周嬌， 湯茜， 張靜， 周凌宇， 翟玲玲， 易云云，易晶， 林江， 錢軍， 鄧兆群*

(1. 江蘇大學附屬人民醫(yī)院中心實驗室， 江蘇 鎮(zhèn)江 212002； 2. 鎮(zhèn)江市精確診斷與治療重點實驗室， 江蘇 鎮(zhèn)江 212002； 3. 江蘇大學附屬人民醫(yī)院血液內(nèi)科， 江蘇 鎮(zhèn)江 212002)

Nanog基因位于12號染色體12P13.31[1]，最初由Chambers等[2]和Mitsui等[3]在小鼠胚胎干細胞內(nèi)發(fā)現(xiàn)。Nanog基因通常被認為是一種促進腫瘤轉(zhuǎn)移的關鍵干細胞基因。Nanog在NIH3T3細胞中的致癌潛力主要表現(xiàn)在促進細胞生長、病灶形成和集落生長[4]。Nanog基因是乳腺癌[5]、肺癌[6]等許多實體腫瘤預后不良因素之一。此外，Nanog還可能促進低分化腫瘤及腫瘤耐藥性的形成。

急性髓系白血病(acute myeloid leukemia, AML)由分化障礙和不受控制的異常造血細胞增殖或積累引起，主要通過骨髓和外周血的形態(tài)學檢查明確診斷[7]。雖然AML的治療方案很多，但5年總生存率低于50%，老年患者診斷后2年內(nèi)僅20%存活[8-9]。近年來，分子學異常與疾病預后的關系越來越受到關注，而Nanog是否影響AML患者預后的報道尚不多見。

目前認為，SOX2基因與腫瘤的侵襲性表型和不良預后相關[10-11]，但有研究顯示，在非小細胞肺癌和肺鱗狀細胞癌中，高表達SOX2基因的患者較低表達患者有相對好的預后。由此，其他基因在腫瘤中的表現(xiàn)是否可能與SOX2相似仍需要更深入的研究。

本研究檢測了初診AML患者中Nanog基因的表達水平，并通過分析臨床資料以確定Nanog與AML患者預后的關系。

1 對象與方法

1.1 標本來源

146例初診AML患者治療前骨髓標本以及其中11例治療后完全緩解患者隨訪骨髓標本，均取自于2003年6月至2015年7月期間在江蘇大學附屬人民醫(yī)院血液內(nèi)科獲得診斷并接受治療的病例。另以來自骨髓捐獻者或胸外傷患者的31份健康骨髓樣本作為對照標本。隨訪患者均接受了長期標準化治療，并達到完全緩解?；颊叩脑\斷和分型依據(jù)FAB分型和2008年WHO標準。每位患者的治療計劃、相關檢查報告及疾病情況均記錄在各自的醫(yī)囑單和病歷上，病歷均完整留存于病案室。另外，所有骨髓標本捐獻者均簽署了知情同意書。本研究經(jīng)江蘇大學附屬人民醫(yī)院倫理審查委員會批準。

1.2 細胞遺傳學檢查

用直接法和24 h短期培養(yǎng)法常規(guī)制備骨髓細胞染色體并分析R顯帶核型，根據(jù)《人類細胞遺傳學國際命名體制(ISCN)》，依據(jù)染色體和預后的關系，將患者分為3個組別：低危組、中危組及高危組。

1.3 單個核細胞分離、RNA制備、反轉(zhuǎn)錄合成cDNA

抽取骨髓并使用肝素抗凝，使用Ficoll分離出AML患者和健康供體的單個核細胞，此后用Trizol試劑(美國Invitrogen公司)從單個核細胞中分離總RNA，再利用隨機引物將總RNA反轉(zhuǎn)錄形成cDNA。

1.4 實時定量PCR檢測Nanog mRNA的表達

Nanog的引物序列是5′-CTCCTCTTCCTCTAT-ACTAACATG-3′(正向)和5′-AGAATCAGGGCTGTC-CTGAATAAG-3′(反向)。實時定量PCR反應均在實時定量PCR儀(7500 Thermo cycler，美國APPlied Biosystems公司)上進行，擴增條件：95 ℃ 5 min，95 ℃10 s，53 ℃ 30 s和72 ℃ 32 s，45個循環(huán)，以無菌超純水作為陰性對照。在實施PCR后，進行解鏈曲線分析以證明PCR產(chǎn)物作為單峰的特異性。通過以下公式計算Nanog轉(zhuǎn)錄物的相對水平：NNanog=(ENanog)ΔCT Nanog (對照-實驗)÷(EABL)ΔCT ABL(對照-實驗)。參數(shù)效率(E)通過公式E=10(-1/斜率)計數(shù)(斜率參照CT對cDNA濃度圖)。按照文獻[12]報道的方法，通過高分辨率熔解分析檢測Nanog突變，利用DNA直接測序確認陽性樣品。

1.5 統(tǒng)計學分析

所有數(shù)據(jù)分析采用SPSS 20.0軟件實施。利用卡方檢驗及方差檢驗來比較分類變量之間的差異，以Mann-WhitneyU檢驗比較兩組連續(xù)變量之間的差異。使用受試者工作特征(ROC)曲線和ROC曲線下面積分析Nanog表達對AML的診斷價值。采取生存分析(Kaplan-Meier)和多因素分析評估不同水平的Nanog表達對AML患者生存的影響。所有結(jié)果均以雙尾P值<0.05為差異具有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 初診AML患者Nanog mRNA的表達

初診AML患者Nanog mRNA表達水平(0.0002～136.307，中位數(shù)0.263)明顯高于健康對照組(0.0012～3.593，中位數(shù)0.084，P<0.01)；非低危組Nanog mRNA表達明顯高于低危組(P<0.05)。見圖1、表1。

圖1 Nanog mRNA在AML患者中的相對表達量

表1 不同風險水平組中Nanog mRNA的表達

2.2 Nanog表達的高低分組

AML患者Nanog mRNA表達的ROC曲線下面積為0.644(95%CI0.556～0.731，P=0.012；圖2)。敏感性和特異性分別為46.9%和87.1%，因此，Nanog表達的截止值為0.324。按照此截斷值，將AML患者分為高表達組(≥0.324)、低表達組(<0.324)。

2.3 Nanog表達與AML患者臨床資料特征的相關分析

通過分析臨床資料顯示，Nanog高表達組與低表達組間在性別、年齡、白細胞計數(shù)、血紅蛋白、血小板計數(shù)、骨髓原始細胞比例、FAB分型差異無統(tǒng)計學意義(P均>0.05)。 染色體分析結(jié)果顯示，高表達Nanog主要出現(xiàn)在非低危組(78%，P=0.027)。8個基因突變(CEBPA，NPM1，F(xiàn)LT3-ITD，c-KIT,N/K-RAS，IDH1/2，DNMT3A，U2AF1)在Nanog高、低表達組間差異無統(tǒng)計學意義。見表2。

表2 急性髓系白血病患者Nanog表達與臨床特征的關系

2.4 Nanog表達與臨床預后的關系

146例初發(fā)AML患者均按照白血病治療指南接受了標準治療。全部患者的中位隨訪時間為7.00個月，Kaplan-Meier生存分析結(jié)果提示高表達組的生存時間(95%CI4.775～15.225，中位數(shù)10個月)比低表達組(95%CI4.45～9.55，中位數(shù)7個月)長，但差異無統(tǒng)計學意義(P=0.484)。見圖3。

然而，在非M3患者中，低表達組的生存時間有短于高表達組的趨勢，但差異無統(tǒng)計學意義(P=0.126)。在非低危組患者中，Nanog高表達組患者(95%CI5.876～16.124，中值為11個月)存活時間明顯比低表達組患者(95%CI2.551～5.449，中值4個月)更長(P=0.031)。見圖3。

圖2 利用ROC曲線確定Nanog表達的截止值

圖3 Nanog表達對AML患者總生存期的影響

我們還檢測了11例得到隨訪患者的樣本，結(jié)果顯示，AML患者完全緩解后的Nanog表達水平明顯高于初診時的表達水平(P=0.002)。見圖4。

多因素分析結(jié)果顯示，以白細胞計數(shù)(≥30×109/L與<30×109/L)、血紅蛋白(<110 g/L與≥110 g/L)、年齡(<60歲與≥60歲)，血小板計數(shù)(<100×109/L與≥100×109/L)，染色體分型(低危與非低危)，基因突變(突變與野生型)和Nanog表達狀態(tài)(高與低)等作為協(xié)變量，顯示Nanog表達是影響AML患者預后的獨立因素。見表3。

圖4 11例隨訪患者Nanog mRAN表達水平

表3 多因素分析非低危組患者和AML患者的總生存預后因素

3 討論

WHO分型將AML患者分為不同的風險群組(低危，中危，高危)[13]。不同的群組有著不同的預后，如利用現(xiàn)有的治療方案，t(8; 21)和inv(16)染色體重排的AML患者通?？梢越邮茌飙h(huán)類和阿糖胞苷誘導化療以達到完全緩解[14]。

Nanog是一個獨特的同源結(jié)構(gòu)域蛋白，其基因與其他核心胚胎轉(zhuǎn)錄基因的分類(OCT4和SOX2)一致[15-16]。有研究發(fā)現(xiàn)SOX2基因在一些實體腫瘤，如肺癌、頭頸部癌、食管癌、乳腺癌、胃癌和結(jié)腸癌等[17-22]中過表達，并且與腫瘤的侵襲性表型和不良預后相關[23-27]。然而Wilbertz等[28]發(fā)現(xiàn)過表達SOX2基因的肺鱗狀細胞癌患者有著較好的預后，認為SOX2基因可能在正常鱗狀細胞前體細胞中過度表達，從而消除混亂的惡性去分化。另外，由于基因失活，SOX2表達水平在早期肺鱗狀細胞癌中增加，而在疾病進展期間可能減少[28]，Velcheti等[29]對非小細胞肺癌患者的研究也顯示了類似結(jié)果。在本研究也出現(xiàn)了類似的現(xiàn)象，即使Nanog是許多實體瘤中的致癌基因[5-6]，而本研究非低危組中高表達Nanog的AML患者同樣有著良好的預后，我們還分析了Nanog在隨訪患者標本中的表達，包括初診及其相對應的完全緩解的標本預后。因此，我們推測，在腫瘤中過表達的基因可能并不全是致癌基因。

本研究146例AML患者中存在Nanog過度表達的趨勢，且生存分析顯示高表達組生存時間長于低表達組(P=0.484)，然而，這個結(jié)果無統(tǒng)計學意義。通過分析原因，我們認為這樣的結(jié)果可能是由于標本量較少所致。而另一方面，Nanog不僅在AML患者中表達較高，在非低危組患者中更是如此。生存分析顯示，Nanog高表達組患者生存期有長于低表達組患者的趨勢。這個結(jié)果與以往認為Nanog是癌癥不良因素的研究[5-6]結(jié)論相反。此外，在非M3患者中，高表達組的患者總體生存趨勢較低表達組長，但差異無統(tǒng)計學意義(P=0.126)。我們推測造成這種現(xiàn)象的原因可能是樣本數(shù)量太少而不能代表整體情況。我們還發(fā)現(xiàn)，在非低危組患者中，低表達組的患者預后較差。根據(jù)我們的結(jié)果，可以認為，Nanog高表達是非低危組AML患者預后良好的生物學標志。此外，多因素分析也顯示Nanog表達是影響AML患者預后的獨立影響因素。

為了求證Nanog是否為AML患者預后良好的生物學標志，我們還比較了患者初診和完全緩解后的骨髓標本中Nanog的表達情況，結(jié)果發(fā)現(xiàn)每個初診樣本的Nanog表達量低于所對應的完全緩解后的樣本。

這樣的情況不僅僅在我們的研究中存在，在其他研究中也一樣[30]。例如，盡管Twist1被認為是乳腺癌、胃癌、前列腺癌和鼻咽癌的侵襲性轉(zhuǎn)移性因子[31-34]，但Twist1高表達的AML患者總體生存時間反而較長[30]。為了解釋這個現(xiàn)象，Chen等[30]使用兩種標準的誘導化療劑阿糖胞苷或柔紅霉素來處理AML細胞系，以研究細胞系對這兩種藥物的敏感性。結(jié)果顯示，與轉(zhuǎn)染空載體的細胞相比，過表達Twist1的KG1a細胞對阿糖胞苷的治療更敏感；另外他們還發(fā)現(xiàn)，Twist1可以通過抑制P14ARF和P16INK4A的表達，促進細胞進入細胞周期，使白血病細胞更容易受到特異性化療藥阿糖胞苷的細胞毒作用。因此，高表達Twist1的AML患者對治療的反應率更高，且存活率更高[30]。因此，我們推測，類似的生物學機制可能也存在于Nanog對AML患者的影響之中，但尚需更深入的研究證實。

正如前面提到的許多研究顯示，Nanog是腫瘤患者的不良預后因子，而影響腫瘤患者預后的不單單只有基因型，患者的生活環(huán)境、性別、年齡、基礎疾病以及身體狀況以及其他一些生物學機制也可能會影響預后。一些研究認為，Nanog的基礎水平對于癌細胞增殖可能是必需的，并且可部分增加Nanog介導的克隆形成和成瘤性質(zhì)；但過度表達的Nanog可能并不是在所有條件下均促進腫瘤細胞增殖[35]。我們認為，不同的結(jié)果可能取決于不同的細胞類型，以及與腫瘤微環(huán)境中的其他因素的不同組合，但均需進一步的研究證實。

綜上，我們推測Nanog是一個判斷AML預后的生物學新標志物，可預測非低危組患者的預后。

[ 1 ] Gawlik-Rzemieniewska N， Bednarek I. The role of NANOG transcriptional factor in the development of malignant phenotype of cancer cells[J]. Cancer Biol Ther,2016,17(1):1-10.

[ 2 ] Chambers I,Colby D,Robertson M,et al.Functional expression cloning of Nanog, a pluripotency sustaining factor in embryonic stem cells[J]. Cell,2003,113(5):643-655.

[ 3 ] Mitsui K,Tokuzawa Y,Itoh H, et.al.The homeoprotein Nanog is required for maintenance of pluripotency in mouse epiblast and ES cells[J]. Cell,2003,113(5):631-642.

[ 4 ] Piestun D, KochuPurakkal BS,Jacob-Hirsch J, et al. Nanog transforms NIH3T3 cells and targets cell-type restricted genes[J]. Biochem Biophys Res Commun,2006,343(1):279-285.

[ 5 ] Ezeh UI, Turek PJ, Reijo RA et.al. Human embryonic stem cell genes OCT4, NANOG, STELLAR, and GDF3 are expressed in both seminoma and breast carcinoma[J]. Cancer,2005,104(10):2255-2265.

[ 6 ] Karoubi G, Cortes-Dericks L, Gugger M, et.al. Atypical expression and distribution of embryonic stem cell marker, OCT4, in human lung adenocarcinoma[J]. J Surg Oncol,2010,102(6):689-698.

[ 7 ] Prada-Arismendy J, Arroyave JC, Rothlisberger S. Molecular biomarkers in acute myeloid leukemia[J]. Blood Rev,2017,31(1):63-76.

[ 8 ] Gregory TK, Wald D, Chen Y, et.al. Molecular prognostic markers for adult acute myeloid leukemia with normal cytogenetics[J]. J Hematol Oncol,2009, 2:23.

[ 9 ] Riva L, Luzi L, Pelicci PG. Genomics of acute myeloid leukemia: the next generation[J]. Front Oncol, 2012,2:40.

[10] Saigusa S, Mohri Y, Ohi M, et.al. Podoplanin and SOX2 expression in esophageal squamous cell carcinoma after neoadjuvant chemo-radiotheraPy[J]. Oncol Rep,2011,26(5):1069-1074.

[11] Ge N, Lin HX, Xiao XS, et.al.Prognostic significance of Oct4 and Sox2 expression in hypopharyngeal squamous cell carcinoma[J]. J Transl Med,2010,8:94.

[12] Slomka M,Sobalska-Kwapis M, Wachulec M, et al. High resolution melting(HRM) for high-throughput genotyping-limitations and caveats in practical case studies[J]. Int J Mol Sci,2017,18(11).pii:E2316

[13] Campo E, Swerdlow SH, Harris NL, et al. The 2008 WHO classification of lymphoid neoplasms and beyond: evolving concepts and practical applications[J]. Blood,2011,117(19):5019-5032.

[14] Paschka P， Dohner K. Core-binding factor acute myeloid leukemia: can we improve on HiDAC consolidation?[J]. Hematology Am Soc Hematol Educ Program,2013,2013:209-219.

[15] Chambers I,Tomlinson SR.The transcriptional foundation of pluripotency[J].Development,2009, 136(14):2311-2322.

[16] Young RA. Control of the embryonic stem cell state[J]. Cell,2011,144(6):940-954.

[17] Freier K, Knoepfle K, Flechtenmacher C, et al.Recurrent copy number gain of transcription factor SOX2 and corresponding high protein expression in oral squamous cell carcinoma[J].Genes Chromosomes Cancer, 2010,49(1):9-16.

[18] Long KB, Hornick JL. SOX2 is highly expressed in squamous cell carcinomas of the gastrointestinal tract[J]. Hum Pathol,2009,40(12):1768-1773.

[19] Maier S, Wilbertz T, Braun M, et al. SOX2 amplification is a common event in squamous cell carcinomas of different organ sites[J]. Hum Pathol,2011,42(8):1078-1088.

[20] Zhang X,Yu H,Yang Y,et al.SOX2 in gastric carcinoma, but not Hath1, is related to patients′ clinicopathological features and prognosis[J]. J Gastrointest Surg,2010,14(8):1220-1226.

[21] Lengerke C, Fehm T, Kurth R, et al. Expression of the embryonic stem cell marker SOX2 in early-stage breast carcinoma[J]. BMC Cancer,2011,11:42.

[22] Neumann J, Bahr F, Horst D, et al. SOX2 expression correlates with lymph-node metastases and distant spread in right-sided colon cancer[J]. BMC Cancer,2011,11:518.

[23] Wang X,Liang Y,Chen Q,et al.Prognostic significance of SOX2 expression in nasopharyngeal carcinoma[J]. Cancer Invest,2012,30(1):79-85.

[24] Saigusa S,Mohri Y,Ohi M,et al.Podoplanin and SOX2 expression in esophageal squamous cell carcinoma after neoadjuvant chemo-radiotherapy[J]. Oncol Rep,2011,26(5):1069-1074.

[25] Matsuoka J, Yashiro M, Sakurai K, et al. Role of the stemness factors sox2, oct3/4, and Nanog in gastric carcinoma[J]. J Surg Res,2012,174(1):130-135.

[26] Ge N, Lin HX, Xiao XS, et al.Prognostic significance of Oct4 and Sox2 expression in hypopharyngeal squamous cell carcinoma[J]. J Transl Med,2010,8:94.

[27] Huang P, Qiu J, Li B, et al. Role of Sox2 and Oct4 in predicting survival of hepatocellular carcinoma patients after hepatectomy[J]. Clin Biochem,2011,44(8/9):582-589.

[28] Wilbertz T, Wagner P, Petersen K, et al. SOX2 gene amplification and protein overexpression are associated with better outcome in squamous cell lung cancer[J]. Mod Pathol,2011,24(7):944-953.

[29] Velcheti V, Schalper K, Yao X, et al.High SOX2 levels predict better outcome in non-small cell lung carcinomas[J]. PLoS One,2013,8(4):e61427.

[30] Chen CC, You JY, Gau JP, et al.Favorable clinical outcome and unique characteristics in association with Twist1 overexpression indenovoacute myeloid leukemia[J].Blood Cancer J,2015,5:e339.

[31] Yang J, Mani SA, Donaher JL, et al. Twist, a master regulator of morphogenesis, plays an essential role in tumor metastasis[J]. Cell, 2004,117(7):927-939.

[32] Kwok WK, Ling MT, Lee TW, et al. Up-regulation of TWIST in prostate cancer and its implication as a therapeutic target[J]. Cancer Res,2005,65(12):5153-5162.

[33] Horikawa T,Yang J, Kondo S, et al. Twist and epithelial-mesenchymal transition are induced by the EBV oncoprotein latent membrane protein 1 and are associated with metastatic nasopharyngeal carcinoma[J]. Cancer Res,2007,67(5):1970-1978.

[34] Rosivatz E, Becker I, Specht K, et al. Differential expression of the epithelial-mesenchymal transition regulators snail, SIP1, and twist in gastric cancer[J]. Am J Pathol,2002,161(5):1881-1891.

[35] Jeter CR, Liu B, Liu X, et al.NANOG promotes cancer stem cell characteristics and prostate cancer resistance to androgen deprivation[J]. Oncogene,2011,30(36):3833-3845.