陳家驊，李元明，王 磊，葉力波，伊斯拉木江，木沙由夫，哈里木，齊 海

(新疆醫(yī)科大學第二附屬醫(yī)院心胸外科，烏魯木齊 830063)

研究表明,食管癌是多種因素、多基因、多步驟相互作用的結果[1]。癌癥-MYC基因(cancer-MYC,C-myc)作為myc家族重要成員,具有癌基因功能,在調(diào)控腫瘤細胞增殖、轉(zhuǎn)移、侵襲及凋亡等過程中發(fā)揮重要作用[2]。有研究指出,C-myc啟動子結合蛋白1(C-mycpromoterbindingprotein1,MBP-1)可特異性結合到C-myc基因P2啟動子上而從轉(zhuǎn)錄水平上抑制C-myc基因表達,從而特異性阻斷腫瘤發(fā)生及進展過程[3]。本研究分別上調(diào)和特異性沉默人食管癌Ec109細胞中MBP-1基因,觀察其對細胞生物學特性的影響。1 材料與方法1.1 材料 人食管癌Ec109細胞株購自通派生物公司,RPMI-1640培養(yǎng)基、胎牛血清、二甲基亞砜(DM-SO)、胰酶購自美國Gibco公司,Trizol總RNA提取試劑盒、脂質(zhì)體LipofectionTM2000轉(zhuǎn)染試劑盒購自美國Invitrogen公司,逆轉(zhuǎn)錄試劑盒和PCR試劑盒購自大連TaKaRa公司,MBP-1引物、內(nèi)參引物、干擾序列、模擬序列、陰性對照序列由上海生工生物公司設計合成,四甲基偶氮唑藍(MTT)液購自北京碧云天公司,細胞周期和凋亡檢測試劑盒購自南京凱基生物公司,兔抗人MBP-1、C-myc、細胞周期素(Cyclin)D1多克隆抗體均購自美國Abcam公司,兔抗人CyclinE單克隆抗體購自美國SantaCruz公司,化學發(fā)光液購自長沙艾佳生物公司,實時定量PCR儀購自美國ABI公司,Transwell小室、流式細胞儀均購自美國BD公司。1.2 方法1.2.1 細胞培養(yǎng)及分組 將Ec109細胞株置于含胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基中,37℃、5%CO2恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。胰酶消化后傳代。取對數(shù)生長期細胞,利用脂質(zhì)體LipofectionTM2000轉(zhuǎn)染試劑盒轉(zhuǎn)染,將細胞分為4組。(1)MBP-1模擬物組:轉(zhuǎn)染MBP-1模擬序列為正義鏈5'-TGGATGTGGAATGTGT-GCGA-3',反義鏈5'-TTTGTACACCCTAAGC-CTCC-3';(2)siRNA-MBP-1組:轉(zhuǎn)染siRNA-MBP-1序列為正義鏈5'-GAAGTATGACCTGGACTTC-3',反義鏈5'-GGAGACTGAAGATACCTTC-3';(3)陰性對照組:轉(zhuǎn)染空白質(zhì)粒;(4)空白對照組:不做任何處理。各組轉(zhuǎn)染后培養(yǎng)48h,完成后續(xù)實驗。1.2.2 實時定量PCR檢測各組細胞中MBP-1表達 取各組轉(zhuǎn)染培養(yǎng)48h細胞,加入細胞裂解液,提取總RNA,用紫外分光光度計檢測純度,以A260/A280≥1.80為合格。將總RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA,以cDNA為模板進行PCR。引物序列如下,MBP-1:上游5'-AAGTAAGCTGTGGGCAG-3',下游5'-AGTAT-TCTCATGGGTCAC-3';GAPDH:上游5'-AAATC-CCATCACCATCTTCC-3',下游5'-TCACACCCAT-GACGAACA-3'。反應條件:92℃1min,92℃45s,56℃30s,72℃30s,連續(xù)循環(huán)40次,每個樣品均設置3個平行反應復孔。用2-△△Ct法獲得各組細胞中MBP-1相對表達量[4]。1.2.3 MTT法檢測不同轉(zhuǎn)染組細胞增殖情況 取各組對數(shù)生長期細胞,接種于96孔板,調(diào)整濃度為1×104/孔,分別于培養(yǎng)24、48、72、96h時,加入MTT液,培養(yǎng)3h,取出培養(yǎng)板,去除培養(yǎng)液,加入二甲基亞砜(DMSO),室溫下振蕩搖勻10min。酶標儀檢測450nm處各孔吸光度(A)值,每孔檢測3次,取均值[5]。1.2.4 流式細胞儀檢測各轉(zhuǎn)染組細胞凋亡情況 取各組培養(yǎng)48h細胞,磷酸鹽緩沖液(PBS)洗滌3次,調(diào)整細胞密度為1×106/mL,取1mL,1000r/min離心6min,取細胞,用預冷PBS液重懸,再次離心,取細胞重懸于100μL緩沖液中,加入AnnexinV和碘化丙啶(PI)各5μL,搖勻,室溫下避光放置10min,加入緩沖液400μL,1h內(nèi)上機檢測[6]。1.2.5 流式細胞儀檢測各轉(zhuǎn)染組細胞周期情況 取各組培養(yǎng)48h細胞,PBS洗滌3次,各樣品細胞總數(shù)為2×106,于1000r/min進行離心6min,預冷PBS洗滌,加入預冷的70%乙醇1mL,搖勻,4℃過夜固定。1200r/min離心5min,取細胞沉淀,加入預冷PBS,RNaseA40μL,避光溫育25min,加入PI200μL,避光染色15min,60min內(nèi)上機檢測[7]。1.2.6 Transwell檢測細胞侵襲能力 取各組培養(yǎng)48h細胞,胰酶消化,取細胞1×105,置于Transwell小室上室,將含10%胎牛血清RPMI-1640培養(yǎng)基置于下室,于37℃、5%CO2恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)12h,取出小室,多聚甲醛固定,吉姆薩(Giemsa)染色,于顯微鏡下觀察穿孔細胞數(shù),并拍照計數(shù),重復檢測3次。1.2.7 Westernblot法檢測 各組細胞中MBP-1、C-myc、CyclinD1和CyclinE蛋白表達取各組培養(yǎng)48h細胞,加入細胞裂解液,提取總蛋白,用聚氰基丙烯酸正丁酯(BCA)蛋白濃度檢測試劑盒對檢測總蛋白純度,金屬浴100℃變性10min。取25μg蛋白,進行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)電泳,電轉(zhuǎn)至聚偏二氟乙烯(PVDF)膜上,用5%脫脂奶粉封閉120min,TBST沖洗3次,分別將一抗MBP-1、C-myc、CyclinD1、CyclinE抗體加入(稀釋比例1∶200、1∶800、1∶500和1∶800),4℃過夜孵育,加入二抗,室溫孵育1h,TBST沖洗3次,加入ECL發(fā)光液,顯影,利用Quantity-One圖像分析軟件分析,獲得各組細胞中蛋白相對表達量[8]。1.3 統(tǒng)計學處理 采用SPSS21.0統(tǒng)計分析軟件對數(shù)據(jù)進行分析,計量資料用x±s表示,多組間比較采用單因素方差分析,兩兩比較采用LSD-t檢驗,檢驗水準α=0.05,以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。2 結 果2.1 各組細胞中MBP-1基因表達比較 siRNA-MBP-1組、MBP-1模擬物組、陰性對照組及空白對照

組細胞中MBP-1mRNA相對表達量分別為0.44±0.05、0.85±0.10、0.66±0.08和0.63±0.07,siRNA-MBP-1組細胞中MBP-1基因表達被抑制,而MBP-1模擬物組則表達增加(P<0.05),見圖1。2.2 各組細胞增殖情況比較 與空白對照組及陰性對照組相比,MBP-1模擬物組細胞48、72、96h時A值均降低,而siRNA-MBP-1組A值均升高(P<0.05),見圖2。2.3 各組細胞凋亡率比較 siRNA-MBP-1組、MBP-1模擬物組、陰性對照組、空白對照組細胞凋亡率分別為(14.7±3.3)、(39.5±6.2)、(25.6±5.1)、(24.5±4.9)%,相比于空白對照組及陰性對照組,siRNA-MBP-1組細胞凋亡率降低,MBP-1模擬物組則升高(P<0.05),見圖3。 a:P<0.05,與siRNA-MBP-1組比較圖1 各組細胞中MBP-1基因表達比較圖2 各組細胞增殖情況 A:MBP-1模擬物組;B:siRNA-MBP-1組;C:陰性對照組;D:空白對照組圖3 各組細胞凋亡情況2.4 各組細胞周期比較 與空白對照組及陰性對照組相比,MBP-1模擬物組細胞G0/G1期比例均降低,而S期和G2/M期細胞比例均增加;siRNA-MBP-1組細胞G0/G1期比例均升高,而S期和G2/M期細胞比例均降低(P<0.05),見表1。2.5 各組細胞侵襲能力比較 siRNA-MBP-1組、MBP-1模擬物組、陰性對照組和空白對照組侵襲細胞數(shù)分別為(144.3±10.1)、(64.0±8.1)、(86.5±7.6)、(88.2±8.4)個。與空白對照組及陰性對照組相比,siRNA-MBP-1組侵襲細胞數(shù)增加,而MBP-1模擬物組則減少(P<0.05),見圖4。表1 不同轉(zhuǎn)染組細胞周期情況比較(x±s,%)組別G0/G1期S期G2/M期MBP-1模擬物組26.8±3.5ab42.3±2.6ab30.9±3.3absiRNA-MBP-1組64.2±2.1ab21.3±1.8ab14.5±1.9ab陰性對照組43.8±2.534.5±3.121.7±2.7空白對照組45.3±2.936.7±3.318.0±2.3F19.67225.38117.262P<0.01<0.01<0.01 a:P<0.05,與陰性對照組比較;b:P<0.05,與空白對照組比較 A:MBP-1模擬物組;B:siRNA-MBP-1組;C:陰性對照組;D:空白對照組圖4 各組細胞侵襲能力(Giemsa染色,×200)2.6 各組細胞中MBP-1、CyclinD1和CyclinE蛋白表達比較 與空白對照組及陰性對照組相比,MBP-1模擬物組細胞中MBP-1蛋白相對表達量升高,而siRNA-MBP-1組降低;MBP-1模擬物組細胞中C-myc、CyclinD1和CyclinE蛋白相對表達量降低,而siRNA-MBP-1組均升高,比較差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05),見表2、圖5。

表2 各組細胞中MBP-1、CYclin D1和CYcline E蛋白表達比較

3 討 論

細胞周期紊亂、細胞侵襲能力增強是導致食管癌轉(zhuǎn)移的重要因素[9]。研究表明，癌基因C-myc過表達可加速細胞增殖，且可引起細胞DNA損傷及中心體數(shù)量異常而導致染色體破壞[10]。C-myc在多種惡性腫瘤細胞中呈過表達[11]，在腫瘤惡性增殖、侵襲、轉(zhuǎn)移中發(fā)揮重要作用[12]。MBP-1作為特異性C-myc抑制基因，可在轉(zhuǎn)錄水平上抑制其表達，從而在腫瘤發(fā)生、進展過程中發(fā)揮類似于抑癌基因的功能[13]。

本研究結果顯示，MBP-1模擬物組細胞中MBP-1基因和蛋白表達量均上調(diào)，而siRNA-MBP-1組細胞中MBP-1基因和蛋白表達量均抑制，說明采用轉(zhuǎn)染模擬物和抑制物的方式可成功地將人食管癌Ec109細胞中MBP-1基因上調(diào)或抑制。MTT結果顯示，上調(diào)MBP-1基因可抑制細胞增殖，而抑制MBP-1基因則可促進細胞增殖，提示MBP-1基因與細胞增殖密切相關，是調(diào)控細胞增殖過程的重要基因。本研究結果顯示，MBP-1模擬物組細胞凋亡率顯著增加，且G0/G1期細胞比例降低，S期和G2/M期細胞比例升高，而siRNA-MBP-1組細胞凋亡率則降低，且G0/G1期細胞比例升高，S期和G2/M期細胞比例降低，說明MBP-1基因可通過影響細胞周期，而參與細胞凋亡的發(fā)生。同時，Western blot結果顯示，MBP-1模擬物組細胞中C-myc蛋白表達被抑制，而siRNA-MBP-1組則表達上調(diào)，說明MBP-1作為C-myc基因的抑制基因，可能通過抑制C-myc表達而達到減少細胞增殖、促進細胞凋亡的作用。本研究結果說明MBP-1基因與Ec109細胞侵襲能力密切相關。

研究顯示，Cyclin D1和Cyclin E作為重要的細胞周期蛋白激酶復合物，在調(diào)控細胞周期進程中發(fā)揮重要作用[14]。本研究顯示，MBP-1模擬物組細胞中C-myc、Cyclin D1和Cyclin E蛋白相對表達量均降低，而siRNA-MBP-1組均升高，說明MBP-1基因可通過促進或抑制細胞中Cyclin D1和Cyclin E蛋白表達，從而在調(diào)控細胞周期及細胞增殖、凋亡中發(fā)揮作用。

綜上所述，MBP-1與人食管癌細胞株Ec109細胞增殖、凋亡、侵襲能力密切相關，其機制可能與細胞周期異常有關。

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