蒲 江，魏 曉，龔財(cái)判，劉 琦，張麗玲，李 麗，歐三桃

慢性腎臟病(Chronickidneydisease，CKD)患者均可能存在不同程度的血管鈣化，CKD3期患者血管鈣化發(fā)生率約40%，CKD5期則高達(dá)80-90%[1]。同時(shí)血管鈣化也是CKD患者心血管疾病發(fā)病率和病死率增加的主要危險(xiǎn)因素[2]，有研究報(bào)道血管鈣化導(dǎo)致的死亡率約占終末期腎病總死亡率的30%[3]。近年研究發(fā)現(xiàn)血管平滑肌細(xì)胞(vascularsmoothmusclecells，VSMCs)表型轉(zhuǎn)換、鈣化抑制物缺乏、礦物失衡等多種因素均參與該過程，其中VSMCs表型轉(zhuǎn)換是關(guān)鍵環(huán)節(jié)。而目前關(guān)于血管鈣化發(fā)生的確切機(jī)制尚不完全明確，需要研制出一種準(zhǔn)確、 簡便、穩(wěn)定性好的CKD血管鈣化的動(dòng)物模型。腺嘌呤能誘導(dǎo)與臨床高度類似的慢性腎衰竭動(dòng)物模型，而高磷血癥在CKD血管鈣化的發(fā)生發(fā)展中也起著十分重要的作用，因此本研究擬采用腺嘌呤加高磷飲食的造模方法以期構(gòu)建出與臨床高度相似的CKD血管鈣化模型。

1材料與方法

1.1試驗(yàn)動(dòng)物SPF級(jí)雄性SD大鼠45只，體重190-270g(7-8周齡)，購自西南醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。(動(dòng)物使用許可證：SYXK(川)2013-065)。

1.2主要試劑 腺嘌呤(Sigma公司，美國)；1.8%高磷飼料(北京科澳協(xié)力，中國)；小鼠抗α-SMA單克隆抗體(武漢博士德)；兔抗Runx2單克隆抗體(北京博奧森)；DAB顯色試劑盒(北京中杉金橋)；Eastep?SuperTotalRNAExtractionKit、Eastep?RTMasterMix(5×)Kit、Eastep?qPCRMasterMix(2×)Kit(上海普洛麥格)；5%硝酸銀溶液、5%硫代硫酸鈉溶液(上海源葉生物)；鈣含量測定試劑盒(微板法)(南京建成生物)。

1.3實(shí)驗(yàn)分組及CKD血管鈣化模型制備SPF級(jí)雄性SD大鼠45只，適應(yīng)性喂養(yǎng)10天后，隨機(jī)分為CKD組(n=24只)和對(duì)照組(n=21只)。1g腺嘌呤溶于40ml蒸餾水，磁力攪拌器上適當(dāng)加溫混勻，制成2.5%混懸液。第1-4周CKD組每日給予2.5%腺嘌呤混懸液(220-250mg/kg.d)灌胃，聯(lián)合使用1.8%高磷飼料喂養(yǎng)，第5-6周給予腺嘌呤混懸液隔日灌胃；對(duì)照組給予等量生理鹽水灌胃，普通飼料喂養(yǎng)。

1.4標(biāo)本采集及指標(biāo)檢測 實(shí)驗(yàn)第2、4、6周末，分別于2組中隨機(jī)選取大鼠，收集24h尿液檢測尿蛋白定量(24hoururineprotein，24hUpro)，處死大鼠后留取血液、腎臟及主動(dòng)脈標(biāo)本；血液用于檢測BUN、Scr、血鈣、血磷；將兩側(cè)腎臟，置于10%福爾馬林溶液中固定用于HE染色；剝離主動(dòng)脈，一部分固定于10%福爾馬林溶液中，用于免疫組化檢測及VonKossa染色，一部分保存于-80℃冰箱中，用于測定主動(dòng)脈鈣含量，剩余組織保存在裝有RNA保存液的凍存管中，并置于-80℃冰箱用于PT-PCR檢測。

1.4.124h-Upro、腎功能和鈣磷檢測：采用全自動(dòng)生化分析儀測定24h-Upro、肌酐(Scr)、尿素氮(BUN)及鈣磷的水平。

1.4.2腎臟HE染色：腎臟組織常規(guī)石蠟切片，進(jìn)行蘇木精-伊紅(HE) 染色，觀察腎小球、腎小管及腎間質(zhì)的病理改變。

1.4.3主動(dòng)脈VonKossa染色：主動(dòng)脈組織進(jìn)行石蠟包埋、切片、脫蠟、脫水，置于5%的硝酸銀溶液中，紫外光燈照射60分鐘，置于5%硫代硫酸鈉溶液中5分鐘，堿性品紅復(fù)染、脫水、透明、封片，于光學(xué)顯微鏡下觀察。

1.4.4鈣含量測定：準(zhǔn)確稱取主動(dòng)脈組織，按照重量體積比=1:9，加入生理鹽水，冰水浴下勻漿，3500r/min，10min，留取上清液測量。按照試劑說明書，在測定孔、標(biāo)準(zhǔn)孔、空白孔各加入10ul樣本、標(biāo)準(zhǔn)液、去離子水，再分別加入250ul工作液，充分混勻后靜置10min，將酶標(biāo)儀波長調(diào)至610nm，再測定各孔的OD值。采用BCA蛋白濃度檢測計(jì)算出總蛋白濃度。根據(jù)公式鈣含量(mmol/gprot)=(測定OD值-空白OD值)/(標(biāo)準(zhǔn)OD值-空白OD值)×標(biāo)準(zhǔn)品濃度(1mmol/L)÷待測樣本蛋白濃度(mmol/gprot)，計(jì)算出鈣含量。

1.4.5免疫組化法測定主動(dòng)脈上α-SMA、Runx2蛋白的表達(dá)：按照免疫組化試劑盒操作說明書，將主動(dòng)脈組織石蠟切片脫蠟水化，修復(fù)抗原，先后予以3%H2O2滅活內(nèi)源性過氧化物酶10min、10%山羊血清室溫封閉處理15min，各加入小鼠抗α-SMA和兔抗Runx2單抗，經(jīng)4℃冰箱過夜后，加入生物素標(biāo)記二抗(室溫20min)，清洗后DAB顯色，脫水、透明、封片后鏡檢。采用Image-ProPlus6.0軟件進(jìn)行分析，各切片隨機(jī)觀察視野，測定陽性部位(棕黃色顆粒)的吸光度值，計(jì)算其平均值和標(biāo)準(zhǔn)差。

1.4.6RT-PCR檢測α-SMAmRNA、Runx2mRNA的表達(dá)：根據(jù)Eastep?SuperTotalRNAExtractionKit說明書提取主動(dòng)脈組織中的總RNA，按照逆轉(zhuǎn)錄酶試劑盒Eastep?RTMasterMix(5×)Kit操作步驟將mRNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，RT-PCR程序如下：95℃ 預(yù)變性 10min，40個(gè)循環(huán)(95℃ 變性 15s，55℃ 退火 30s，71℃ 延伸 30s)。根據(jù)樣品PCR反應(yīng)得到的Ct值，計(jì)算出目的基因的相對(duì)表達(dá)量，并進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。

2結(jié) 果

2.124h-Upro及腎功能結(jié)果 與對(duì)照組相比，各時(shí)間點(diǎn)CKD組大鼠的24h-Upro、尿素氮及肌酐均明顯升高(P<0.01)，見圖1。

圖1：各時(shí)間點(diǎn)24h-Upro、尿素氮及肌酐值

2.2血清鈣、磷及鈣磷乘積 與對(duì)照組相比，從第4周開始CKD組血清鈣水平明顯降低，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；CKD組血清磷水平均顯著增加，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)；CKD組血清鈣磷乘積水平均顯著增加，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。見圖2。

圖1：各時(shí)間點(diǎn)鈣、磷及鈣磷乘積水平

2.3腎臟HE染色病理改變 對(duì)照組：腎臟皮髓質(zhì)界限清楚，腎小球、腎小管及腎間質(zhì)形態(tài)正常。CKD組：第2周末可見少數(shù)腎小球囊腔輕度擴(kuò)張，近端小管擴(kuò)張，管內(nèi)少許棕黃色顆粒物質(zhì)沉積；第4周末腎小球囊腔明顯擴(kuò)張，腎小球部分萎縮，近端小管擴(kuò)張顯著加重，管內(nèi)棕黃色顆粒物質(zhì)沉積較前明顯增多，腎間質(zhì)可見纖維化；第6周末腎臟結(jié)構(gòu)紊亂，皮髓質(zhì)分界不清，腎小球顯著萎縮，囊腔顯著擴(kuò)張，全程腎小管重度擴(kuò)張，部分上皮細(xì)胞變性壞死，管內(nèi)可見大量棕黃色顆粒物質(zhì)沉積，腎間質(zhì)明顯纖維化，血管明顯減少，可見炎性細(xì)胞浸潤。見圖3。

A1.對(duì)照組第2周; B1. CKD組第2周

2.4主動(dòng)脈VonKossa染色 對(duì)照組各時(shí)間點(diǎn)主動(dòng)脈組織形態(tài)結(jié)構(gòu)正常；CKD組2周末時(shí)血管形態(tài)結(jié)構(gòu)基本正常；4周末時(shí)可見少量黑色顆粒物質(zhì)沉積；6周末時(shí)可見大量黑色顆粒物質(zhì)沉積，主動(dòng)脈中膜平滑肌纖維斷裂，血管僵硬度顯著增加，見圖4。

2.5主動(dòng)脈鈣含量測定 與對(duì)照組相比，各時(shí)間點(diǎn)CKD組主動(dòng)脈鈣含量水平顯著增高，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。見圖5。

A1.對(duì)照組第2周; B1. CKD組第2周A2.對(duì)照組第4周; B2. CKD組第4周A3.對(duì)照組第6周; B3. CKD組第6周

圖5：各時(shí)間點(diǎn)主動(dòng)脈鈣含量水平

2.6主動(dòng)脈組織α-SMA、Runx2蛋白的表達(dá) 對(duì)照組主動(dòng)脈平滑肌可見α-SMA蛋白廣泛表達(dá)，呈棕黃色；與對(duì)照組相比，CKD組各時(shí)間點(diǎn)主動(dòng)脈平滑肌α-SMA蛋白表達(dá)明顯減少(P<0.05)，見圖6；對(duì)照組主動(dòng)脈平滑肌Runx2蛋白極少表達(dá)；與對(duì)照組相比，CKD組各時(shí)間點(diǎn)主動(dòng)脈平滑肌可見Runx2蛋白廣泛表達(dá)(P<0.05)，見圖7。

A1.對(duì)照組第2周;B1.CKD組第2周

A2.對(duì)照組第4周;B2.CKD組第4周

A3.對(duì)照組第6周;B3.CKD組第6周

圖6：各時(shí)間點(diǎn)α-SMA的表達(dá)

圖8：各時(shí)間點(diǎn)α-SMA mRNA和Runx2 mRNA的水平

2.7主動(dòng)脈組織α-SMAmRNA和Runx2mRNA的表達(dá) 與對(duì)照組相比，CKD組主動(dòng)脈各時(shí)間點(diǎn)α-SMAmRNA表達(dá)顯著降低(P<0.01)，而Runx2mRNA表達(dá)明顯升高(P<0.05)，見圖8。

A1.對(duì)照組第2周;B1.CKD組第2周

A2.對(duì)照組第4周;B2.CKD組第4周

A3.對(duì)照組第6周;B3.CKD組第6周

圖7：各時(shí)間點(diǎn)Runx2的表達(dá)

3討 論

CKD患者死亡的首要原因是心血管疾病(cardiovasculardisease，CVD)，且CVD發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)比一般人群高20-30倍[4]，有報(bào)道約50%的CKD5D期患者發(fā)生并死于CVD[5,6]。血管鈣化廣泛存在CKD患者，而且是CKD患者心血管疾病及全因死亡率的強(qiáng)力預(yù)測因子。為了探究CKD血管鈣化的發(fā)生機(jī)制及防治方法，需選用CKD誘導(dǎo)血管鈣化的模型，然而既往CKD模型出現(xiàn)血管鈣化的時(shí)間較長，延長了實(shí)驗(yàn)周期，因此為了便于研究，需建立一種快速簡便的CKD血管鈣化模型。

目前可用于制作血管鈣化模型的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有小鼠、大鼠、兔、微型豬等，常用的造模方法有藥物誘導(dǎo)(如維生素D3、華法林等)、基因敲除(如基質(zhì)Gla蛋白缺陷小鼠、Klotho基因缺陷小鼠、骨橋蛋白缺陷小鼠等)、高脂及高膽固醇飲食喂養(yǎng)的近交系小鼠、慢性腎衰竭誘導(dǎo)等[7]，上述方法中慢性腎衰竭誘導(dǎo)模型更適合本研究。制作CKD動(dòng)物模型的常用方法包括：腺嘌呤混懸液灌胃、5/6腎切除、UUO模型、腎動(dòng)脈分支結(jié)扎等方法，上述方法各存在優(yōu)缺點(diǎn)。其中腺嘌呤誘導(dǎo)CKD大鼠模型歷史悠久。腺嘌呤進(jìn)入機(jī)體后，通過堵塞腎小管、炎性反應(yīng)及氧化應(yīng)激等途徑誘導(dǎo)CKD的發(fā)生[8]。Yokozawa[9]等首創(chuàng)該模型，通過0.75%腺嘌呤飲食喂養(yǎng)大鼠40、50和60天，分別制作出輕、中、重的CKD模型，隨后鄭平東[10]等研制出用腺嘌呤混懸液灌胃的方法制作CKD大鼠模型。然而關(guān)于腺嘌呤誘導(dǎo)CKD血管鈣化的研究較少報(bào)道。在CKD血管鈣化的發(fā)生發(fā)展中，高磷血癥起著十分重要的作用，研究發(fā)現(xiàn)高磷血癥可通過促進(jìn)VSMCs成骨樣分化、誘導(dǎo)VSMCs凋亡、促進(jìn)基質(zhì)小泡釋放等途徑而促進(jìn)血管鈣化[11]。但是單獨(dú)予以高磷飲食喂養(yǎng)大鼠，需要6個(gè)月的時(shí)間才出現(xiàn)血管鈣化[12]。

本研究擬在腺嘌呤混懸液灌胃的基礎(chǔ)上聯(lián)合高磷飲食制作大鼠CKD血管鈣化的模型。結(jié)果顯示CKD組血肌酐、尿素氮均較對(duì)照組明顯升高，同時(shí)出現(xiàn)高磷低鈣，腎臟病理改變也符合CKD病理特征，說明CKD造模成功；同時(shí)第4周末VonKossa染色可見主動(dòng)脈有少量黑色顆粒物質(zhì)沉積，主動(dòng)脈鈣含量測定也明顯增加；CKD組主動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞的特異性標(biāo)志物α-SMA及其mRNA水平明顯減低，而成骨樣分化調(diào)節(jié)因子Runx2及其mRNA水平明顯增加，即成功制作出CKD血管鈣化動(dòng)物模型。

制作血管鈣化模型的常見方法，如基因敲出、藥物誘導(dǎo)、高脂飲食喂養(yǎng)等，從致病機(jī)制上講并不能模擬CKD血管鈣化的過程。然而在本研究模型中，隨著腎功能的不斷下降，逐漸出現(xiàn)低鈣高磷而啟動(dòng)血管鈣化，并觀察到明顯的鈣化結(jié)節(jié)沿主動(dòng)脈中膜連續(xù)性分布，同時(shí)出現(xiàn)平滑肌細(xì)胞由收縮表型向成骨樣細(xì)胞表型轉(zhuǎn)換等相關(guān)復(fù)雜過程，能很好模擬CKD血管鈣化的病理生理過程。目前常用的CKD血管鈣化動(dòng)物模型包括5/6腎切除大鼠模型和腺嘌呤腎毒性大鼠模型，然而5/6腎切除大鼠模型存在如下缺點(diǎn)：1需通過外科手術(shù)建立模型，手術(shù)耗時(shí)長，增加了感染及麻醉風(fēng)險(xiǎn)，大大增加了死亡率；2建模周期長，需配合高磷飲食誘導(dǎo)血管鈣化且發(fā)生率低，有研究報(bào)道5/6腎切除+高磷飲食模型大鼠在第3個(gè)月時(shí)仍未出現(xiàn)明顯的血管鈣化[13]；單純腺嘌呤飲食干預(yù)誘導(dǎo)CKD模型所需時(shí)間長，約8-12周，且血管鈣化發(fā)生率僅15%左右，而單獨(dú)高磷飲食誘導(dǎo)血管鈣化需要6個(gè)月[12]。本研究采用腺嘌呤混懸液灌胃聯(lián)合高磷飲食制作大鼠CKD血管鈣化模型，具有以下優(yōu)點(diǎn)：1建模時(shí)間短，成模率高，血管鈣化發(fā)生率高，明顯縮短了試驗(yàn)周期；2能很好模擬CKD血管鈣化的病理生理過程；3不用外科手術(shù)，操作過程簡便易行。因此該模型為進(jìn)一步研究CKD血管鈣化發(fā)生機(jī)制及防治提供了一個(gè)快速準(zhǔn)確的動(dòng)物模型，值得進(jìn)一步推廣。