鄭宗書，孫婉玉

（1.安徽工程大學(xué)生物與化學(xué)工程學(xué)院，安徽蕪湖 241000；2.南京郵電大學(xué)人文與社會科學(xué)學(xué)院，江蘇南京 210023）

0 引言

隨著時代的發(fā)展，人們注重的不僅僅是溫飽，更在意食品的營養(yǎng)價值和食品安全[1]。與其他大部分國家一樣，目前由致病微生物和其他有毒有害因素引起的食品中毒和食源性疾病是對我國食品質(zhì)量安全構(gòu)成威脅的主要原因[2]。在未來可以預(yù)見的時間里，食品安全問題將一直是廣大群眾持續(xù)關(guān)注的一個熱點。

堅果的營養(yǎng)價值豐富，含有蛋白質(zhì)36.0%，脂肪58.8%，碳水化合物72.6%，還含有維生素（VB，VE等）、微量元素（鈣、磷、鋅、鐵）、膳食纖維等，另外還含有單、多不飽和脂肪酸，包括亞麻酸、亞油酸等人體必需脂肪酸。試驗通過檢測不同來源的堅果的霉菌、大腸菌群等微生物的生長情況來闡述食品存在的安全問題。

以云南產(chǎn)夏威夷果原料為例，采用溶劑浸提法提取其油脂，并對產(chǎn)物的幾項重要理化性質(zhì)及脂肪酸組成進(jìn)行檢測分析。結(jié)果表明，夏威夷果油脂的相對密度（20℃）為0.910 8，折射率1.466 1%，酸價 1.603 mg KOH/g，碘價79 g I2/100 g，皂化值為198.22 mg KOH/g；并采用GC-MS法檢測油脂的脂肪酸組成和含量。結(jié)果表明，夏威夷果油脂的性質(zhì)穩(wěn)定，含有豐富的不飽和脂肪酸，有較高的營養(yǎng)價值。

霉菌是形成分枝菌絲的真菌的統(tǒng)稱。霉菌的繁殖速度很快，常造成食品、用具發(fā)生霉腐變質(zhì)，但許多有益種類已被廣泛應(yīng)用，是人類生活實踐活動中最早被利用和認(rèn)識的一類微生物。

大腸菌群主要包括腸桿菌科中埃希氏菌屬、檸檬酸桿菌屬、克雷伯氏菌屬和腸桿菌屬。在35～37℃條件下，48 h內(nèi)能發(fā)酵產(chǎn)酸產(chǎn)氣，呈革蘭氏陰性[3]。食品中檢出大腸菌群表示食品受到溫血動物糞便的污染，其中典型大腸桿菌為糞便近期污染，其他菌屬則可能為糞便的陳舊污染[4]。

食物蛋白質(zhì)的質(zhì)和量、各種氨基酸的比例，關(guān)系到人體蛋白質(zhì)合成的量，尤其是青少年的生長發(fā)育、孕產(chǎn)婦的優(yōu)生優(yōu)育、老年人的健康長壽[5]，都與膳食中蛋白質(zhì)的量有著密切關(guān)系。富含必需氨基酸，品質(zhì)優(yōu)良的蛋白質(zhì)統(tǒng)稱完全蛋白質(zhì)，如奶、蛋、魚、肉類等屬于完全蛋白質(zhì)，植物中的大豆亦含有完全蛋白質(zhì)[6]。

1 材料與試劑

1.1 材料

巴旦木、碧根果、生紙皮核桃、開心果、夏威夷果，均來自于市場上包裝完好的食用堅果。

1.1.1 設(shè)備

除了微生物實驗室所需的一些常規(guī)滅菌及培養(yǎng)設(shè)備外，其他設(shè)備有恒溫培養(yǎng)箱、冰箱、恒溫水浴箱、天平、均質(zhì)器、無菌吸管、無菌錐形瓶、無菌培養(yǎng)皿、pH計或pH比色管或精密pH試紙、菌落計數(shù)器、自動凱氏定氮儀等。

1.1.2 培養(yǎng)基和試劑

煌綠乳糖膽鹽肉湯、結(jié)晶紫中性紅膽鹽瓊脂、孟加拉紅培養(yǎng)基、磷酸鹽緩沖液、無菌生理鹽水、硫酸銅、硫酸鉀、硫酸、硼酸、甲基紅指示劑、溴甲酚綠指示劑、亞甲基藍(lán)指示劑、氫氧化鈉、乙醇、無菌1 mol/L NaOH和無菌1 mol/L HCl。

1.1.3 試劑的配制

硼酸溶液（20 g/L）、氫氧化鈉溶液（400 g/L）、硫酸標(biāo)準(zhǔn)滴定溶液[C（1/2 H2SO）4]0.050 0 mol/L或鹽酸標(biāo)準(zhǔn)滴定溶液[C（HC）l]0.050 0 mol/L、甲基紅乙醇溶液（1 g/L）、亞甲基藍(lán)乙醇溶液（1 g/L）、溴甲酚綠乙醇溶液（1 g/L）；A混合指示液：2份甲基紅乙醇溶液與1份亞甲基藍(lán)乙醇溶液臨用時混合；B混合指示液：1份甲基紅乙醇溶液與5份溴甲酚綠乙醇溶液臨用時混合。

1.2 試驗方法

1.2.1 堅果霉菌的檢測

（1）稱取25 g樣品（開心果、巴旦木、碧根果、生紙皮核桃、夏威夷果）置于盛有225 mL滅菌生理鹽水的錐形瓶中，充分振搖，即為1∶10稀釋液，再制成1∶100稀釋液。

（2）倒平板，待瓊脂凝固后，將平板正置，于28±1℃條件下培養(yǎng)5 d，觀察并記錄。

1.2.2 堅果大腸菌群的檢測

（1）稱取25 g樣品（開心果、巴旦木、碧根果、生紙皮核桃、夏威夷果），放入盛有225 mL磷酸鹽緩沖液或生理鹽水的無菌均質(zhì)袋中，用拍擊式均質(zhì)器拍打1～2 min，制成1∶10的樣品勻液。

（2） 樣品勻液的pH值應(yīng)在6.5～7.5，必要時分別用1 mol/L NaOH或1 mol/L HCl調(diào)節(jié)，再制成1∶100的樣品勻液。

（3）倒平板，小心旋轉(zhuǎn)平皿，將培養(yǎng)基與樣液充分混勻，待瓊脂凝固后，再用3～4 mL VRBA覆蓋平板表層。翻轉(zhuǎn)平板并倒置于培養(yǎng)箱中，置于36±1℃條件下培養(yǎng)18～24 h。

1.2.3 堅果蛋白質(zhì)含量的檢測（自動凱氏定氮儀法）

稱取充分混勻的試樣（開心果、巴旦木、碧根果、生紙皮核桃、夏威夷果）0.2～2.0 g（相當(dāng)于氮30～40 mg），精確至0.001 g，至消化管中，再加入0.4 g硫酸銅、6 g硫酸鉀及20 mL硫酸置于消化爐進(jìn)行消化。當(dāng)消化爐溫度達(dá)到420℃之后，繼續(xù)消化1 h，此時消化管中的液體呈綠色透明狀，取出冷卻后加入50 mL水，于自動凱氏定氮儀（使用前加入氫氧化鈉溶液、鹽酸或硫酸標(biāo)準(zhǔn)溶液和含有混合指示劑A或B的硼酸溶液）上實現(xiàn)自動加液、蒸餾、滴定和記錄滴定數(shù)據(jù)的過程[7]。

2 結(jié)果分析

2.1 5種堅果中霉菌的檢測

試驗采用平板培養(yǎng)法對開心果、巴旦木、碧根果、生紙皮核桃、夏威夷果等5種堅果進(jìn)行霉菌、大腸菌群2種指標(biāo)的檢測。此外，通過自動凱式定氮儀法對開心果、巴旦木、碧根果、生紙皮核桃、夏威夷果的蛋白質(zhì)含量進(jìn)行檢測。

2.2 堅果霉菌檢測結(jié)果

5種堅果霉菌檢測結(jié)果見圖1，5種堅果霉菌生長情況見表1。

圖1 5種堅果霉菌檢測結(jié)果

2.3 5種堅果大腸菌群檢測結(jié)果

5種堅果大腸菌群檢測結(jié)果見圖2，5種堅果大腸菌群生長情況見表2，開心果煌綠乳糖膽鹽肉湯（BGLB）證實試驗見圖3，開心果BGLB驗證試驗結(jié)果統(tǒng)計見表3。

由圖3和表3可知，通過煌綠乳糖膽鹽肉湯（BGLB） 管中培養(yǎng)24 h的驗證試驗可以確定樣品培養(yǎng)皿Ⅰ中無大腸菌群，樣品培養(yǎng)皿Ⅱ中長有2 CFU/g大腸菌群，樣品培養(yǎng)皿Ⅲ中長有3 CFU/g大腸菌群，樣品培養(yǎng)皿Ⅳ中無大腸菌群，樣品培養(yǎng)皿Ⅴ中無大腸菌群。

表1 5種堅果霉菌生長情況

圖2 5種堅果大腸菌群檢測結(jié)果

表2 5種堅果大腸菌群生長情況

2.4 堅果蛋白質(zhì)含量的計算與分析

試樣中蛋白質(zhì)的含量按公式（1）計算：

式中：X——試樣中蛋白質(zhì)的含量，g/100 g；

V1——試液消耗硫酸或鹽酸標(biāo)準(zhǔn)滴定液體積，mL；

圖3 開心果煌綠乳糖膽鹽肉湯（BGLB）證實試驗

表3 開心果BGLB驗證試驗結(jié)果統(tǒng)計

V2——試劑空白消耗硫酸或鹽酸標(biāo)準(zhǔn)滴定液的體積，mL；

C——硫酸或鹽酸標(biāo)準(zhǔn)滴定溶液濃度，mol/L；

0.014 0——1.0 mL硫酸[C（1 2H2SO）4=1.000 mol/L]或鹽酸[C（HC）l=1.000 mol/L]標(biāo)準(zhǔn)滴定溶液相當(dāng)?shù)牡馁|(zhì)量，g；

m——試樣的質(zhì)量，g；

V3——吸取消化液的體積，mL；

F——氮換算為蛋白質(zhì)的系數(shù)；

100——換算系數(shù)。蛋白質(zhì)含量≥1 g/100 g時，結(jié)果保留3位有效數(shù)字；

蛋白質(zhì)含量＜1g/100g時，結(jié)果保留2位有效數(shù)字。

注：當(dāng)只檢測氮含量時，不需要乘蛋白質(zhì)換算系數(shù)F[8]。

試樣Ⅰ中蛋白質(zhì)含量：19.04/（0.865 4×100）×100%=22.0%；試樣Ⅱ中蛋白質(zhì)含量：16.45/（0.843 8×100）×100%=19.5%；X/m×100%=20.8%。由此計算結(jié)果可知，開心果中蛋白質(zhì)含量約為20.8%。

試樣Ⅰ中蛋白質(zhì)含量：21.1/（0.756 1×100）×100%=27.90%；試樣Ⅱ中蛋白質(zhì)含量：22.3/（0.782 5×100）×100%=28.5%；X/m×100%=28.0%。由此計算結(jié)果可知，巴旦木中蛋白質(zhì)含量約為28.0%。

試樣Ⅰ中蛋白質(zhì)含量：4.47/（0.886 4×100）×100%=5.0%；試樣Ⅱ中蛋白質(zhì)含量：3.93/（0.857 3×100）×100%=4.6%；X/m×100%=5.4%。由此計算結(jié)果可知，碧根果中蛋白質(zhì)含量約為5.4%。

試樣Ⅰ中蛋白質(zhì)含量：10.12/（0.688 2×100）×100%=14.7%；試樣Ⅱ中蛋白質(zhì)含量：11.52/（0.748 3×100）×100%=15.4%；X/m×100%=15.1%。由此計算結(jié)果可知，生紙皮核桃中蛋白質(zhì)含量約為15.1%。

試樣Ⅰ中蛋白質(zhì)含量：6.68/（0.743 2×100）×100%=9.0%；試樣Ⅱ中蛋白質(zhì)含量：6.81/（0.756 8×100）×100%=9.0%；X/m×100%=9%。由此計算結(jié)果可知，夏威夷果中蛋白質(zhì)含量約為9%。

3 結(jié)論

（1）通過將開心果樣液、巴旦木樣液、碧根果樣液、生紙皮核桃樣液、夏威夷果樣液在孟加拉紅培養(yǎng)基中進(jìn)行為期5 d的28℃的恒溫培養(yǎng)，發(fā)現(xiàn)這幾種堅果中開心果霉菌的生長情況尤為明顯，而且霉菌還存在超標(biāo)的現(xiàn)象。食物的霉變可能導(dǎo)致食用者在較短時間內(nèi)出現(xiàn)嚴(yán)重的中毒現(xiàn)象。所以，對于食物霉菌的檢測還應(yīng)加強力度。

（2）通過將開心果樣液、巴旦木樣液、碧根果樣液、生紙皮核桃樣液、夏威夷果樣液在結(jié)晶紫中性紅膽鹽瓊脂（VRBA） 中進(jìn)行為期1 d的36℃恒溫培養(yǎng)，發(fā)現(xiàn)和霉菌的情況略有相似，開心果大腸菌群也有存在的現(xiàn)象，但是相比霉菌的情況要好一些。針對開心果培養(yǎng)皿中長有菌落，接下來將可疑菌落接種于煌綠乳糖膽鹽肉湯（BGLB） 做驗證試驗，驗證培養(yǎng)皿中菌落均為大腸菌群。大腸菌群作為一類腸道菌，可能會引起腸道外感染、急性腹瀉等一些疾病。試驗說明食品安全依然還存在很多問題。

（3）通過自動凱式定氮儀法對堅果開心果、巴旦木、碧根果、生紙皮核桃、夏威夷果等5種中蛋白質(zhì)的含量進(jìn)行檢測，發(fā)現(xiàn)開心果中蛋白質(zhì)含量約為20.8%，巴旦木中蛋白質(zhì)含量約為28.0%，碧根果中蛋白質(zhì)含量約為5.4%，生紙皮核桃中蛋白質(zhì)含量約為15.1%，夏威夷果中蛋白質(zhì)含量約為9%。蛋白質(zhì)這一方面來闡述夏威夷果具有一定的營養(yǎng)價值，但是夏威夷果還有很多其他營養(yǎng)物質(zhì)，如不飽和脂肪酸、氨基酸等這些都是人體腦神經(jīng)細(xì)胞所需要的一些主要營養(yǎng)成分[8]。這些都可以作為對夏威夷果評價指標(biāo)。

隨著收入水平和生活水平的提高，人們對于堅果的品質(zhì)要求也逐步提升。對于堅果炒貨食品的口味、功能和健康等各方面的要求也越來越多，需求的多樣化。在堅果食品的采摘、保存加工過程中都存在一定的食品安全問題，在這些問題上最終解決的端口應(yīng)該在食品的出廠成品上，應(yīng)主張輕加工。

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