張 昆，鄺 芳，閆 飛，楊 波，楊力軍，王福利，袁建林，秦榮良，劉 飛

(1.空軍軍醫(yī)大學(xué)西京醫(yī)院泌尿外科，陜西西安 710032;2.解放軍第201醫(yī)院泌尿外科，遼寧遼陽 111000；3.空軍軍醫(yī)大學(xué)神經(jīng)生物學(xué)教研室，陜西西安 710032)

Piezos離子通道是近年來發(fā)現(xiàn)的一種新型機械敏感性離子通道，可感受細胞膜所受機械力變化并迅速作出反應(yīng)，將膜感受到的機械信號轉(zhuǎn)化為電信號或化學(xué)信號[1]，在2010年，COSTE等[2]研究發(fā)現(xiàn)，在哺乳動物中，該通道家族包含Piezo1和Piezo2蛋白，分別由FAM38A 和FAM38B基因編碼。Piezo基因及其表達的蛋白與機體一些病理生理過程相關(guān)，如脫水遺傳性口形紅細胞增多癥(dehydrated hereditary stomatocytosis，DHS)、戈登綜合征(gordon syndrome，GS)、Marden-Walker syndrome(MWS)等[3]。Piezo離子通道存在于許多組織中，膀胱組織中存在大量Piezo1，支配膀胱的背根節(jié)中存在大量Piezo2，對膀胱感覺有明確的影響作用[4-5]。糖尿病性膀胱病(diabetic cystopathy，DCP)是糖尿病泌尿系統(tǒng)常見并發(fā)癥之一，以膀胱充盈的感覺受損、膀胱容量增大、逼尿肌收縮力降低和剩余尿量增加為特征。目前，Piezos在DCP中表達情況少有文獻報道，本實驗以鏈尿佐菌(Streptozocin，STZ)誘導(dǎo)糖尿病大鼠模型，采用QPCR、Western blot和免疫熒光觀察糖尿病大鼠膀胱組織中Piezos的基因表達及蛋白水平變化，為探索糖尿病膀胱感覺信號變化規(guī)律及其病理生理學(xué)機制提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1實驗動物及主要實驗儀器、試劑

1.1.1實驗動物 斯?jié)娎鄹瘛ざ嗬?Sprague Dawley，SD)大鼠(第四軍醫(yī)大學(xué)實驗動物中心提供)，雄性，(250±20)g，18只，于動物中心購回適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后進行造模。

1.1.2主要實驗儀器及試劑 STZ(Sigma)，Rabbit Anti-Piezo1 antibody(abcam)，Goat Anti-Rabbit IgG(earthox),Mouse Anti-c-Kit antibody(santacruz)，Goat Anti-Mouse IgG(earthox)，Super M-MLV反轉(zhuǎn)錄酶、高純總RNA快速提取試劑盒和2×PowerTaqPCRMasterMix(BioTeke)，RabbitAnti-Piezo1 antibody(Abcam)，RabbitAnti-Piezo2 antibody(origene)，羊抗兔IgG-HRP (wanleibio)，激光共聚焦顯微鏡(Olympus FV1200)、熒光定量PCR儀(BIONEER)，凝膠成像系統(tǒng)(北京六一)。

1.2糖尿病大鼠模型的建立及實驗分組健康成年SD大鼠,體重(250±20)g，雄性，36只，隨機分為正常對照組(normal control,NC)和糖尿病組(diabetes mellitus,DM)，每組18只。實驗前大鼠禁食24 h，DM組大鼠按60 mg/kg單次腹腔注射1%STZ溶液(pH=4.5)，NC組大鼠腹腔注射等體積檸檬酸鹽緩沖液，所有大鼠飼養(yǎng)期間自由攝食和飲水。STZ誘導(dǎo)1周后取尾靜脈血，利用血糖儀檢測大鼠血糖水平，血糖水平≥16.7 mmol/L定義為糖尿病大鼠。每周測1次血糖和體重。

1.3大鼠膀胱組織取材NC組和DM組于1、2、8周后每組各取6只SD大鼠，采取10%水合氯醛按0.3 mL/100 g體重麻醉，仰臥固定，生理鹽水灌注后，恥骨上縱切口顯露膀胱，去除輸尿管及膀胱漿膜層后取出膀胱，反復(fù)用生理鹽水清洗膀胱，用濾紙吸干膀胱表面水分，沿膀胱縱軸切取適量膀胱組織用4%多聚甲醛溶液固定，剩余膀胱組織液氮速凍后置于-80 ℃超低溫冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4大鼠膀胱組織中Piezo1和c-kit免疫熒光觀察膀胱組織經(jīng)4%多聚甲醛溶液固定24 h后，蔗糖溶液梯度脫水，制作冰凍切片(10 μm)，以0.01 moL/L PBS充分漂洗冷凍切片，10 min/次，共3次。室溫23 ℃下，以3%牛血清蛋白(蘇聯(lián)albumin from bovine serum,BSA)溶液封閉處理切片，持續(xù)30 min。滴加一抗Rabbit Anti-Piezo1 antibody(1∶100)和Mouse Anti-c-kit antibody(1∶100)，4 ℃下過夜。次日取出過夜標本，再次洗滌，加入二抗 Goat Anti-Rabbit IgG(1∶200)、Goat Anti-Mouse IgG(1∶500)，室溫孵育3 h，漂洗后，加入DAPI細胞核著色10 min，漂洗后用50%甘油封片。將切片置于激光共聚焦顯微鏡下，觀察組織細胞形態(tài)及熒光表達情況。

1.5QPCR檢測大鼠膀胱中Piezo1和Piezo2mRNA的表達使用總RNA提取試劑盒提取NC組和DM組膀胱組織的總RNA，以各組總RNA為模板，用Super M-MLV反轉(zhuǎn)錄酶得到cDNA，利用2×Power Taq PCR Master Mix試劑盒在反應(yīng)體系(20 μL)下進行熒光定量PCR，其反應(yīng)體系為：cDNA模板1 μL，上下游引物(10 μmoL/L)各0.5 μL，SYBR GREEN mastermix 10 μL，用ddH2O補足至20 μL，按試劑盒說明書PCR反應(yīng)程序進行40個循環(huán)，然后儀器自動進行熔解曲線分析。每個樣品以β-actin的mRNA 表達作為內(nèi)參照，通過相對定量(2-ΔΔCt)法計算Piezo1和Piezo2在各樣品中相對 mRNA的表達水平。靶基因和內(nèi)參基因擴增的上下游引物序列(生工生物工程(上海)有限公司合成)(表1)。

表1QPCR引物序列及長度

基因引物序列長度(bp)Tm(℃)擴增(bp)Piezo1F:TGCCTCAGCCTCCTCTTC1855.3147R:CTTCAGGTCCAGCCTTGTA 1953.1Piezo2F:TAAGGAGTTCATCGGCAATA2053.5180R:AGGCAGCCAAACAGCAAT1856.2β-actinF:GGAGATTACTGCCCTGGCTCCTAGC2560.1R:GGCCGGACTCATCGTACTCCTGCTT2562.0155

1.6Westernblot檢測大鼠膀胱中Piezo1和Piezo2蛋白分別稱取NC組和DM組膀胱組織，放入裝有適量裂解液的勻漿管中，提取全蛋白，按照BCA法測定蛋白濃度。根據(jù)目的蛋白分子量配置SDS-PAGE，每孔上樣20 μL的蛋白樣品進行SDS-PAGE 電泳，轉(zhuǎn)印至聚偏二氟乙烯膜(polyvinylidene fluoride，PVDF)膜。5%脫脂奶粉室溫封閉 1 h，將抗Piezo1(1∶500)、Piezo2(1∶1 000)，β-actin(1∶1 000)抗體工作液倒入雜交袋中，放入封閉好的PVDF膜，用壓膜機封口，進行4 ℃孵育過夜，TBST漂洗5 min×4次，加入二抗羊抗兔IgG-HRP，37 ℃孵育45 min，TBST漂洗，ECL法底物發(fā)光。使用凝膠圖象處理系統(tǒng)(Gel-Pro-Analyzer)分析目標條帶的吸光度值，用目的蛋白灰度值/β-actin 灰度值代表目的蛋白的相對表達量。

2 結(jié) 果

2.1免疫熒光觀察分析激光共聚焦顯微鏡下觀察，c-kit 抗體主要在黏膜下層和肌肉包膜外表達，黏膜下層可見較多梭形分布間質(zhì)細胞表達，陽性呈綠色;Piezo1抗體遍布細胞表面，尿路上皮及肌細胞間信號較其它區(qū)域信號更強，陽性呈紅色。由圖1可見第1、2周時DM組紅色信號較NC組強，第8周時兩組紅色信號強度無顯著差異。綠色熒光信號在第1周時DM組和NC組無顯著差異，第2、8周時DM組較NC組弱(圖1)。

圖1造模成功后第1、2、8周時利用免疫熒光雙標法標記NC組和DM組

大鼠膀胱組織中Piezo1(紅色)和c-kit(綠色)的表達情況

第1、2周時DM組紅色信號較NC組強，第8周時兩組紅色信號強度無顯著差異。綠色熒光信號在第1周時DM組和NC組無顯著差異，第2、8周時DM組較NC組弱標尺20 μm。U： 尿路上皮；D：逼尿肌;↑ICCS。

2.2QPCR檢測結(jié)果分析DM組大鼠膀胱中Piezo1和Piezo2在第1、2周表達水平明顯高于NC組(P<0.01,P<0.05)，第8周時NC組和DM組Piezo1和Piezo2的表達水平無顯著性差異(P>0.05，圖2)。

圖2在第1、2、8周時，NC組和DM組大鼠膀胱組織中Piezo1和Piezo2的mRNA相對表達量

每個樣品以β-actin的mRNA 表達作為內(nèi)參照，通過相對定量(2-ΔΔCt)法計算Piezo1和Piezo2在各樣品中相對 mRNA的表達水平。DM組大鼠膀胱中Piezo1(A)和Piezo2(A)在第1、2周表達水平明顯高于NC組(P<0.01,P<0.05)，第8周時NC組和DM組Piezo1和Piezo2表達水平無顯著差異(P>0.05，n=3)。**P<0.01,*P<0.05。

2.3Westernblot結(jié)果分析DM組大鼠膀胱中Piezo1和Piezo2在第1、2周蛋白表達水平明顯高于NC組(P<0.05)，第8周時NC組和DM組Piezo1和Piezo2蛋白表達水平無顯著性差異(P>0.05,圖3)。

圖3造模成功后第1、2、8周時Westernblot法測定Piezo1和Piezo2在NC組和DM組大鼠膀胱組織中蛋白表達水平條帶及其柱狀圖

A：條帶圖； B、C：分別為兩組大鼠膀胱組織中Piezo1 (B)和Piezo2(C)蛋白表達水平比較柱狀圖，DM組大鼠膀胱中Piezo1和Piezo2在第1、2周蛋白表達水平明顯高于NC組(P<0.05)，第8周時NC組和DM組Piezo1和Piezo2蛋白表達水平無顯著性差異(P>0.05，n=3)。**P<0.01，*P<0.05。

3 討 論

DCP初期臨床癥狀多以刺激性癥狀為主，可表現(xiàn)為膀胱過度活動癥，包括逼尿肌過度興奮或膀胱感覺過敏誘發(fā)的尿急、尿頻、夜尿增多和急迫性尿失禁，后期則以梗阻性癥狀為主，多與假性膀胱梗阻相關(guān)，癥狀包括尿量減少和尿流率降低，尿后滴瀝，膀胱充盈感減弱和大量殘余尿[6]。目前通過對糖尿病膀胱病變的病因?qū)W研究發(fā)現(xiàn)本病主要與神經(jīng)因素、逼尿肌因素及其他因素有關(guān)，其中逼尿肌因素是近年來研究的熱點，主要由于逼尿肌細胞內(nèi)容物、相關(guān)酶類、離子通道、膜受體及神經(jīng)遞質(zhì)的改變而導(dǎo)致逼尿肌結(jié)構(gòu)及功能的損害[7]。近些年研究結(jié)果表明，膀胱尿路上皮不僅是尿路屏障，也可作為感受器發(fā)揮作用，膀胱尿路上皮上存在大量受體和離子通道，在膀胱受到損傷或炎癥時，膀胱尿路上皮對痛覺等刺激的反應(yīng)性發(fā)生改變，釋放前列腺素等介質(zhì)，影響膀胱傳入神經(jīng)，從而在DCP膀胱功能障礙中發(fā)揮作用[8]。Piezos作為機械敏感性受體，可將機械性刺激轉(zhuǎn)變?yōu)殡娦盘柣蚧瘜W(xué)，Piezo1在泌尿道存在表達，經(jīng)機械刺激后可產(chǎn)生Ca2+內(nèi)流和ATP釋放，是泌尿道感知尿流和壓力的重要機制[9]，另外，Piezo1被大量激活后可促進膀胱黏膜增生，出現(xiàn)膀胱肥大[10]，可認為是DCP產(chǎn)生膀胱肥大因素之一。

本研究用1%STZ誘導(dǎo)糖尿病大鼠模型，在造模成功第1、2周后，用QPCR和Western blot檢測發(fā)現(xiàn)：DM組大鼠膀胱組織Piezo1的mRNA和蛋白表達水平較NC組增強，動物實驗證實，在部分膀胱出口梗阻(partial bladder outlet obstruction，pBOO)初期，大鼠膀胱組織Piezo1顯著增加，膀胱敏感性增加，出現(xiàn)尿頻癥狀[4]，這與本研究結(jié)果類似。對Piezo1和c-kit進行免疫熒光顯示，第1、2周DM組Piezo1熒光信號明顯高于NC組，尤其是在黏膜層；在造模成功第8周時，兩組大鼠膀胱組織Piezo1熒光信號強度無明顯差異。但是，c-kit免疫熒光信號則隨患糖尿病時間逐漸減弱，而c-kit為間質(zhì)細胞(interstitial cells of Cajal ICCs)特異標志物，目前研究證明膀胱中的ICCs是自主神經(jīng)末梢與逼尿肌之間信號的有力轉(zhuǎn)導(dǎo)，在膀胱黏膜下ICCs產(chǎn)生動作電位而誘導(dǎo)逼尿肌收縮。糖尿病會導(dǎo)致膀胱ICCs數(shù)量減少，從而動作電位產(chǎn)生減少，出現(xiàn)逼尿肌麻痹，對機械刺激敏感性下降，膀胱殘余尿量增加[11]，由以上結(jié)果可推斷，在DCP第1、2周時，大鼠膀胱組織Piezo1表達水平顯著升高，膀胱黏膜組織中Piezo1增多，使得尿路上皮對所受到的機械刺激更加敏感，彌補了因糖尿病初期ICCs功能降低所導(dǎo)致的逼尿肌麻痹現(xiàn)象。

Piezo2主要存在背根神經(jīng)節(jié)，有文獻指出，Piezo2在調(diào)節(jié)神經(jīng)及運動功能中起重要作用[12-13]，在DRG中干擾Piezo2表達可調(diào)節(jié)細胞的感覺閾值[14]。本研究采用QPCR和Western blot對膀胱中的Piezo2進行定量分析，發(fā)現(xiàn)Piezo2在正常膀胱組織中表達較少，在第1、2周時，糖尿病大鼠膀胱組織中Piezo2較正常組顯著增加，8周時下降與正常對照組比較無顯著差異。

目前關(guān)于Piezos的研究表明，Piezos在尿路上皮和腎上皮細胞確實存在，且可作為感受器感受組織所受機械力等作用[15]，MAI等[4]研究指出在大鼠PBOO模型的膀胱組織中Piezo1可較正常組顯著增加。我國學(xué)者研究指出Piezos廣泛存在于腸道、牙周組織，通過免疫組織化學(xué)染色觀察發(fā)現(xiàn)Piezo1在直腸組織內(nèi)無表達，Piezo2在直腸黏膜內(nèi)有一定表達，并在介導(dǎo)直腸感覺和排便過程中發(fā)揮重要作用[16]。但是Piezo1在牙周組織中要遠多于Piezo2，參與牙周組織的感知功能[17]。本研究顯示，DCP初期，Piezo1和Piezo2可顯著增加，從而使膀胱對機械刺激更加敏感，產(chǎn)生尿頻等癥狀；DCP后期，由于Piezo1和Piezo2與正常對照組無顯著差異，膀胱對機械刺激敏感性下降，尿頻癥狀減弱，膀胱殘余尿量增加，這一現(xiàn)象可能與高血糖致膀胱組織損傷有關(guān)，而且有關(guān)DCP中Piezos的研究目前國內(nèi)外尚未見文獻報道，尚需進一步研究。

總之，DCP初期，大鼠膀胱組織中Piezo1和Piezo2可顯著增加，增強膀胱對機械刺激的敏感性，是產(chǎn)生尿頻癥狀的重要因素之一。

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