曹　婧　侯春久　黃志飄

竹葉為禾本科植物竹葉(Lophatherum gracile Brongn.)的干燥莖葉，性寒，味甘、淡，歸心、胃、小腸經(jīng)，有清熱除煩、利尿的功效，用于熱病煩渴，小便赤澀淋痛，口舌生瘡等癥[1-3]。竹葉主要含有黃酮、三萜類、多糖、酚性成分、氨基酸、有機(jī)酸及多種微量元素，其中黃酮為主要有效成分[4]。本實(shí)驗(yàn)以竹葉總黃酮為對(duì)象，采用乙醇水浴浸提的方式，通過響應(yīng)面分析法對(duì)工藝進(jìn)行優(yōu)化，對(duì)擬合數(shù)學(xué)模型進(jìn)行描述，為竹葉總黃酮的進(jìn)一步開發(fā)和利用提供科學(xué)依據(jù)[5-6]。

1　實(shí)驗(yàn)器材

1.1主要儀器 JY/JP電子天平（上海上天精密儀器有限公司）；722型紫外/可見分光光度計(jì)（上海光譜儀器有限公司）；實(shí)驗(yàn)室小型粉碎機(jī)，干燥箱（金壇市富華電器有限公司）；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（予華儀器有限公司）；恒溫水浴鍋（江蘇正基儀器有限公司）。

1.2原材料 新鮮竹葉（采自江蘇宜興基地，經(jīng)烘箱60℃干燥后粉碎未過篩）。

1.3主要試劑 蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品（北京譜析科技有限公司）；硝酸鋁；乙醇等試劑為國(guó)產(chǎn)分析純，實(shí)驗(yàn)室用水為一次蒸餾水。

2　方法

2.1干燥粉碎 將竹葉洗凈，蒸餾水浸泡24 h，烘箱烘至恒重。將干燥淡竹葉剪碎后，研磨，不過篩，備用。2.2繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線 以蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品為對(duì)照，精密稱取0.01 g蘆丁對(duì)照品，用75%乙醇溶解，定容在100 mL的容量瓶中，配制成0.1 mg/mL的母液，再分別精密量取2 mL、4 mL、8 mL、12 mL、16 mL、20 mL于100 mL容量瓶中，加2 mL的10%硝酸鋁，充分振蕩5 min，再加75%乙醇補(bǔ)充至刻度，并以75%乙醇為參比液，于510 nm處測(cè)定吸光度，繪制蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線。

2.3竹葉黃酮的提取及測(cè)定方法 稱取規(guī)定量的竹葉樣品，加入規(guī)定體積和濃度的乙醇，在規(guī)定溫度下加熱回流提取規(guī)定的時(shí)間，過濾，收集濾液，濾渣用少量同濃度的乙醇洗滌3次，合并上述濾液，然后在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀上蒸干，加75%乙醇溶解并轉(zhuǎn)移至50 mL的容量瓶中定容，充分搖勻備用。分別從各組單因素實(shí)驗(yàn)得到的樣品溶液中移取1 mL，加2 mL的10%硝酸鋁，再加75%乙醇補(bǔ)充至25 mL，并以75%乙醇為參比液，于510 nm處測(cè)定吸光度。

3　結(jié)果與分析

3.1標(biāo)準(zhǔn)曲線 根據(jù)不同蘆丁濃度對(duì)應(yīng)的吸光度，計(jì)算得到曲線方程為：A=17.36C-0.0059，相關(guān)系數(shù)R2為0.9998。

3.2單因素試驗(yàn)結(jié)果

3.2.1料液比對(duì)提取率的影響 按照實(shí)驗(yàn)方法2.3項(xiàng)，稱取3 g左右的竹葉粉末（未過篩），在60℃下用80%的乙醇水浴浸提4 h，改變料液比。實(shí)驗(yàn)結(jié)果見圖1。隨著固液比的增加，總黃酮提取率呈現(xiàn)由低到高，并趨于穩(wěn)定的趨勢(shì)。一方面溶劑的增加可以增大物料與溶劑的接觸面，有利于擴(kuò)散速度的提高[7]；另一方面，當(dāng)固液比達(dá)到1∶20時(shí)，黃酮溶出已趨于穩(wěn)定，所以繼續(xù)增大固液比，提取率變化不大。因此固液比選擇1∶20為宜。

圖1　固液比對(duì)提取率的影響

3.2.2提取時(shí)間對(duì)提取率的影響 按照實(shí)驗(yàn)方法2.3項(xiàng)，稱取3 g左右的竹葉粉末（未過篩），固定料液比1∶20，在60℃下用80%的乙醇水浴浸提，改變浸提時(shí)間。實(shí)驗(yàn)結(jié)果見圖2。竹葉黃酮的提取率先逐漸增大，當(dāng)提取時(shí)間為4 h時(shí)達(dá)到最高，然后再延長(zhǎng)提取時(shí)間提取率又開始下降，這說明浸提時(shí)間過短，黃酮類物質(zhì)還未充分溶出，而時(shí)間過長(zhǎng)，一些熱敏性組分被破壞或部分溶劑揮發(fā)導(dǎo)致乙醇濃度降低而使黃酮類化合物提取率降低[7]。

圖2　提取時(shí)間對(duì)提取率的影響

3.2.3提取溫度對(duì)提取率的影響 按照實(shí)驗(yàn)方法2.3項(xiàng)，稱取3 g左右的竹葉粉末（未過篩），固定料液比1∶20，在不同溫度下用80%的乙醇水浴浸提4 h，實(shí)驗(yàn)結(jié)果見圖3。隨著溫度的升高，提取率隨之增加，并呈緩緩上升趨勢(shì)，當(dāng)溫度達(dá)到70℃時(shí)提取率最大，溫度超過70℃后提取率略有下降，這是由于隨著溫度的升高，黃酮類物質(zhì)的擴(kuò)散速率加快，溶解度也增大，提取率提高，但溫度過高，會(huì)造成黃酮類物質(zhì)容易被破壞而使提取率下降，并且也會(huì)使后續(xù)操作更為困難。因此提取時(shí)溫度選擇70℃為宜。

圖3　提取溫度對(duì)提取率的影響

3.2.4乙醇濃度對(duì)提取率的影響 按照實(shí)驗(yàn)方法2.3項(xiàng)，稱取3 g左右的竹葉粉末（未過篩），固定料液比1∶20，在60℃下用乙醇水浴浸提4 h，改變乙醇溶液的濃度，實(shí)驗(yàn)結(jié)果見圖4。隨著乙醇濃度的升高，提取率先變化不明顯，然后在70%～80%范圍內(nèi)呈明顯上升的趨勢(shì)，當(dāng)乙醇濃度達(dá)到80%時(shí)，提取率最高，黃酮類物質(zhì)的溶解度達(dá)到最大，之后提取率下降，這可能是由于部分黃酮是水溶性的，隨著乙醇濃度的增大，水的含量變少，這樣水溶性的部分不能充分溶解出來造成的。

圖4　乙醇濃度對(duì)提取率的影響

3.3響應(yīng)面法優(yōu)化提取竹葉黃酮 選取影響提取過程較大的3個(gè)因素：提取時(shí)間、提取溫度、乙醇濃度為自變量，應(yīng)用Design-Expert8.0.6Box-Behnken設(shè)計(jì)[8-9]優(yōu)化提取竹葉黃酮的工藝條件。稱取3 g左右的竹葉粉末（未過篩），固液比1∶20，實(shí)驗(yàn)因素及其水平設(shè)計(jì)見表1。

表1　自變量及其水平

實(shí)驗(yàn)按隨機(jī)化的原則進(jìn)行，以減少隨機(jī)誤差。實(shí)驗(yàn)安排及結(jié)果見表2。

表2　實(shí)驗(yàn)安排及結(jié)果

3.3.1模型評(píng)價(jià) 將所得實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行多元回歸擬合，得到竹葉黃酮提取率Y與乙醇提取各因素變量的二次回歸方程模型為：

Y=0.67+0.017X1+0.008125X2+0.034X3+0.024X1X2-0.055X2X3-0.078 X12-0.07 X22-0.05 X32

對(duì)乙醇提取竹葉黃酮的數(shù)學(xué)模型進(jìn)行分析，來檢查該方程的有效性。此模型的相關(guān)性系數(shù)R2為0.9834，線性關(guān)系顯著。F值越大，P值越小意味著該項(xiàng)越顯著。從表3可以看出，回歸的模型極其顯著（＜0.0001），同時(shí)失擬項(xiàng)不顯著（P=0.2050），一次項(xiàng)中X1、X3的回歸系數(shù)顯著，說明提取時(shí)間和乙醇濃度對(duì)黃酮提取率有顯著影響。交互項(xiàng)X1X2和X2X3的偏回歸系數(shù)極顯著，說明提取時(shí)間和提取溫度、提取溫度和乙醇濃度的交互項(xiàng)對(duì)提取率有顯著影響。說明該方程擬合較好。在所選取的三因素水平范圍內(nèi)，按照對(duì)提取率的影響排序，乙醇濃度對(duì)提取率影響最大，提取時(shí)間次之，提取溫度影響最小。

表3　回歸系數(shù)的顯著性分析

3.3.2響應(yīng)面分析 3-D曲面是回歸方程的直觀表達(dá)形式?？疾鞌M合響應(yīng)曲面的形狀，分析提取時(shí)間、提取溫度和乙醇濃度對(duì)黃酮提取率的影響。結(jié)果見圖5。由圖5可以看出，兩個(gè)響應(yīng)曲面均為開口向下的凸形曲面，說明響應(yīng)值存在極高值。在3個(gè)因素的交互作用中，提取溫度的提高，提取時(shí)間的增加，都有助于黃酮的充分溶出，而乙醇濃度的增加增大了黃酮的濃度梯度，從而提高了黃酮的溶出速度和得率。

3.3.3最優(yōu)條件及驗(yàn)證 利用Design-Expert 8.0.6軟件中Box-Behnken設(shè)計(jì)對(duì)回歸模型進(jìn)行求解，得到最佳工藝條件。我們將實(shí)驗(yàn)放大10倍，稱取30 g左右的竹葉粉末（未過篩），固液比1∶20，在70℃下用80%乙醇水浴浸提4 h，按照實(shí)驗(yàn)方法2.3項(xiàng)求出黃酮提取率，平行實(shí)驗(yàn)三次。實(shí)驗(yàn)結(jié)果為0.6578%，與預(yù)測(cè)值比較吻合，表明模型是可靠的。

圖5　響應(yīng)面圖

4　結(jié)論

本研究是在單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，采用響應(yīng)面法優(yōu)化乙醇提取竹葉黃酮的工藝參數(shù)，再建立了回歸方程模型，該模型回歸極顯著，且失擬項(xiàng)不顯著，說明該方程對(duì)實(shí)驗(yàn)擬合較好。根據(jù)優(yōu)化提取條件進(jìn)行驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，在80%乙醇，提取溫度70℃，提取時(shí)間4 h，固液比1∶20的條件下，竹葉黃酮提取率為0.6578%。得到的黃酮具有較高的醫(yī)用和食用價(jià)值，為竹葉黃酮的進(jìn)一步研究提供了一定的參考依據(jù)。

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