劉小平 朱小兵 吳 論

1.廣東省中山市石岐蘇華贊醫(yī)院麻醉科，廣東中山 528402；2.廣東省中山市中醫(yī)院麻醉科，廣東中山 528400

呼吸機相關性肺損傷是呼吸支持治療中機械通氣相關性并發(fā)癥之一，常見于重癥醫(yī)學中[1-2]。有關研究表明，呼吸機相關性肺損傷與過度牽拉肺泡導致肺血管內(nèi)皮細胞激活相關信號轉到通路，引起炎性反應有關[3-7]。有研究提示右美托咪定可以減輕呼吸機相關性肺損傷，機制可能與其可抑制炎性反應相關[8-9]，但其抑制炎性反應的具體信號通路尚不明確。另外動物實驗研究，提示右美托咪定腎保護作用可能與P13K/Akt信號通路有關[10]。缺氧誘導因子-1α 是內(nèi)源性保護機制的始動因子和共同途徑，是P13K/Akt信號通路的下游因子[11]。評價磷脂酰肌醇3-激酶-絲氨酸-蘇氨酸蛋白激酶-缺氧誘導因子-1α信號通路在右美托咪定減輕大鼠呼吸機相關性肺損傷中的作用，探討其減輕VILI的可能機制。

1 材料與方法

1.1 實驗對象

成年雄性SD大鼠60只，體重300～350g。隨機將其分為4組（n=15）：對照組（C組）、機械通氣組（V組）、右美托咪定組（D組）和右美托咪定+LY294002組（DL組）。

1.2 模型制備

20%烏拉坦溶液麻醉后，股動脈穿刺置管術，測動脈壓，股靜脈輸注乳酸鈉林格氏液10mL/（kg·h）；氣管切開氣管導管，機械通氣2.5h，C組保留大鼠自主呼吸，其余三組大潮氣量，高頻率通氣；D組于術前10min內(nèi)靜脈輸注完右美托咪定（批號：13040932，江蘇恒瑞醫(yī)藥有限公司）5μg/kg后，以2.5μg/（kg·h）的速率輸注至實驗結束；PI3K抑制劑LY294002輸注方法參考文獻[5]，DL組給予右美托咪定前靜脈注射LY294002（批號：Y1503s，碧云天生物技術研究所）0.3mg/kg，輸注時間5min，其余注射等量生理鹽水。

1.3 實驗指標

于機械通氣前（T0）、機械通氣結束時（T1）、機械通氣結束30min（T2）時血氣分析后，記錄RI和OI；取左肺組織，勻漿后，采用雙抗體夾心ELISA法（Santa CmZ公司），檢測TNF-α、IL-6和IL-10的含量；取右肺中葉組織，稱濕重（W），烘干，稱干重（D），計算肺W/D比值。取右肺組織，甲醛固定24h，行石蠟包埋、切片、HE染色，光鏡下觀察肺組織形態(tài)的改變。取右肺前葉，抽提蛋白，Westrern-blot方法檢測P-Akt和HIF-1α的表達，參考文獻[5]的方法采用10%聚丙烯酰胺凝膠電泳分離，轉移至聚乙烯二氟膜，濾膜封閉，分別加入抗p-Akt一抗（Santa Cruz 公司，美國）和抗HIF-1α，4℃過夜，TBS洗膜后，過氧化物標記的二抗，以β-actin為內(nèi)參。發(fā)光與顯色后，采用凝膠掃描成像系分析圖像，以灰度值與β-actin積分光密度指的比值反映P-Akt和 HIF-1α的表達[5]。

1.4 統(tǒng)計學方法

所以數(shù)據(jù)應用SPSS14.0統(tǒng)計軟件處理，多組計量資料采用F檢驗， 組間比較采用SNK-q檢驗，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 呼吸指數(shù)及氧合情況比較

與C組比較，其余三組T1、T2時RI升高，OI降低；與V組比較，D組和DL組T1、T2時RI降低，OI升高；DL組RI較D組降低、OI增高。見表1～2。

表1 四組大鼠不同時點呼吸指數(shù)比較（±s，n=12）

表1 四組大鼠不同時點呼吸指數(shù)比較（±s，n=12）

注：與C組比較，aP＜0.05；與V組比較，bP＜0.05；與DL組比較，cP＜0.05

組別 T0 T1 T2 C組 0.30±0.08 0.27± 0.05 0.30±0.03 V組 0.29±0.07 4.60±0.20a 7.17±0.11a DL組 0.31±0.07 3.81±0.05ab 6.78±0.02ab D組 0.33±0.02 1.00±0.11abc 1.57±0.07abc F 0.25 2.95 7.58 P ＞0.05 ＜0.05 ＜0.05 t（V與DL比較） 1.32 4.74 10.2 t（V與D比較） 0.95 6.25 58.2 t（D與DL比較） 1.02 4.68 42.5 P ＞0.05 ＜0.05 ＜0.05

表2 四組大鼠不同時點氧合情況比較（±s，n=12）

表2 四組大鼠不同時點氧合情況比較（±s，n=12）

注：與C組比較，aP＜0.05 ； 與V組比較，bP＜0.05 ；與DL組比較，cP＜0.05

組別 T0 T1 T2 C組 475±40 485±30 464±34 V組 476±38 237±28a 245±34a DL組 473±29 305±26ab 309±28ab D組 458±29 330±24abc 372±30abc F 0.27 2.75 2.70 P ＞0.05 ＜0.05 ＜0.05 t （V與DL比較） 0.06 3.87 4.87 t（V與D比較） 0.21 9.25 10.24 t（D與DL比較） 0.17 3.51 6.54 P ＞0.05 ＜0.05 ＜0.05

2.2 肺組織炎性因子比較

與C組比較，其余三組肺組織TNF-α、IL-6、IL-10含量及W/D比升高；與V組比較，D組和DL組肺組織TNF-α、IL-6 、IL-10含量升高，W/D比降低（P＜0.05）；DL組肺組織TNF-α、IL-6含量及W/D比降低、IL-10含量較D組高（P＜0.05）。見表3。

表3 四組大鼠肺組織IL-6、W/D、TNF-α、IL-10和HO-1比較 （±s，n=12）

表3 四組大鼠肺組織IL-6、W/D、TNF-α、IL-10和HO-1比較 （±s，n=12）

注：與C組比較， aP＜0.05；與V組比較， bP＜0.05；與DL組比較，cP＜0.05

組別 W/D TNF-α（pg/g） IL-6 （pg/g） IL-10 （pg/g） HO-1 C組 4.30±0.20 87.8±22.8 10.7±3.0 34.2±22.4 0.009±0.001 V組 6.22±0.47 184.0±22.5a 20.9±3.4a 93.9±11.2a 0.090±0.020a DL組 5.45±0.32 234.5±16.4ab 27.3±2.6ab 173.5±15.5ab 0.150±0.030ab D組 5.14±0.23 110.2±12.5abc 13.1±2.8 abc 240±12.3 abc 0.335±0.050 abc F 0.215 2.68 3.25 2.71 2.98 P＞0.05 ＜0.05 ＜0.05 ＜0.05 ＜0.05 t（V與DL） 1.43 2.52 6.2 16.2 23.04 t（V與D） 1.55 3.58 6.5 30.3 32.5 t（D與DL） 1.10 5.68 11.2 12.3 20.2 P＞0.05 ＜0.05 ＜0.05 ＜0.05 ＜0.05

2.3 P-Akt和HIF-1α表達比較

與C組比較，P-Akt表達下調(diào)和HIF-1α表達上調(diào)（P＜0.05）；與V組比較， P-Akt和HIF-1α表達上調(diào)（P＜0.05）。DL組肺組織較D組P-Akt和HIF-1α表達上調(diào)（P＜0.05）。見表4。

表4 四組大鼠肺組織P-Akt和HIF-1α表達水平

3 討論

呼吸機相關肺損傷在臨床上不不少見，尤其在重癥醫(yī)學監(jiān)護室情況多見。研究和探討減少這種損傷的方法和機制有一定的臨床價值。此前有報道稱右美托咪啶可以減輕呼吸機相關肺損傷，但是它的相關可能機制并不清楚，有必要進一步研究并明確它的機制。所以我們研究中參考文獻[12]成功建立呼吸機相關性肺損傷動物模型。我們的結果也提示，機械通氣可以誘發(fā)了大鼠呼吸機相關性肺損傷。

過去公開報道中提到TNF-α是一種急性肺損傷的啟動因子，它通過誘導NO，內(nèi)皮素、氧自由基等的產(chǎn)生導致肺損傷[13]。我們研究中參照文獻[14]，結合人體動物劑量換算公式，最終選擇右美托咪定的給藥為術前10min靜脈輸注右美托咪定5μg/kg，再2.5μg/（kg·h）的速度靜脈給藥。本研究結果表明，與DL組比較，D組肺組織TNF-α、IL-6含量及W/D比降低、IL-10含量升高，RI降低、OI升高，DL組損傷程度高于D組，但仍低于V組，提示右美托咪定可減輕大鼠呼吸機相關性所致肺損傷，LY294002可部分抑制右美托咪定的肺保護作用。

本研究結果表明，相對C組來看，V組肺組織p-Akt表達情況下調(diào)，此結果間接提示呼吸機相關性肺損傷有可能與PI3K/Akt信號通路參與有關系；相對于V組來比較，我們發(fā)現(xiàn)D組肺組織p-Akt表達情況上調(diào)。LY294002是PI3K的特異性抑制劑，它通過靶向抑制PI3K的催化亞基pll0，再則減少靶分子PDK和Akt的活化[15]。此次研究給予LY294002完，我們發(fā)現(xiàn)DL組肺組織p-Akt表達水平較D組低許多，間接告訴我們LY294002可以有效地抑制P13K/Akt信號通路，進一步確認右美托咪定減輕肺損傷和它抑制PI3K/Akt信號通路有關系。

我們還發(fā)現(xiàn)，p-Akt與HIF-1α的變化趨勢一致，進一步確認HIF-1α的表達與PI3K/Akt信號通路有一定的關系，右美托瞇定的上述作用可能與PI3K-Akt-HIF- 1α信號通路有關。

另外我們也發(fā)現(xiàn)，同V組來看，DL組肺損傷較低，此結果間接提示PI3K-Akt-HIF-1α通路抑制劑并不能完全抵消右美托咪定的作用，這一有趣現(xiàn)象告訴我們，在PI3K-Akt-HIF-1α通路以外的有其他分子通道亦可能也參與了右美托咪定的肺保護作用。

通過本次實驗研究，我們可以得出這樣的結論：右美托咪定可能通過影響P13K-Akt-HIF-1α信號通路進而減輕大鼠呼吸機相關性肺損傷。