燒傷分級比較差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05），具有可比性。

1.4 治療方法

對照組：采用常規(guī)對癥治療，右眼采用局部滴眼液抗菌抗炎，阿托品散瞳。耳緣靜脈注射與觀察組燈盞花素注射液相當量的生理鹽水。觀察組：在對照組基礎上，采用燈盞花素注射液按照2.5 mg/kg耳緣靜脈注射。靜脈滴注燈盞花素注射液（石藥銀湖制藥有限公司，規(guī)格為20 mg：5 mL，生產(chǎn)批號：20170821），每日1次。兩組均于治療4周后統(tǒng)計療效。

1.5 療效標準[4]

①治愈：燒傷創(chuàng)面全部愈合，角膜面恢復正常，無功能障礙；②有效：燒傷創(chuàng)面疾病愈合，角膜面粗糙不平，功能或色澤未完全恢復；③無效：燒傷創(chuàng)面炎癥反應劇烈，有明顯瘢痕，眼部功能受到影響。總有效率=治愈率+有效率。

1.6 觀察指標

采用Ando計分法評估兔的角膜炎癥狀態(tài)：①角膜透明，無混濁，計為0分；②虹膜可見紋理，角膜輕度混濁，計為1分；③虹膜紋理不清晰，角膜中度混濁，計為2分；④瞳孔隱見，角膜中度混濁，計為3分；⑤瞳孔不見，角膜重度混濁，計為4分。

采用Trousdale計分法評估兔的角膜潰瘍狀態(tài)：①角膜無染色，計為0分；②角膜染色面積≤1/4象限，計為1分；③角膜染色面積>1/4象限，但≤1/2象限，計為2分；④角膜染色面積>1/2象限，但≤3/4象限，計為3分；⑤角膜染色面積>3/4象限，計為4分。

于治療前后，采集兔耳緣靜脈血4 mL，采用放射免疫法檢測血清血管內(nèi)皮生長因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）、色素上皮衍生因子（pigment epithelium-derived factor，PEDF）、一氧化氮（nitric oxide，NO）的水平。記錄兩組的創(chuàng)面愈合時間，運用裂隙燈顯微鏡檢測兩組兔的角膜新生血管數(shù)量。

1.7 統(tǒng)計學方法

選取統(tǒng)計學軟件SPSS19.0處理全部數(shù)據(jù)，療效等計數(shù)資料采用百分率表示，組間對比行χ2檢驗，評分、理化指標、血管數(shù)量等計量資料采用均數(shù)±標準差（x±s）表示，組間對比采用獨立t檢驗，組內(nèi)對比采用配對t檢驗，P<0.05表示差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 兩組的療效比較

觀察組的總有效率高于對照組，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。

2.2 兩組的角膜炎癥評分、角膜潰瘍評分比較

兩組治療前角膜炎癥評分、角膜潰瘍評分比較無明顯差異（P>0.05）；兩組治療后角膜炎癥評分、角膜潰瘍評分明顯降低（P<0.05）；觀察組治療后的角膜炎癥評分、角膜潰瘍評分低于對照組，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。

2.3兩組的血管內(nèi)皮功能指標比較

兩組治療前VEGF、PEDF、NO無明顯差異（P>0.05）；兩組治療后VEGF、NO明顯降低，PEDF明顯升高（P<0.05）；觀察組治療后VEGF、NO低于對照組，PEDF高于對照組，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。

2.4 兩組的創(chuàng)面愈合時間和新生血管數(shù)量比較

觀察組的創(chuàng)面愈合時間和新生血管數(shù)量低于對照組，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。

3 討論

角膜堿燒傷的主要病理機制包括角膜或結(jié)膜內(nèi)大量的微血管栓塞或痙攣，引起局部組織嚴重缺血性壞死，出現(xiàn)水腫等癥狀；同時受損的組織細胞發(fā)生炎癥級聯(lián)反應，大量的炎癥細胞浸潤角膜組織，改變細胞膜通透性，產(chǎn)生大量的炎癥因子及氧化自由基，造成角膜組織繼發(fā)性損傷；還能釋放大量的膠原酶影響角膜增生；多種病理反應刺激VEGF表達，促進血管內(nèi)皮細胞過度有絲分裂，促進新生血管形成[5-6]。西醫(yī)治療以常規(guī)對癥治療為主，糖皮質(zhì)激素能抑制非特異性炎癥反應，減輕局部組織的損傷，維生素C能促進組織細胞間質(zhì)和膠原蛋白的分泌，抗菌抗炎能預防局部組織感染[7]。

燈盞花素是中藥燈盞花的主要提取物，其有效成分包括黃酮類物質(zhì)、倍半萜、咖啡酸酯等多種活性物質(zhì)，具有抗氧化、抗炎、抗纖維化、抗血小板聚集、擴張血管、促進纖溶酶原活性、改善視神經(jīng)軸漿運輸?shù)榷喾N生物學功能[8]。近年來燈盞花素注射液廣泛用于青光眼、視網(wǎng)膜病變的治療，并取得了良好的療效[9-10]。本研究結(jié)果顯示，觀察組的總有效率高于對照組。觀察組治療的角膜炎癥評分、角膜潰瘍評分低于對照組。結(jié)果提示，燈盞花素注射液能進一步提高角膜堿燒傷的臨床療效，改善兔的臨床癥狀。燈盞花素注射液治療角膜堿燒傷的作用機制可能為改善局部微循環(huán)，顯著改善缺血缺氧的癥狀，促進組織間能量及物質(zhì)交換，減輕組織水腫癥狀，還能通過抗炎、抗氧化的作用，減輕角膜組織細胞的損傷，有助于創(chuàng)面的愈合[11-12]。

角膜本身為完全透明無血管的組織，當角膜受到感染、免疫排斥、外傷等作用后會刺激血管向角膜內(nèi)生長，形成角膜新生血管，嚴重影響兔的視力及角膜的組織結(jié)構(gòu)[13]。角膜堿燒傷重要的治療組成部分為抑制角膜新生血管形成。有研究結(jié)果表明，角膜新生血管的形成與血管內(nèi)皮功能關系密切[14]。VEGF、PEDF、NO是參與新生血管的生長的重要細胞因子。VEGF是目前發(fā)現(xiàn)的促進血管生長作用最強的高度特異性細胞因子，能促進血管內(nèi)皮細胞有絲分裂、遷移、增殖，增強血管的通透性，促進血管的形成[15]。VEGF是角膜新生血管的重要誘導因素[16]。NO是種強力的血管舒張因子，其作用機制為NO與血管平滑肌中鐵原子結(jié)合，激活環(huán)磷酸鳥苷依賴的PKG的活性，促進鈣離子外流或在胞內(nèi)存儲，促進平滑肌舒張，NO還能促進血管內(nèi)皮細胞生長，維持血管結(jié)構(gòu)的完整性，參與角膜新生血管的形成[17]。VEGF的表達與NO水平呈正相關，VEGF可促進內(nèi)皮細胞合成NO，NO能作用于內(nèi)皮細胞的蛋白酶，促進VEGF的表達[18]。PEDF是調(diào)節(jié)血管生長的作用因子，能促進活化的血管內(nèi)皮細胞凋亡，抑制缺氧誘發(fā)的新生血管信號，抑制角膜新生血管的形成[19-20]。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，觀察組新生血管數(shù)量低于對照組。觀察組治療后VEGF、NO低于對照組，PEDF高于對照組。結(jié)果提示，燈盞花素注射液可抑制角膜堿燒傷兔角膜新生血管的形成，其可能的機制之一為燈盞花素可調(diào)節(jié)血管內(nèi)皮細胞功能，抑制VEGF、NO的表達，促進PEDF的表達，發(fā)揮抑制血管形成的作用。

綜上所述，本實驗初步觀察了燈盞花素注射液對兔角膜堿燒傷的較好療效，并通過VEGF、PEDF、NO的檢測探討了其可能的機制，為臨床進一步在人類角膜堿燒傷中的應用提供動物實驗依據(jù)。

[參考文獻]

[1] Zhou C，Robert MC，Kapoulea V，et al. Sustained subconjunctival delivery of infliximab protects the cornea and retina following alkali burn to the eye[J]. Invest Ophthalmol Vis Sci， 2017，58（1）：96-105.

[2] 張慧西，薛凱，王潤生. 中西醫(yī)結(jié)合治療燒傷后角膜上皮損傷的療效觀察[J]. 中國中醫(yī)眼科雜志，2016，26（3）：186-189.

[3] 李釗飛，曹小雨，陳瓊芳，等. 燈盞花素對大鼠腦微血管內(nèi)皮細胞OGD損傷的保護作用及機制研究[J]. 中國藥理學通報，2017，33（2）：295-296.

[4] 楊彥昌，張柏新. 臨床耳五官科急診學[M]. 北京：人民軍醫(yī)出版社，2002：339.

[5] 付敏，喻謙，付馨余，等. 大鼠角膜堿燒傷后角膜及房水中缺氧誘導因子-1α的表達[J]. 眼科新進展，2015， 35（6）：532-535.

[6] 幸正茂，劉菲，袁進. 角膜堿燒傷的免疫學機制研究進展[J]. 中華實驗眼科雜志，2010， 28（8）：796-800.

[7] 王朋，吳志鴻. 角膜堿燒傷的藥物治療研究進展[J]. 中國急救復蘇與災害醫(yī)學雜志，2016，11（7）：735-738.

[8] 肖望重，戴冰，歐陽林旗，等. 502例注射用燈盞花素超說明書用藥分析[J]. 中國藥物警戒，2017，14（3）：186-188.

[9] 鄭博，杜蕊，吳惠琴. 燈盞花素對青光眼濾過術后中晚期原發(fā)性開角型患者視功能的影響[J]. 現(xiàn)代中西醫(yī)結(jié)合雜志，2016，25（24）：2709-2711.

[10] 王競男，楊立群，鄧宇斌，等. 燈盞花素對人視網(wǎng)膜色素上皮細胞和糖尿病大鼠視網(wǎng)膜VEGF表達的影響[J].中國病理生理雜志，2015， 31（5）：900-905.

[11] 周善之，宋春洪.腦梗死應用燈盞花素的療效觀察[J].中外醫(yī)學研究，2016，14（16）：117-118.

[12] 蔡玉蓮，謝楊春，蘇蓉，等. 燈盞花素治療眼堿燒傷的療效觀察[J]. 國際眼科雜志，2014，14（7）：1275-1277.

[13] 李鵬程，王國軍，胡燕華，等. SDF-1和CXCR4在鼠角膜堿燒傷新生血管中的表達[J]. 眼科新進展，2010，30（9）：832-836.

[14] 王群，姜嚴明，趙杰，等. 血管內(nèi)皮生長因子靶向抗體對大鼠角膜堿燒傷后新生血管抑制作用的研究[J]. 眼科新進展，2017，37（11）：1010-1014.

[15] 戴鵬飛，王峰，鄭玉萍，等. 大鼠角膜堿燒傷后ILK和VEGF的表達與角膜新生血管的相關性研究[J]. 國際眼科雜志，2012，12（2）：208-211.

[16] 王啟明，趙心悅，王智. 高危角膜移植大鼠排斥反應及VEGF-C/D表達的研究[J]. 國際眼科雜志，2016，16（10）：1812-1815.

[17] 武犁，邱良秀，李中國，等. 堿燒傷對角膜組織中NO及iNOS含量變化的影響[J]. 臨床眼科雜志，2003，11（2）：175-177.

[18] 劉曉坤，趙平. VEGF、NO在角膜堿燒傷新生血管形成中的影響[J]. 眼科新進展，2006， 26（2）：107-110.

[19] 江新利，趙平，劉巖. PEDF在眼部疾病中的研究進展[J].眼科新進展，2013，33（5）：485-488.

[20] 趙抒羽，郭小南，何錦賢. 人羊膜勻漿提取液對角膜堿燒傷后新生血管PEDF和VEGF表達及角膜新生血管的影響[J]. 國際眼科雜志，2017，17（8）：1437-1440.

（收稿日期：2018-05-16）