王顥潛 陳銳 李夏瑩 王夢雨 劉鵬程

（1. 農業(yè)部科技發(fā)展中心，北京 100176；2. 天津市農業(yè)質量標準與檢測技術研究所，天津 300192；3. 中國農業(yè)大學植物保護學院，北京 100193）

轉基因技術在農業(yè)領域的應用與發(fā)展十分迅猛，已成為世界各國農業(yè)科技競爭的焦點。據(jù)統(tǒng)計，在轉基因作物商業(yè)化21 年間（從1996-2016年），全球轉基因作物的商業(yè)化種植面積持續(xù)增長，累計達到了21 億hm2，這使轉基因生物技術成為近年來應用最為迅速的作物技術［1］。轉基因生物技術給人類帶來了巨大經濟效益的同時也引發(fā)了社會關于轉基因植物安全性問題的爭議，鑒于食用安全長期效應無法確證等問題，當前的研究成果尚不能對轉基因安全給出準確、全面的結論。為加強對轉基因產品的管理，世界各國都在積極完善和落實相應的法律法規(guī)。但是，目前不同國家和地區(qū)的轉基因法律法規(guī)、標識制度、閾值范圍和管理方式上存在較大差異，對轉基因產品的進出口檢驗、國際貿易互認等方面造成了較大的影。由此可見，轉基因檢測技術的需求是一直存在的，并隨著轉基因技術應用的快速發(fā)展顯得尤為迫切。開發(fā)便捷、高效的轉基因檢測方法，尤其是精準的定量檢測技術，建立相應的檢測技術體系對促進轉基因農業(yè)發(fā)展、保護我國農產品進出口貿易利益、滿足轉基因生物安全監(jiān)管需求以及完善轉基因標識管理制度等方面意義重大。目前國內外對轉基因產品的檢測技術根據(jù)檢測原理的分為兩類，即基于外源核酸的檢測技術和基于外源蛋白的檢測技術。本文就轉基因產品成分檢測技術的原理、優(yōu)缺點、研究進展和發(fā)展方向做一簡要概述，旨在促進我國轉基因產品成分檢測技術更好地適應當前轉基因領域的發(fā)展和滿足轉基因生物安全監(jiān)管的需求。

1 基于外源核酸的檢測技術

核酸是絕大多數(shù)生命體的遺傳物質，具有較高的穩(wěn)定性和普遍性，因此以脫氧核糖核酸（DNA）為靶標的檢測技術是目前最成熟、應用最廣泛的轉基因產品檢測技術［2］。根據(jù)外源DNA片段序列特征和插入位置的不同，核酸檢測可以對篩選元件特異性、基因特異性、載體構建特異性和轉化事件特異性四個方面進行檢測［3-5］?；谕庠春怂岬霓D基因檢測技術主要有：定性PCR技術、定量PCR技術、等溫擴增技術和基因芯片技術等。

1.1 定性PCR技術

定性PCR也稱為普通PCR（Conventional PCR），是一種基于聚合酶鏈式反應的檢測技術，是目前應用于轉基因檢測最廣泛的方法［6］。此法不受材料加工程度的影響，可以對種子到終產品的轉基因成分進行定性檢測，且靈敏度高、操作簡便，成為許多國家用于市場篩查轉基因成分的首選方法，如巴西［7］、科威特［8］、伊朗［9］、沙特阿拉伯［10］、約旦［11］、塞爾維亞［12］及敘利亞［13］等國家。

普通PCR單次反應只能檢測特定靶序列，無法滿足大量、快速的轉基因產品檢測需求。以常規(guī)PCR方法為基礎改進PCR方法也得到了廣泛的應用。例如，多重PCR（Multiplex PCR）在檢測通量和成本控制方面具備優(yōu)勢，近年來也被廣泛關注和深入研究。Datukishvili等［14］針對轉基因大豆開發(fā)了4重PCR體系，能夠同時檢測CaMV35S 啟動子、NOS終止子、epsps基因與大豆內源基因lectin，還開發(fā)了轉基因玉米3重PCR體系，能夠同時檢測啟動子、cry1Ab基因和玉米內源基因zein，該方法特異性良好，并且靈敏度均能達到0.1%；Harikai等［15］結合多重PCR與引物延伸的方法，將生物素標記的核酸 dUTP混入到引物延伸產物中，可直接光學檢測8重PCR擴增產物，檢測時間短，靈敏度可達1%；Mano等［16］將多重PCR與多重連接酶擴增反應（Multiplex ligase chain reaction，LCR）偶聯(lián)，針對7個轉基因元件和3個內源基因開發(fā)出了高效的多重轉基因檢測方法；Patwardhan等［17］開發(fā)了多重PCR-毛細管電泳方法可同時檢測轉基因棉花MON531、轉基因馬鈴薯EH 92-527-1、轉基因玉米Bt176、轉基因玉米GA21和轉基因油菜GT73 canola，檢測低限為0.1%。

對于普通PCR靈敏度不高，對含量低、成分復雜和被嚴重破壞的DNA樣品難以準確檢測的缺點，在普通PCR的基礎上開發(fā)出了巢式PCR（Nested PCR）和半巢式PCR（Semi-Nested PCR）技術。該技術的原理是在擴增產物的片段上引入新的引物，通過二次擴增反應對某段序列進行檢測，以提高檢測的準確度和靈敏性。敖金霞等［18］建立了適用于轉基因大豆、玉米及水稻深加工產品的五重巢式PCR 技術，檢測靈敏度為0.005%；閆偉等［19］建立的單管巢式和半巢式PCR方法可準確、高效地檢測轉基因玉米MON89034及其產品，此方法的相對檢出限達到0.01%，絕對檢出限為4個單倍體基因組拷貝數(shù)，比普通PCR提高了5倍。

隨著定性PCR技術的發(fā)展，熱不對稱交錯PCR、連接介導PCR和反向PCR在轉基因分子鑒定和單鏈DNA制備等方面開始廣泛應用［20-21］。

1.2 定量PCR技術

目前，越來越多的國家通過設定閾值對轉基因產品進行標識管理，轉基因成分含量超過設定閾值的轉基因產品必須強制性標識，如歐盟為0.9%，澳大利亞、巴西為1%，馬來西亞、韓國為3%，日本、中國臺灣為5%［22-23］。隨著世界各國轉基因產品標識制度的發(fā)展和完善，應用定量PCR技術對轉基因產品進行定量標識將越來越廣泛［24］。定量PCR技術主要有競爭性定量PCR技術（Competitive quantitative PCR，QC-PCR）、實時定量 PCR技術（Real-time fluorescence quantitative PCR，qPCR） 和數(shù)字PCR技術（Digital PCR，dPCR）3種。

1.2.1 競爭性定量PCR技術 競爭性定量PCR通過向PCR反應體系中加入與目標DNA具有相同擴增效率和引物結合位點的競爭模板，同時以不同稀釋梯度的競爭模板建立標準曲線，從而計算目標DNA的含量［2，23］。Garcíaca?as等［25］將 QC-PCR 方法與毛細管電泳激光誘導熒光技術巧妙結合，實現(xiàn)了玉米Bt176品系的定量檢測；Mavropoulou等［26］研究證明QC-PCR比實時定量PCR靈敏度高且探針價格低廉。QC-PCR技術的難點在于競爭模板的設計。

1.2.2 實時定量PCR技術 實時定量PCR通過熒光標記實時監(jiān)控目的片段的擴增，根據(jù)待測物起始濃度與Ct（Threshold Cycle）值線性相關的原理，從而實現(xiàn)靶標基因的精確定量，已廣泛應用于轉基因產品的定量檢測［27］。qPCR試驗中，選擇恰當?shù)膬仍椿虿Ⅱ炞C特異引物是定量檢測的關鍵因素［28］。目前，qPCR檢測技術已被廣泛應用于大豆［29］、玉米［30］、水稻［31］、菜豆［32］、棉花［33］、茄子［5］、木瓜［34］和釀酒酵母［35］的轉基因成分檢測，具備良好的特異性和較高的靈敏度。隨著規(guī)模化和快速化轉基因檢測的需求，多重qPCR技術得到了發(fā)展。D?rries等［36］針 對 P-35S、T-NOS、bar和 FMV35S設計了多重定量PCR預混液，檢測低限均能達到10個拷貝，并且在41個非轉基因植物中驗證其特異性良好；Li等［37］設計了四重定量PCR可同時檢測轉基因棉花GHB119 的T304-40的事件特異性與外源基因Cry2Ae，檢出限為10個拷貝，定量限為20-25個拷貝。qPCR具有操作簡便、靈敏度高，但成本較高，存在重現(xiàn)性較差的問題。

1.2.3 數(shù)字PCR技術 數(shù)字PCR是一種基于泊松分布原理的針對單分子目標DNA的絕對定量技術［38］。相對qPCR技術，dPCR不需要對每個循環(huán)進行實時熒光測定，也不需要Ct值來定量靶標。dPCR通過將反應試劑平均分配到幾萬至上千萬個單元中，從而使靶標DNA稀釋到單分子水平。擴增結束后，通過直接計數(shù)或泊松分布計算得到樣品的原始拷貝數(shù)，因此其不受擴增效率的影響，也不必使用內參基因和標準曲線，具有極高的準確度和重現(xiàn)性。目前，dPCR 已應用于轉基因玉米［39］、水稻［40］、大豆［41］及深加工產品［42］中的定量檢測中。

當前的dPCR技術平臺主要有兩種，一種是基于固態(tài)平臺開發(fā)的芯片式數(shù)字PCR技術，由Fluidigm公司基于集成流體通路（IFC）芯片與Life Technologies的OpenArray為代表；另一種是基于液體微滴的數(shù)字PCR技術，由Bio-Rad公司和RainDance公司產品為代表。Li等［43］基于Fluidigm公司開發(fā)的動態(tài)芯片技術建立了高通量數(shù)字PCR轉基因檢測方法，可同時檢測48個樣本中的48個靶標基因，包括7個轉基因元件、36個事件特異性基因和5個內源基因，為克服基因組DNA上樣拷貝數(shù)稀少的問題，該研究還利用8-14個循環(huán)的預擴增來優(yōu)化檢測方法，最終的檢測低限為0.05 ng。

dPCR特異性強、準確度高，常用來確定轉基因標準物質的量值。Corbisier等［44］利用dPCR技術對轉基因玉米MON810的標準物質進行拷貝數(shù)測定，結果表明dPCR相對qPCR在絕對定量方面具備優(yōu)勢，可用于標準物質的校正；Liang等［45］利用Fluidigm平臺對轉基因水稻kefeng6的質粒參考物質進行檢測，同樣證實數(shù)字PCR可用于轉基因標準物質的拷貝數(shù)驗證。目前，美國國家標準與技術研究 院（National Institute of Standards and Technology，NIST）已開發(fā)出全球首例由dPCR校準的DNA標準物質，可用于人類巨細胞病毒的溯源和檢測結果比對［46］。

最新的研究表明，dPCR技術還是檢驗外源插入基因拷貝數(shù)和純合性的有效方法。Glowacka等［47］在轉基因煙草中比較了Southern blot、熱不對稱交錯PCR、定量PCR和數(shù)字PCR等方法，用于分析插入的T-DNA拷貝數(shù)、位點復雜性和純合性，結果表明dPCR與Southern blot結果一樣可靠，并且在試驗操作上更加快速和便捷。雖然目前來看dPCR技術存在成本昂貴等缺陷，但其絕對定量的屬性在轉基因檢測中有著廣闊前景。

1.3 等溫擴增技術

等溫擴增技術是指在一個恒定溫度下，通過不同活性的酶和各種特異性引物來實現(xiàn)DNA擴增的方法，相對于PCR擴增技術具有快速、高效、特異的優(yōu)點且無需專用設備，在臨床和現(xiàn)場快速診斷中應用廣泛。主要方法有：環(huán)介導等溫擴增（LAMP）、滾環(huán)核酸擴增（RCA）、核酸序列依賴性擴增（NASBA）、鏈替代擴增（SDA）和解鏈酶擴增（HAD）［48］等。

在轉基因檢測領域最常用的主要是LAMP技術，它是由Notomi等發(fā)明的一種等溫核酸擴增技術［49］?；驹硎轻槍δ繕薉NA的6個不同區(qū)域設計4條不同的引物，依賴鏈置換DNA聚合酶，在恒溫下進行擴增反應，循環(huán)不斷地產生不同長度的DNA片段，反應結果可通過凝膠電泳、焦磷酸鎂沉淀、實時比濁法、特定熒光染料等來判斷［24，48］；周杰等［50］建立了DAS-81419-2、FG72等6種轉基因大豆的LAMP檢測方法；Chen等［51］開發(fā)的針對轉基因水稻TT51-1的事件特異性檢測方法中，將鈣黃綠素和錳離子添加至LAMP體系中，可實現(xiàn)一步可視化檢測，方法靈敏度達10-20個拷貝。

最近的研究顯示，將LAMP技術與其他技術結合是轉基因檢測的發(fā)展趨勢。Cheng等［52］將LAMP與DNA酶橫向流動檢測試紙條技術結合，用于檢測復合性狀轉基因大豆DP305423×GTS 40-3-2，該方法具備良好的靈敏度和特異性；Shao等［53］開發(fā)了特殊的毛細管柱裝置，將LAMP特異引物固定于毛細管壁的內壁后，一次上樣并恒溫擴增后，可直接可視化檢測10個靶標基因的擴增結果，該方法操作簡便、通量高，可用于田間快檢和大規(guī)模轉基因篩查工作；Morisset等［54］將NASBA技術與芯片技術相結合，開發(fā)了多重轉基因檢測芯片，該方法的特異性與靈敏度與qPCR方法相當，定量檢測的線性范圍為0.1%-25%，是非常有潛力的高通量檢測方法。LAMP技術對設備要求低，具有直觀、高效的特點，已經成為出入境檢驗檢疫等行業(yè)標準轉基因成分檢測的一種指定方法，未來仍需克服假陽性較高、引物設計要求高等不足。

1.4 基因芯片技術

基因芯片技術（Gene chip）是基于核酸雜交的一項高通量檢測技術，利用固體在基質表面的上千個特定探針與標記的樣品進行雜交，通過分析雜交信號，能夠一次性準確地對樣品中不同種類的DNA序列進行定性、定量的篩查，已被廣泛應用于轉基因檢測等許多領域。Tengs等［55］設計了包含約4萬個探針的Tilling芯片，涵蓋絕大多數(shù)植物轉化用的載體序列，可用于篩查未知轉化事件；Turkec等［56］對3個轉基因大豆和9個轉基因玉米開發(fā)檢測芯片，篩選出33個探針可用于區(qū)分12個GMO事件，并開發(fā)了一套數(shù)據(jù)算法來實現(xiàn)最大的檢測通量和靈敏度?；蛐酒夹g滿足當前轉基因高通量、自動化檢測的需求，但由于其成本較高、芯片合成復雜、背景干擾嚴重等不足，一定程度影響了該技術的廣泛應用。

2 基于外源蛋白的檢測技術

基于外源蛋白的轉基因檢測技術是以免疫分析技術為基礎的對轉基因產品的外源表達蛋白進行定性和定量檢測的一種技術。常見的方法主要包括酶聯(lián)免疫吸附技術、Western blot 檢測技術和試紙條技術等。

2.1 酶聯(lián)免疫吸附技術

酶聯(lián)免疫吸附技術（Enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）通過抗原和抗體的可視免疫反應來檢測和鑒定目標蛋白，主要包括雙抗夾心法、直接法、間接法，其中靈敏度最高的雙抗夾心法應用最為廣泛［57］。Guertler等［58］利用雙抗體夾心ELISA檢測法實現(xiàn)了對轉基因產品中Cry1Ab蛋白的檢測，最低檢測限為0.4 ng/mL，特異性高于實時熒光PCR方法。目前，我國對已獲生產應用安全證書的轉基因抗蟲棉的衍生品系進行安全評價檢測時，采用ELISA檢測技術對抗蟲棉不同組織部位中Bt蛋白的表達量進行檢測，從而對抗蟲棉品種的抗性能力進行科學評價。新近發(fā)展起來的PCR- ELISA技術，結合了PCR方法的高效性和ELISA方法的高特異性，在轉基因檢測領域中極具潛力。利用PCR-ELISA方法檢測轉基因大豆的靈敏度比歐盟用的PCR方法高5-10倍，而且有效的避免了假陽性現(xiàn)象的產生［59］。

2.2 Western blot檢測技術

Western blot檢測技術本質是一種蛋白質轉移電泳技術，其原理是將聚丙烯酰胺凝膠上分離的蛋白質轉移到硝酸纖維素膜上，利用抗體反應和顯色酶反應實現(xiàn)對轉基因產品中外源蛋白的有效檢測。Wang等［60］利用Western blot 技術檢測到了轉基因煙草外源EPSPS 蛋白的表達；Yates等［61］利用Western blot技術對轉基因種子的檢出限能達到0.25%，深加工產品可達到1%，靈敏度較高。雖然Western blot技術操作較為繁瑣，也無法滿足快速高效檢測需求，但其可以有效地檢測轉基因產品中的不可溶蛋白。

2.3 試紙條技術

試紙條技術是基于免疫層析的一種快速檢測技術，較之ELISA 法更為簡便、快速，可在5-10 min的時間內現(xiàn)場觀測結果，在轉基因產品大規(guī)?？焖俸Y查檢測中應用廣泛。許多公司針對不同轉基因植物中特異表達的外源蛋白，開發(fā)出大量特異的免疫層析試紙條，如檢測孟山都公司轉基因Roundup Ready大豆和油菜中CP4-EPSPS蛋白的試紙條、Starlink玉米中Cry9c蛋白的試紙條等［62］。中國農科院油料所研制的Cry1Ab/Cry1Ac試紙條，成本為進口產品的40%，靈敏度等性能參數(shù)與進口試紙條相當，是農業(yè)部推薦使用的產品之一。由于試紙條技術具備操作簡便快速、特異性強、成本低廉等優(yōu)點，其發(fā)展和應用較為迅速。Santos等［63］研發(fā)了一種可以同時檢測Cry1Ac和Cry8Ka5殺蟲蛋白的試紙條，檢出限為0.06 μg，可以很好地區(qū)分抗蟲轉基因植物和非轉基因植物；Mutoni等［64］用PCR法和試紙條對肯尼亞市場上的120份玉米樣品進行轉基因檢測，兩種方法結果一致；張欣等［65］采用試紙條法檢測水稻樣品，結果準確，測試時間短于qPCR法，適用于水稻及其產品的現(xiàn)場檢測和大規(guī)模初篩；張裕君等［66］將PCR技術與試紙條技術相結合建立了一種可視化檢測轉基因黑曲霉的方法，該方法比傳統(tǒng)凝膠電泳法快捷且靈敏度高出10倍以上。隨著試紙條技術不斷完善，克服假陰性、假陽性和背景色較重的問題，提升靈敏度和實現(xiàn)多元檢測，試紙條在轉基因檢測中將發(fā)揮更重要的作用。

3 展望

綜上所述，基于外源核酸的檢測技術準確性高、穩(wěn)定性好、操作簡便，但轉基因產品中的多糖、蛋白等雜質會對檢測結果產生一定的干擾，而且DNA的提取質量對結果影響較大；基于外源蛋白的檢測技術靈敏度高、結果可靠、重復性好，但受后期加工環(huán)節(jié)的影響，而且外源蛋白在不同部位和不同時期的不同表達量會對檢測結果造成影響。在實際檢測過程中，并非任何一種檢測方法對某種轉基因產品的檢測都行之有效，每種方法都有其優(yōu)缺點和適用范圍，選擇檢測方法時應根據(jù)檢測的需要并結合轉基因產品的類型和特點，選擇最有效的方法或技術組合［67］。隨著商業(yè)化轉基因農作物品系的快速增長，以及轉基因生物安全評價與監(jiān)管需求，轉基因檢測日趨多樣化、復雜化。除以上介紹的方法之外，電化學發(fā)光分析技術、色譜技術、近紅外光譜檢測技術、生物傳感器技術、生物分子互作技術以及基于一些成熟技術建立起來的試劑盒技術、內標基因種屬特異性檢測技術等在轉基因產品的實際檢測中都有所應用。

隨著基因編輯和RNAi等轉基因新技術的應用與推廣，轉基因產品呈現(xiàn)出多樣化發(fā)展的趨勢。加之當前可用的轉基因分子特征信息十分有限，相關數(shù)據(jù)庫也并不完善，現(xiàn)有的轉基因檢測技術體系正面臨著巨大挑戰(zhàn)。建立快速、精準、低成本、高通量的轉基因檢測技術與方法已成當務之急。通過轉基因生物新品種培育科技重大專項科技項目的實施，我國轉基因檢測技術發(fā)展將越來越快。大力發(fā)展符合國情的、科學可靠的轉基因檢測技術，掌握核心技術，搶占領域高地，不僅關乎國家利益，而且對推動轉基因產業(yè)發(fā)展及維護環(huán)境和食品安全方面都具有十分重要的意義。

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