李 輝, 殷鵬程, 祝步拓, 林 浩, 劉志強(qiáng), 裴雁曦*, 牛麗芳*

1.山西大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院, 太原 030006;2.中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院生物技術(shù)研究所, 北京 100081

紫花苜蓿(Medicagosativa)是世界著名的優(yōu)良牧草，也是我國(guó)栽培面積最大的一種豆科飼料作物，由于其具有蛋白質(zhì)豐富、適應(yīng)性強(qiáng)、能改良土壤和經(jīng)濟(jì)價(jià)值高等優(yōu)點(diǎn)而享有“牧草之王”的美譽(yù)[1]。株高是直接決定苜蓿生物產(chǎn)量的重要農(nóng)藝性狀，同時(shí)也是衡量牧草生長(zhǎng)狀況的重要生理指標(biāo)之一[2]。苜蓿的株高性狀在整個(gè)生長(zhǎng)周期中大致呈現(xiàn)“S”型變化，已有研究發(fā)現(xiàn)株高越高的苜蓿品種，其生物產(chǎn)量也相對(duì)較高，株高性狀與苜蓿草產(chǎn)量之間呈正相關(guān)關(guān)系[3]。但目前關(guān)于苜蓿等豆科牧草株高性狀的分子調(diào)節(jié)機(jī)制還有待深入研究。

植物激素赤霉素(gibberellic acid,GA)在植物株高性狀的形成過程中發(fā)揮重要調(diào)控作用，已有研究發(fā)現(xiàn)GA合成途徑中的關(guān)鍵酶包括：古巴焦磷酸合成酶CPS(ent-copalyldiphosphate synthase)、內(nèi)根-貝殼杉烯合成酶KS(ent-kaurene synthase)、內(nèi)根-貝殼杉烯氧化酶KO(ent-kaurene oxidase)、內(nèi)根-貝殼杉烯酸氧化酶KAO(ent-kaurene acid oxidase)、GA3氧化酶GA3ox(GA3-oxidases)和GA20氧化酶GA20ox(GA20-oxidases)[4]等的功能缺失均導(dǎo)致植物呈現(xiàn)矮化的表型，而外源施加GA可使上述突變體的株高完全恢復(fù)到野生型水平[5]。

Ca2 +/陽(yáng)離子轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白(cation calcium exchanger/CAX)是一種選擇性運(yùn)輸鈣(Ca2+)等陽(yáng)離子的轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，是Ca2+/cation antiporter(Cation/H+antiporter，CaCA)大家族的一個(gè)分支[6]，在調(diào)節(jié)植物生長(zhǎng)、提高養(yǎng)分吸收和減輕土壤中污染物等方面發(fā)揮重要作用。擬南芥中的研究發(fā)現(xiàn)CAX蛋白通過調(diào)節(jié)植物細(xì)胞內(nèi)離子穩(wěn)態(tài)、pH和氧化還原水平的生理指標(biāo)，使植物細(xì)胞適應(yīng)一系列的非生物脅迫[7,8]。在重金屬離子脅迫條件下，CAX4(離子/ H+反向轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白)對(duì)于維持?jǐn)M南芥根生長(zhǎng)發(fā)育具有的重要調(diào)控作用[9]。此外，在擬南芥和棉花中的研究發(fā)現(xiàn)，CAX蛋白同樣參與調(diào)控植物對(duì)冷脅迫的應(yīng)答反應(yīng)[10,11]。但目前關(guān)于CAX家族蛋白參與調(diào)控植物株高方面的研究還鮮有報(bào)道。

本研究利用豆科模式植物蒺藜苜蓿為實(shí)驗(yàn)材料，通過定向篩選分離鑒定了一個(gè)矮化突變體compactstalkinternodes(costin)， 通過正向遺傳學(xué)的方法克隆了COSTIN基因，該基因編碼一個(gè)鈣離子交換蛋白，進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)在costin突變體中赤霉素合成途徑關(guān)鍵基因表達(dá)下調(diào)，同時(shí)外施赤霉素GA3可以恢復(fù)costin突變體的矮化表型，表明COSTIN基因可能通過影響植物激素赤霉素的生物合成來調(diào)控蒺藜苜蓿的莖節(jié)伸長(zhǎng)最終導(dǎo)致植株的矮化，本研究旨在為揭示苜蓿等豆科牧草株高性狀形成的分子機(jī)制及遺傳改良研究提供新的思路。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1實(shí)驗(yàn)材料 野生型材料為蒺藜苜蓿(Medicagotruncatula) R108，由實(shí)驗(yàn)室保存。蒺藜苜蓿Tnt1插入突變體NF15084(costin-1)、NF3011(costin-2)和NF2734(costin-3)購(gòu)自美國(guó)諾貝爾研究所。蒺藜苜蓿生長(zhǎng)條件為：溫度24℃，濕度 70%，光照強(qiáng)度 380 μM/m2·S，光周期 16 h(光)/8 h(暗)，適時(shí)澆灌，用于DNA、RNA提取和表型數(shù)據(jù)收集。

1.1.2實(shí)驗(yàn)試劑 高保真酶KOD FX購(gòu)自東洋紡公司；2×TaqPCRMix購(gòu)自艾德萊生物科技有限公司；TRIzol和焦炭酸二乙酯(DEPC)購(gòu)自Invitrogen公司；反轉(zhuǎn)錄試劑盒TransScript-Uni One-Step gDNA Removal and cDNA Synthesis SuperMix和實(shí)時(shí)熒光定量試劑盒Trans Tip Green q-PCR SuperMix購(gòu)自TransGen Biotech公司；赤霉素GA3購(gòu)自Sigma公司。

1.1.3實(shí)驗(yàn)器材 Eppendorf centrifuge 5424R/5702R/5430R 離心機(jī)、Roche LightCycler 96 型Real-time PCR system、Bio-Rad 穩(wěn)壓穩(wěn)流電泳儀、原平皓凝膠成像系統(tǒng)、NanoDrop 2000c和Nikon EOS 600D 照相機(jī)。引物合成和測(cè)序由Invitrogen公司完成。

1.2 方法

1.2.1蒺藜苜蓿表型數(shù)據(jù)收集 取生長(zhǎng)4周左右的植株苗，收集野生型和costin突變體的表型。統(tǒng)計(jì)從下往上數(shù)第二復(fù)葉到第三復(fù)葉的節(jié)間距和從下往上數(shù)第五片復(fù)葉頂生小葉的面積，并用Image J進(jìn)行節(jié)間距和葉片面積的測(cè)量。

1.2.2定量PCR檢測(cè)突變體中COSTIN基因表達(dá)情況 采用Trizol法分別提取蒺藜苜蓿生長(zhǎng)4周的野生型、NF15084、NF3011和NF2734的復(fù)葉總RNA, 參照TransGen Biotech反轉(zhuǎn)錄試劑盒TransScript-Uni One-Step gDNA Removal and cDNA Synthesis SuperMix的操作說明合成cDNA的第一條鏈。以植物體內(nèi)組成型表達(dá)的基因MtActin作為內(nèi)標(biāo)(引物序列見表1)，使用半定量RT-PCR的方法對(duì)3個(gè)突變體中的COSTIN基因表達(dá)情況進(jìn)行檢測(cè)(特異性引物序列見表1)。PCR反應(yīng)體系為(10μL)：2×TaqMix 5 μL,模板cDNA 1 μL,引物COSTIN-F(10 μmol/L)、COSTIN-R(10 μmol/L)各0.5 μL，ddH2O 3 μL。PCR反應(yīng)程序：98℃ 2 min；98℃ 30 s，55℃ 30 s，72℃ 1 min；72℃ 2 min；24℃ 1 min。其中MtActin基因28個(gè)循環(huán)，COSTIN基因40個(gè)循環(huán)。

表1 實(shí)驗(yàn)所用引物序列Table 1 Primers used in the experiment.

1.2.3COSTIN蛋白序列分析 將COSTIN蛋白序列在NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)進(jìn)行同源比對(duì)，篩選獲得與擬南芥同源性最高的CAX7蛋白。隨后用BioEdit軟件對(duì)COSTIN與CAX7蛋白進(jìn)行序列比對(duì)分析。

1.2.4熒光實(shí)時(shí)定量PCR 收集不同發(fā)育時(shí)期野生型的各個(gè)組織，包括生長(zhǎng)4周的根和根瘤，生長(zhǎng)2周的子葉、單葉和未展開的復(fù)葉，生長(zhǎng)4周展開的復(fù)葉，營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)時(shí)期苗的頂端，莖，生殖生長(zhǎng)時(shí)期苗的頂端、幼花、成熟花和直徑3 mm的果莢，用于分析COSTIN基因的組織表達(dá)特異性。收集生長(zhǎng)4周野生型和costin突變體的未展開復(fù)葉用于比較赤霉素合成途徑關(guān)鍵基因(CPS、KS、KO、KAO1、GA20ox1、GA20ox2、GA20ox4、GA20ox6、GA20ox7和GA3ox1[12,13])的表達(dá)變化。采用Trizol法提取上述各組織的總RNA，參照TransGen Biotech反轉(zhuǎn)錄試劑盒(TransScript-Uni One-Step gDNA Removal and cDNA Synthesis SuperMix)的操作說明合成cDNA的第一條鏈。隨后以反轉(zhuǎn)錄合成的第一條cDNA鏈為模板，參照TransGen Biotech的Trans Tip Green q-PCR SuperMix的操作方法用熒光定量特異性引物進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR(特異性引物序列見表1)，3次生物學(xué)重復(fù)。用MtActin作為內(nèi)參基因進(jìn)行歸一化處理。實(shí)時(shí)熒光定量PCR反應(yīng)在Roche LightCycler 96實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀上進(jìn)行，用2-△△Ct計(jì)算方法分析結(jié)果。引物序列見表1。

1.2.5costin突變體外施赤霉素(GA3)處理 為了研究外源GA3處理對(duì)突變體株高的影響，將野生型和costin突變體種植于溫室中生長(zhǎng)1周后，隔天噴施2 mmol/L GA3溶液。由于GA3是用無水乙醇溶解的，所以對(duì)照組的植物材料噴施同樣計(jì)量的無水乙醇。噴施3周后觀察野生型和costin突變體下部節(jié)間生長(zhǎng)狀況。

2 結(jié)果與分析

2.1 costin突變體分離及其表型分析

為了研究蒺藜苜蓿株高調(diào)控的分子機(jī)理，我們從蒺藜苜蓿Tnt1逆轉(zhuǎn)座子插入突變體庫(kù)中篩選獲得突變體NF15084，相比于野生型(圖1A,1C，彩圖見圖版二)，其植株明顯矮化(圖1B,1D)。該突變體下部節(jié)間(圖1F)明顯短于野生型(圖1E)，因此將其命名為compactstalkinternodes-1(costin-1)。對(duì)野生型和costin-1突變體從下往上數(shù)第二復(fù)葉和第三復(fù)葉的節(jié)間距進(jìn)行測(cè)量發(fā)現(xiàn)costin-1節(jié)間距與野生型相比顯著縮短(圖2A)；且costin-1突變體葉片(圖1G)明顯偏小(圖1H)，對(duì)野生型和costin第五復(fù)葉的頂生小葉進(jìn)行測(cè)量發(fā)現(xiàn)costin-1葉面積顯著減小(圖2B)。

圖1 costin-1突變體表型Fig.1 The phenotype of costin-1.注：A、C、E、G: 野生型植株；B、D、F、H: costin-1突變植株；A～D：植株形態(tài)； E、F：下部節(jié)間；G、H：第五片復(fù)葉(Bars=1 cm)。 (彩圖見圖版二)

圖2 野生型和contin-1突變體下部節(jié)間距和葉面積統(tǒng)計(jì)Fig.2 The length of stalk internode and area of leaves in wild type and costin-1. A：野生型R108與costin-1突變體第二復(fù)葉和第三復(fù)葉的節(jié)間距；B：野生型R108和costin-1第五復(fù)葉的頂生小葉葉面積。其中，樣品數(shù)為 15，**表示與野生型相比差異極顯著(P<0.01)。

上述結(jié)果表明costin-1突變體的矮化是由于下部節(jié)間生長(zhǎng)受到抑制所導(dǎo)致的。

2.2 COSTIN基因克隆

為了尋找costin-1植株矮化的控制基因，我們?cè)谳疝架俎nt1數(shù)據(jù)庫(kù)(https://medicago-mutant.noble.org/mutant/database.php)下載并分析了NF15084的側(cè)翼序列，基于表型和基因型連鎖性分析的結(jié)果(圖3)，鑒定到一個(gè)候選基因Medtr6g027580，該基因只含有一個(gè)外顯子。costin-1突變體中的Tnt1插入在Medtr6g027580基因的520 bp處(圖4A)。RT-PCR檢測(cè)發(fā)現(xiàn)costin-1突變體中沒有全長(zhǎng)COSTIN基因的表達(dá)(圖4B)。為了進(jìn)一步證明COSTIN基因與表型的連鎖關(guān)系，我們用該基因的另外兩個(gè)Tnt1插入突變體NF3011(costin-2)和NF2734(costin-3)，costin-2中Tnt1插入在編碼區(qū)310 bp處，costin-3中Tnt1插入在編碼區(qū)828 bp處(圖4A)，這兩個(gè)突變體的純合子均表現(xiàn)出與costin-1相似的表型。RT-PCR檢測(cè)發(fā)現(xiàn)在costin-2和costin-3中也沒有全長(zhǎng)COSTIN基因的表達(dá)(圖4B)。上述結(jié)果證明costin-1突變體植株矮化和葉片變小等發(fā)育異常的表型是由于COSTIN基因的功能缺失造成的。

圖3 表型基因型連鎖性分析Fig.3 Genotyping analysis of costin-1.注：R108為對(duì)照野生型，1～3為突變體的矮化表型；4～13單株為野生型表型。

圖4 COSTIN基因結(jié)構(gòu)圖和突變體中CONTIN的表達(dá)檢測(cè)Fig.4 Molecular cloning of COSTIN in M. truncatula. A：COSTIN基因結(jié)構(gòu)示意圖和Tnt1逆轉(zhuǎn)座子的插入位置。B：RT-PCR檢測(cè)CONTIN在突變體中的表達(dá)。

2.3 COSTIN蛋白序列比對(duì)

如圖5(彩圖見圖版二)所示，蛋白序列比對(duì)發(fā)現(xiàn)COSTIN與擬南芥鈣轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白CAX7 (CALCIUM EXCHANGER 7) 高度同源，氨基酸序列一致性為50%，同時(shí)具有α-1和α-2兩個(gè)保守結(jié)構(gòu)域，是陽(yáng)離子的結(jié)合結(jié)構(gòu)域。

2.4 COSTIN基因的組織表達(dá)模式分析

COSTIN基因在蒺藜苜蓿中發(fā)揮的功能目前還沒有任何報(bào)道，為了明確COSTIN在苜蓿生長(zhǎng)發(fā)育過程中可能發(fā)揮的作用，分析了COSTIN基因的組織表達(dá)模式。實(shí)時(shí)熒光定量PCR (qRT-PCR) 檢測(cè)發(fā)現(xiàn)COSTIN基因在蒺藜苜蓿的葉、莖和果莢中具有較高表達(dá)量，與COSTIN基因的生物學(xué)功能相吻合(圖6)。

2.5 赤霉素對(duì)株高的影響

由于costin突變體植株矮化，推測(cè)可能是由于其內(nèi)源赤霉素含量減少所導(dǎo)致，于是對(duì)野生型和costin突變體植株進(jìn)行外噴GA3處理。取生長(zhǎng)1周的幼苗，隔天噴施2 mmol/L的GA3，一個(gè)月后進(jìn)行表型觀察。由于GA3溶解在無水乙醇中，因此外噴相應(yīng)量的無水乙醇溶液作為對(duì)照。與未噴施GA3的野生型對(duì)照相比(圖7A，彩圖見圖版三)，外施赤霉素使得野生型下部節(jié)間明顯伸長(zhǎng)(圖7C)，說明植株對(duì)外源GA3響應(yīng)正常。與未噴施GA3的costin突變體植株相比(圖7B)，外噴GA3使得costin植株下部節(jié)間明顯伸長(zhǎng)(圖7D)，長(zhǎng)度接近于噴施GA3的野生型對(duì)照(圖7C)，表明costin突變體植株矮化的表型確實(shí)是由于其內(nèi)源赤霉素含量降低所導(dǎo)致。

圖5 COSTIN與CAX7蛋白序列比對(duì)Fig.5 Amino acid sequence alignment of COSTIN and CAX7.注：紅線標(biāo)記表示α-1和α-2保守結(jié)構(gòu)域位置。(彩圖見圖版二)

圖6 COSTIN基因的表達(dá)模式Fig.6 The expression pattern of COSTIN.

2.6 costin突變體中赤霉素合成途徑關(guān)鍵基因的表達(dá)檢測(cè)

鑒于外施GA3可以恢復(fù)costin突變體植株矮化的表型，說明其內(nèi)源赤霉素的含量較野生型低，因此，我們檢測(cè)了costin突變體中赤霉素合成途徑關(guān)鍵基因的表達(dá)量(圖8)。結(jié)果表明，與野生型相比，costin突變體中MtCPS、MtKAO1、MtGA20ox4、MtGA20ox7和MtGA3ox1的表達(dá)量明顯降低。上述結(jié)果表明costin突變體中赤霉素合成途徑的關(guān)鍵基因表達(dá)量下降，由此導(dǎo)致costin突變體植株矮化的表型。

3 討論

享有“牧草之王”美譽(yù)的紫花苜蓿是世界上應(yīng)用最廣、經(jīng)濟(jì)價(jià)值最高和栽培面積最大的一種優(yōu)質(zhì)豆科飼料作物，苜蓿的產(chǎn)量和品質(zhì)改良是飼料業(yè)、畜牧業(yè)和奶業(yè)發(fā)展的重大迫切需求。

圖7 costin突變體植株外施赤霉素處理Fig.7 The phenotype of wild type and costin after spraying GA3. A：未噴施GA3的野生型；B：未噴施GA3的costin突變體；C：噴施2 mmol/L GA3的野生型；D：噴施2 mmol/L GA3的costin突變體。(Bars=1 cm) (彩圖見圖版三)

圖8 野生型和costin突變體中赤霉素合成通路關(guān)鍵基因的表達(dá)比較分析Fig.8 The expression level of marker genes in gibberellin pathway of the wild-type and costin plants.注： *表示與野生型相比差異顯著(t測(cè)驗(yàn)，P<0.05)，**表示與野生型相比差異極顯著(P<0.01)，每個(gè)實(shí)驗(yàn)設(shè)置3次重復(fù)。

株高是決定苜蓿草產(chǎn)量的重要農(nóng)藝性狀，研究結(jié)果表明，苜蓿鮮草產(chǎn)量與株高呈正相關(guān)關(guān)系[14]，但目前關(guān)于苜蓿等豆科牧草株高性狀的遺傳調(diào)控機(jī)制還有待深入研究。本研究利用豆科模式牧草蒺藜苜蓿為實(shí)驗(yàn)材料，通過對(duì)矮生突變體costin的初步研究，發(fā)現(xiàn)在costin突變體中GA合成途徑關(guān)鍵基因表達(dá)水平顯著下調(diào)，同時(shí)外施赤霉素GA3可以恢復(fù)costin突變體的矮化表型，表明costin突變體的矮化表型是由植物激素赤霉素合成缺失所導(dǎo)致。植物激素赤霉素(GA)是調(diào)控植物株高的重要植物激素，具有促進(jìn)細(xì)胞伸長(zhǎng)的作用，從而使植株增高[15]，農(nóng)業(yè)生產(chǎn)上第一次“綠色革命”就是利用農(nóng)作物本身的赤霉素合成和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)缺陷所產(chǎn)生的矮化植株來培育抗倒伏農(nóng)作物新品種，從而大幅度提高了農(nóng)作物的產(chǎn)量。本研究進(jìn)一步表明植物激素赤霉素在苜蓿等豆科牧草的株高發(fā)育過程中同樣存在保守的調(diào)控機(jī)制。

鈣是植物必須的營(yíng)養(yǎng)元素，同時(shí)也是植物體內(nèi)轉(zhuǎn)導(dǎo)多種生理過程的重要信號(hào)物質(zhì)[16]。已有研究發(fā)現(xiàn)植物細(xì)胞壁里的鈣離子具有降低細(xì)胞壁伸展性的作用，而赤霉素能使細(xì)胞壁里的鈣離子進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)中，使細(xì)胞壁的鈣水平下降，進(jìn)而增強(qiáng)細(xì)胞壁的伸展性，導(dǎo)致細(xì)胞生長(zhǎng)加快，從而使植物體的高度增加[17]。COSTIN基因編碼一個(gè)鈣離子轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，可能參與蒺藜苜蓿體內(nèi)的鈣離子轉(zhuǎn)運(yùn)過程。盡管目前關(guān)于蒺藜苜蓿鈣轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白COSTIN與鈣離子信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)以及植物激素赤霉素之間具體的調(diào)控機(jī)制仍然未知，但本研究為闡明高等植物株高性狀形成的分子調(diào)控網(wǎng)絡(luò)和苜蓿株高性狀遺傳改良提供了新的研究思路。

[1] 王代軍. 人類對(duì)苜蓿加工產(chǎn)品的利用及開發(fā)前景 [A]. 見：首屆中國(guó)苜蓿發(fā)展大會(huì)論文集[C].北京, 2001.

[2] 多立安. 國(guó)外人工草地的建設(shè)管理及發(fā)展我國(guó)人工草地的幾點(diǎn)建議 [J]. 黑龍江畜牧科技, 1991(1): 49-53.

[3] 劉自學(xué). 中國(guó)草業(yè)的現(xiàn)狀與展望 [J]. 草業(yè)科學(xué), 2002, 19(1): 6-8.

[4] Yamaguchi S. Gibberellin metabolism and its regulation [J]. Annu. Rev. Plant Biol., 2008, 59: 225-251.

[5] Sakamoto T, Miura K, Itoh H,etal.. An overview of gibberellin metabolism enzyme genes and their related mutants in rice [J]. Plant Physiol., 2004, 134(4): 1642-1653.

[6] Shigaki T, Hirschi K D. Diverse functions and molecular properties emerging for CAX cation/H+exchangers in plants [J]. Plant Biol., 2006, 8(4): 419-429.

[7] Conn S J, Gilliham M, Athman A,etal.. Cell-specific vacuolar calcium storage mediated byCAX1 regulates apoplastic calcium concentration, gas exchange, and plant productivity inArabidopsis[J]. Plant Cell, 2011, 23: 240-257.

[8] Cho D, Villiers F, Kroniewicz L,etal.. Vacuolar CAX1 and CAX3 influence auxin transport in guard cells via regulation of apoplastic pH [J]. Plant Physiol., 2012, 160(3): 1293-1302.

[9] Mei H, Cheng N H, Zhao J,etal.. Root development under metal stress inArabidopsisthalianarequires the H+/cation antiporter CAX4 [J]. New Phytol., 2009, 183(1): 95-105.

[10] Catala R, Santos E, Alonso J M,etal.. Mutations in the Ca2+/H+transporter CAX1 increaseCBF/DREB1 expression and the cold-acclimation response inArabidopsis[J]. Plant Cell, 2003, 15(12): 2940-2951.

[11] Xu L, Zahid K R, He L,etal..GhCAX3 gene, a novel Ca(2+)/H(+) exchanger from cotton, confers regulation of cold response and ABA induced signal transduction [J]. PLoS ONE, 2013, 8(6): e66303.

[12] Lo S F, Yang S Y, Chen K T,etal.. A novel class of gibberellin 2-oxidases control semidwarfism, tillering, and root development in rice [J]. Plant Cell, 2008, 20(10): 2603-2618.

[13] Igielski R, Kepczynska E. Gene expression and metabolite profiling of gibberellin biosynthesis during induction of somatic embryogenesis inMedicagotruncatulaGaertn [J]. PLoS ONE, 2017, 12(7): e0182055.

[14] 趙 萍，趙功強(qiáng), 馬 莉. 半干旱地區(qū)旱地苜蓿合理群體結(jié)構(gòu)研究 [J]. 畜牧與飼料科學(xué), 2009, 30(9): 71-73.

[15] Asano K, Hirano K, Ueguchi-Tanaka M,etal.. Isolation and characterization of dominant dwarf mutants,Slr1-d, in rice [J]. Mol. Genet. Genom., 2009, 281(2): 223-231.

[16] 王瑞云，王玉國(guó). 鈣在植物生理代謝中的作用 [J]. 世界農(nóng)業(yè), 2001(6): 41-43.

[17] 彭映輝，曾冬琴, 陳飛飛,等. 赤霉素及多效唑?qū)?種草本花卉花期與株高的影響 [J]. 中南林業(yè)科技大學(xué)學(xué)報(bào), 2007, 27(4): 100-103.