楊凌霄 綜述，陳 姝 審校

(重慶醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院血液科 400010)

血友病是一種罕見(jiàn)的X染色體連鎖隱性遺傳的一組出血性疾病，分為血友病A(FⅧ缺乏)和血友病B(FⅨ缺乏)，男性發(fā)病，女性常為致病基因攜帶者。血友病患者常以關(guān)節(jié)、深部肌肉為主要出血部位，大約70%～80%患者因關(guān)節(jié)長(zhǎng)期出血而并發(fā)血友病性關(guān)節(jié)炎[1]。目前，以血源性凝血因子和重組凝血因子為主的替代治療仍是血友病最主要的治療方式。近十余年來(lái)，血友病的治療取得了許多新進(jìn)展，主要包括4個(gè)方面：傳統(tǒng)的按需治療模式轉(zhuǎn)向更為理想的預(yù)防治療模式，對(duì)抑制物的預(yù)防與治療，長(zhǎng)半衰期因子等新藥的研制，以及基因治療的研究。

1 預(yù)防治療

近年來(lái)，按需治療的不足之處逐漸顯現(xiàn)。當(dāng)出血發(fā)生，按需治療雖能盡快做到止血、控制疼痛，但關(guān)節(jié)、肌肉的損害是不可逆的，形成了反復(fù)出血和慢性血友病性關(guān)節(jié)炎的惡性循環(huán)。預(yù)防治療在20世紀(jì)70年代最早由瑞典的Nilsson等提出，1994 年被WFH 和 WHO 推薦為重度兒童血友病的治療策略[2]。預(yù)防治療是指嘗試定期預(yù)防性替代輸注凝血因子，使重型患者體內(nèi)凝血因子(FⅧ:C/FⅨ:C)含量長(zhǎng)期維持在1%(0.01 U/mL)以上，以防止或減少出血的發(fā)生。

根據(jù)預(yù)防治療因子使用劑量的不同，有3種治療方案[3]：大劑量方案(每次25～40 IU/kg，血友病A每周給藥3次，血友病B每周給藥2次)；中劑量方案(每次15～30 IU/kg，血友病A每周給藥3次，血友病B每周給藥2次)；低劑量方案是對(duì)于包括我國(guó)在內(nèi)的資源有限的發(fā)展中國(guó)家一種有效的過(guò)渡性方案，基于中國(guó)現(xiàn)狀和短期臨床數(shù)據(jù)，中國(guó)血友病協(xié)作組、預(yù)防治療工作組和兒童工作組推薦血友病A 10 IU/kg,每周2次和血友病B 20 IU/kg,每周1次的低劑量預(yù)防治療計(jì)劃。

預(yù)防治療可以減輕疼痛，減少出血次數(shù)，預(yù)防危及生命的大出血發(fā)生，降低日后關(guān)節(jié)外科手術(shù)的可能性，盡可能避免殘疾的發(fā)生。但預(yù)防治療仍存在一些不可忽視的弊端，由于目前常用的血源性或重組的FⅧ、FⅨ其半衰期較短，導(dǎo)致了用藥頻率高，患者順應(yīng)性差。此外，持續(xù)使用凝血因子、抑制物產(chǎn)生的風(fēng)險(xiǎn)增加，抑制物陽(yáng)性的患者費(fèi)用負(fù)擔(dān)更重。血友病的治療雖然還存在諸多不足，但預(yù)防治療的推進(jìn)和普及依然是血友病治療的根本。

2 抑制物的處理

近年來(lái)，重組FⅧ制劑、重組Ⅸ制劑，保證了產(chǎn)品的安全性，控制了血源感染的風(fēng)險(xiǎn)。但是，血友病患者長(zhǎng)期輸注凝血因子帶來(lái)了另一嚴(yán)重并發(fā)癥，即FⅧ、FⅨ抑制物產(chǎn)生。抑制物產(chǎn)生后增加了出血的程度和頻率，加大了治療的難度和費(fèi)用，增加了殘疾率和病死率，進(jìn)而嚴(yán)重影響了患者的生存質(zhì)量。

抑制物形成的危險(xiǎn)因素有遺傳和非遺傳因素?；虼笃稳笔?、22號(hào)染色體倒位、無(wú)義突變、種族問(wèn)題、T細(xì)胞亞群、MHC-Ⅰ/Ⅱ表型、免疫調(diào)節(jié)基因多態(tài)性等均是遺傳的高危因素。此外，還包括年齡、疾病嚴(yán)重程度、凝血因子產(chǎn)品類型、用藥方案、首次治療時(shí)間、創(chuàng)傷和手術(shù)等非遺傳因素[4-5]。當(dāng)患者對(duì)常規(guī)替代治療無(wú)效時(shí)，需警惕抑制物產(chǎn)生。

一些遺傳方面的危險(xiǎn)因素提示存在抑制物家族史是一個(gè)強(qiáng)有力的預(yù)測(cè)指標(biāo)[5-6]，因此在開(kāi)始替代治療前，開(kāi)展抑制物的遺傳風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估是非常有價(jià)值的，但是環(huán)境因素的影響及免疫系統(tǒng)的復(fù)雜性給評(píng)估帶來(lái)了困難。因此需要找到一種新的手段，能夠代替常規(guī)的因子替代治療，從而達(dá)到預(yù)防的目的。

免疫耐受療法(immune tolerance induction，ITI)是針對(duì)抑制物的一個(gè)主要治療方式。ITI即重復(fù)給予FⅧ使患者產(chǎn)生免疫誘導(dǎo)，體內(nèi)產(chǎn)生特異性抗體中和抑制物。有資料顯示，該療法對(duì)血友病A患者的成功率為60%～80%，但對(duì)血友病B患者的影響卻較少，僅25%成功[7-8]。ITI用于抑制物陽(yáng)性的血友病患者，是公認(rèn)的去除抑制物的主要手段，此外，ITI還可用于即將接受替代治療的患者，減少抑制物的產(chǎn)生。但目前仍需對(duì)照研究來(lái)決定ITI的方案[9]。ITI治療失敗的患者，需要考慮使用免疫抑制劑治療。目前正在使用的免疫抑制劑包括：利妥昔單抗、霉酚酸酯、地塞米松和丙種球蛋白。一些病例報(bào)道單用利妥昔單抗治療抑制物療效顯著[10]，但由于該藥降低了B細(xì)胞數(shù)，仍需大量臨床研究確定其安全性及帶來(lái)的不良反應(yīng)。

此外，還有旁路制劑療法。激活的凝血酶原復(fù)合物(plasma derived activated prothrombin complex concentrate,pd-APCC)含有外源性或共同凝血途徑中所需的FⅡa、FⅦa、FⅩa等，不通過(guò)內(nèi)源性凝血途徑以“旁路”的形勢(shì)到達(dá)凝血終點(diǎn)。一個(gè)獨(dú)立的前瞻性研究中觀察到:使用FⅧ旁路途徑抑制物(factor eight inhibitor bypass activity,FEIBA) 非連續(xù)性的每周給予3次藥，每次給藥85 U/kg，與按需治療相比，可以將出血率降低62%[11]。將FEIBA以預(yù)防治療的形式用于存在抑制物的血友病患者中，是安全、有效、可行的。

3 新型藥品

3.1雙特異性抗體(ACE910) 2015年9月，瑞士羅氏公司(Roche)開(kāi)發(fā)了用于治療甲型血友病的新抗體藥物ACE910(emicizumab)。ACE910是一種重組人源化的雙特異性單克隆抗體，對(duì)FⅨa和FⅩ具有高親和力，通過(guò)雙親和作用發(fā)揮酶催化反應(yīng)的輔因子作用，模擬凝血因子Ⅷa，使凝血因子Ⅸa催化凝血因子X(jué)形成凝血因子Ⅹa發(fā)揮止血作用。該抗體在受試者中具有良好的耐受性，Ⅰ、Ⅱ期研究顯示，伴或不伴有抑制物的血友病A患者，其年出血率(annualized bleeding rates,ABR)均降低，尚無(wú)嚴(yán)重不良事件報(bào)道[12]。該藥因皮下給藥(每周1次)、半衰期長(zhǎng)(4～5周)、免疫原性低、液體常溫保存得到青睞。此外，除結(jié)合位點(diǎn)外，ACE910與FⅧ無(wú)類似結(jié)構(gòu)，不會(huì)被FⅧ的抗體破壞，從而使許多抑制物陽(yáng)性的血友病A患者受益。Ⅰ期臨床研究顯示，治療效果對(duì)不同人種沒(méi)有明顯區(qū)別，1 mg/kg每周皮下注射1次emicizumab可以達(dá)到約10%正常水平凝血因子Ⅷ，能讓中、重度血友病A緩解為輕度[13]。

3.2血友病旁路抗凝蛋白抑制劑

3.2.1拮抗組織因子途徑抑制物TFPI(concizumab) 抗凝過(guò)程由抗凝血酶3(AT-3)、組織因子途徑抑制物(TFPI)、蛋白C和蛋白S這4種血漿蛋白控制，TFPI是組織因子(TF)、FⅦ和FⅩ的抑制物，是一種在正常生理?xiàng)l件下血液中存在的天然抗凝物質(zhì)。TFPI有3個(gè)不同功能的結(jié)構(gòu)域，其中2個(gè)結(jié)構(gòu)域分別與TF-FⅧ和FⅩa結(jié)合并發(fā)揮抑制作用，第3個(gè)結(jié)構(gòu)域與具有抗凝作用的蛋白S結(jié)合，起協(xié)同作用，從而阻止凝血酶原轉(zhuǎn)換為凝血酶，達(dá)到抗凝的效果。新型藥物的另一個(gè)發(fā)展方向?yàn)門FPI抗體concizumab[14]。該抗體是一種人源化的具有高親和力的單克隆抗體，能作用于TFPI的結(jié)構(gòu)域，干擾TFPI和FⅩa形成復(fù)合物，從而抑制TFPI的活性。

3.2.2siRNA靶向沉默抗凝血酶(ALN-AT3) 2014年11月有研究報(bào)道了應(yīng)用RNA干擾(RNAi)療法的新藥即ALN-AT3，該藥皮下注射，有望將治療頻率減少至每周1次甚至每月1次，適用于伴或不伴抑制物的血友病A和B[15]?？鼓?AT)主要為抗凝血酶3(AT3)，同樣是一種在正常生理?xiàng)l件下血液中存在的天然抗凝物質(zhì)，其通過(guò)滅活FⅩa和凝血酶達(dá)到抗凝作用。ALN-AT3通過(guò)一種基因沉默程序發(fā)揮作用，這一程序可以關(guān)閉AT的功能，通過(guò)抑制AT提升凝血酶水平和活性，從而在不補(bǔ)充外源性凝血因子的情況下，減少出血的次數(shù)。其在Ⅰ期試驗(yàn)中被用于中重度血友病患者，中期結(jié)果顯示 ALN-AT3 能夠使 AT 的活性降低 86%[15]。

3.3延長(zhǎng)半衰期(extended half-life,EHL)的產(chǎn)品 在替代治療中，因?yàn)镕Ⅷ產(chǎn)品只有8～12 h的半衰期，目前被廣泛使用的預(yù)防治療方案也需要大約每周2～3次，甚至在某些情況下每天1次的重復(fù)靜脈輸注，這為治療帶來(lái)不便，也促使研究者們開(kāi)發(fā)出半衰期延長(zhǎng)的因子產(chǎn)品，從而減少靜脈輸注的頻率，同時(shí)更長(zhǎng)時(shí)間地避免患者出血。

3.3.1聚乙二醇分子(PEG)聚合化 PEG聚合化是將活化的PEG通過(guò)化學(xué)方法以共價(jià)鍵耦聯(lián)到蛋白質(zhì)或多肽分子上。PEG修飾后具有增強(qiáng)生物學(xué)、物理、化學(xué)穩(wěn)定性，減少毒副作用，降低或消失免疫原性的作用。最重要的是，PEG聚合化后處于親水狀態(tài)，與低密度脂蛋白受體相關(guān)蛋白(LRP1)結(jié)合，減少在肝臟內(nèi)的清除，達(dá)到延長(zhǎng)半衰期的作用，能將平均半衰期提高到原來(lái)的1.6倍左右[16]。2015年11月13日，美國(guó)FDA批準(zhǔn)Baxalta公司生產(chǎn)的BAX855(Adynovate)用于成人和12歲及以上年齡的青少年血友病A患者，借助PEG技術(shù)，每周2次的預(yù)防治療方案能使該藥能在血液中維持較長(zhǎng)的時(shí)間[17]，同類型的還有Bayer公司生產(chǎn)的BAY94-9027，Novo Nordisk公司生產(chǎn)的N8-GP。有報(bào)道顯示PEG會(huì)殘留在網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)，但目前暫沒(méi)有證據(jù)提示殘留PEG的長(zhǎng)期毒性[18-19]。N9-GP(Rebinyn)是由Novo Nordisk公司研制的PEG聚合化的長(zhǎng)效rFⅨ制劑，能將平均半衰期提高到原來(lái)的6倍，臨床試驗(yàn)仍在進(jìn)行中[20]。

3.3.2融合蛋白表達(dá) 融合蛋白法是延長(zhǎng)rFⅧ和rFⅨ半衰期的另一個(gè)策略，包括清蛋白融合法和Fc片段(免疫球蛋白IgG恒定區(qū))融合法。研究顯示，將清蛋白與FⅨ融合后能將半衰期較傳統(tǒng)rFⅨ延長(zhǎng)至少5倍；將Fc片段與FⅧ融合后，凝血因子可避免被溶酶體降解，半衰期可延長(zhǎng)1.6倍，但遠(yuǎn)低于Fc片段與FⅨ融合的效果，后者的半衰期可延長(zhǎng)3.0～4.0倍[21-22]。

Biogen Idec公司生產(chǎn)的Efmoroctocog alfa (Eloctate) 是一種與Fc片段相融合的缺失B結(jié)構(gòu)域的人FⅧ因子類似物，2014年由FDA批準(zhǔn)用于血友病A兒童及成人患者的首個(gè)長(zhǎng)效重組藥物。該藥每隔3～5天預(yù)防性輸注，在控制和預(yù)防出血事件、圍術(shù)期管理和常規(guī)預(yù)防等方面均優(yōu)于常規(guī)藥物[21]。該公司生產(chǎn)的另一種重組因子Ⅸ Fc融合蛋白療法新藥Alprolix(rFIX-Fc)，用于血友病B的治療，適用于所有年齡段的B型血液病患者的按需治療和預(yù)防性治療。預(yù)防性用藥時(shí)，可以每隔7或10天給藥一次[22]。

4 基因治療( gene therapy)

目前替代治療是血友病患者的主要治療方式，但由于血友病是單基因遺傳病，因子活性水平的輕度變化即可改變疾病的表型，因此對(duì)于血友病，基因治療是最理想的方式，也是根治血友病的唯一辦法?；蛑委熂词峭ㄟ^(guò)載體將正常的FⅧ和FⅨ基因轉(zhuǎn)導(dǎo)入患者體內(nèi)。載體可分為病毒載體和非病毒載體，常用的病毒載體包括逆轉(zhuǎn)錄病毒載體(RV)、腺病毒載體(AV)、腺相關(guān)病毒載體(AAV)，而治療基因片段的大小影響載體的選擇。FⅧ基因片段較大，逆轉(zhuǎn)錄病毒和腺病毒是其主要載體，腺相關(guān)病毒是FⅨ的主要載體。此外，一些致力于基因修正的新技術(shù)如定向性重組染色體DNA的鋅指核酸酶技術(shù)(Zinc finger nuclease,ZFN)，高效基因編輯技術(shù)CRISPR/Cas9系統(tǒng)也在研究中[23]。

4.1腺相關(guān)病毒載體(adeno-associated virus，AAV) AAV是一種單鏈DNA細(xì)小病毒，無(wú)致病性、免疫原性，能夠使外源基因在肌肉、肝臟、中樞神經(jīng)系統(tǒng)長(zhǎng)期持續(xù)穩(wěn)定表達(dá)，因上述優(yōu)勢(shì)，AAV成為了基因治療血友病B的重要載體，也是近年來(lái)血友病B基因治療的研究熱點(diǎn)。有試驗(yàn)顯示，F(xiàn)Ⅸ嚴(yán)重缺乏者，經(jīng)AAV轉(zhuǎn)導(dǎo)FⅨ后，能將體內(nèi)FⅨ水平維持在3%～7%[24]。但由于AAV只能容納小于4 kb的基因片段，包裝容量小，因此一般不作為血友病A基因治療的載體。最近的研究通過(guò)對(duì)FⅧ的基因片段進(jìn)行修飾，可以去除B結(jié)構(gòu)域，優(yōu)化密碼子，且不影響其凝血功能，已經(jīng)能使AAV“適配”FⅧ[25]。BioMarin公司生產(chǎn)的BMN270(AAV5)作為FⅧ的載體已進(jìn)入Ⅰ期試驗(yàn)中。

4.2以細(xì)胞為基礎(chǔ)的基因整合 慢病毒載體(Lentiviral vectors,LV)是以細(xì)胞為基礎(chǔ)的另一種基因治療手段，與AAV不同的是，它能夠?qū)⒛康幕蛘系蕉喾N靶細(xì)胞的DNA中(如骨髓造血干細(xì)胞、肝竇內(nèi)皮細(xì)胞、多能干細(xì)胞分化的內(nèi)皮祖細(xì)胞)，具有目的基因表達(dá)時(shí)間長(zhǎng)、不易出現(xiàn)免疫反應(yīng)等優(yōu)點(diǎn)。在幼鼠模型中，使用特異性啟動(dòng)子能夠在血小板的α-顆粒內(nèi)異位表達(dá)FⅧ，當(dāng)血小板激活后，迅速釋放FⅧ到出血部位，從而減少異基因抗體的發(fā)生[26]。

5 結(jié) 語(yǔ)

長(zhǎng)久以來(lái)，替代治療仍是血友病最主要的治療方式，預(yù)防治療是改善血友病生存質(zhì)量的根本，血源凝血因子和重組凝血因子仍是替代治療最主要的藥物。近年來(lái)，基因治療策略及新型藥物如長(zhǎng)效凝血因子、非因子替代治療劑、抗凝血酶滅活劑等為血友病治療帶來(lái)了革新，特別是非因子替代治療劑、抗凝血酶滅活劑、TFPI拮抗劑，這些產(chǎn)品將徹底改變抑制物陽(yáng)性患者的治療方式，并為沒(méi)有抑制物的患者提供更方便的替代方案。以上藥物用量比因子產(chǎn)品少，并且具有皮下給藥而不是靜脈內(nèi)給藥的優(yōu)勢(shì)，此外，由于暴露于外源性因子產(chǎn)物是抑制物的產(chǎn)生因素，這些新產(chǎn)品盡可能減少或消除因子的暴露，有助于預(yù)防抑制物的產(chǎn)生?；蛟\治是現(xiàn)在最熱門的方向，雖處在臨床發(fā)展的早期階段，但為血友病的治療帶來(lái)了無(wú)限潛力，但其存在的免疫原性、安全性等諸多問(wèn)題仍需進(jìn)一步研究解決。