馬大昌 陳 誠 武 君 王紅磊 吳多明

(蘭州大學第一醫(yī)院乳腺病科，甘肅 蘭州 730000)

世界衛(wèi)生組織發(fā)表的《全球癌癥報告2014》中顯示，全球新發(fā)女性乳腺癌患者多達100多萬，占女性惡性腫瘤的發(fā)病的23%，嚴重危害女性健康〔1〕。目前，治療乳腺癌的手段主要包括手術(shù)治療、化療和放療，但效果不佳，患者預后較差〔2〕。近年來，從天然產(chǎn)物中尋找毒副作用小、活性強的抗乳腺癌藥物成為研究的熱點。刺囊酸是從皂莢中提取的三萜酸，已有研究報道刺囊酸對肝癌〔3〕、白血病〔4〕、卵巢癌和子宮內(nèi)膜癌〔5〕具有顯著的抗癌活性，但其對乳腺癌的影響尚未見報道。本研究觀察不同濃度刺囊酸對乳腺癌細胞MCF-7增殖和凋亡的影響。

1 材料和方法

1.1細胞和試劑 人乳腺癌細胞株MCF-7購自美國ATCC細胞庫。培養(yǎng)基和胎牛血清購自美國BI 公司。5-乙炔基-2′-脫氧尿嘧啶核苷(EdU)細胞增殖檢測試劑盒購自廣州銳博生物科技有限公司。3-(4,5-二甲基噻唑-2)-5-(3-羧甲酯基)-2-(4-磺苯基)-2H-四唑(MTS)購自美國Promega公司。流式細胞檢測試劑盒購自美國BD公司。蛋白提取試劑盒和聚氰基丙烯酸正丁酯(BCA)蛋白濃度測定試劑購自上海碧云天生物技術(shù)公司。Bax一抗、Bcl-2一抗、GAPDH一抗和羊抗鼠二抗購自美國Abcam公司。

1.2細胞培養(yǎng) 人乳腺癌細胞株MCF-7用含10%胎牛血清RPMI1640，37℃、5%CO2恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.3MTS檢測細胞活力 取對數(shù)生長期的細胞接種于96孔板中(1×105個/ml)，經(jīng)不同濃度刺囊酸處理24、48、72 h后，吸棄培養(yǎng)基，加入用培養(yǎng)基配置的MTS工作液(MTS∶培養(yǎng)基=1∶5)，培養(yǎng)板放置于培養(yǎng)箱中繼續(xù)孵育1 h，取出培養(yǎng)板與490 nm檢測吸光度OD值，抑制率=〔1-(實驗組吸光度值-空白對照組吸光度值)/(對照組吸光度值-空白對照組吸光度值)×100%〕。

1.4EdU檢測細胞增殖能力 細胞經(jīng)不同濃度刺囊酸處理24 h后，加入EdU滲入工作液，培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)3 h，取出培養(yǎng)板，4%多聚甲醛固定30 min，甘氨酸中和多余多聚甲醛后，加入0.5% TritonX-100室溫孵育10 min，磷酸鹽緩沖液(PBS)洗滌后，加入染色液37℃孵育30 min，PBS洗去多余染色液，4′,6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)染核3 min，于熒光顯微鏡下拍照，藍色為細胞核，綠色為EdU陽性細胞，即新增殖的細胞，隨機選取5個視野求平均值，EdU陽性率=(EdU陽性細胞數(shù)/DAPI染色總細胞數(shù))×100%。實驗重復 3 次。

1.5流式細胞術(shù)檢測凋亡率 取對數(shù)生長期的細胞接種于6孔板中(5×105個/ml)，經(jīng)不同濃度刺囊酸處理24 h后，胰蛋白酶消化細胞，PBS洗滌，收集細胞再用1×緩沖液100 μl重懸，加入Annexin-V和碘化丙錠(PI)各5 μl。在流式細胞儀(BD FACSCantoⅡ)上檢測。采集的數(shù)據(jù)用Flow Jo軟件分析細胞凋亡情況，凋亡率=(早期凋亡細胞數(shù)+晚期凋亡細胞數(shù))/全部細胞數(shù)×100%。實驗重復 3 次。

1.6Western印跡檢測細胞凋亡相關(guān)蛋白Bax和Bcl-2的表達 收集細胞，加入蛋白裂解液〔WIP 裂解液：苯甲基磺酰氟(PMSF)=100∶1〕，裂解1 h后離心，吸取上清，加入上樣緩沖液變性(99℃，7 min)，運用 BCA 蛋白測定試劑盒檢測蛋白濃度。制備 10%的分離膠和濃縮膠，根據(jù)上述測定的蛋白濃度計算上樣體積(20 μg總蛋白)，控制電壓和時間(80 V，30 min；120 V，1 h)跑膠，濕轉(zhuǎn)法轉(zhuǎn)膜，聚偏氟乙烯(PVDF)膜孵育一抗(Bax和 Bcl-2，均 1∶1 000)4 ℃過夜，三羥甲基氨基甲烷吐溫緩沖液(TBST)漂洗，加入二抗室溫孵育 1 h，TBST 漂洗，置于自動顯影儀(ChemiDocXRS成像系統(tǒng))顯影，并分析灰度值用于蛋白表達的統(tǒng)計。實驗重復3次。

1.7統(tǒng)計學方法 應用 SPSS21.0 統(tǒng)計軟件進行單因素方差分析和LSD-t檢驗。

2 結(jié) 果

2.1刺囊酸對MCF-7細胞生長的影響 刺囊酸可顯著抑制MCF-7生長，呈劑量和時間依賴性，相同時間不同劑量或相同劑量不同時間差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，見表1。刺囊酸抑制MCF-7生長在24、48、72 h的IC50分別為96.316、73.355、52.370 μmol/L。

2.2刺囊酸對MCF-7細胞增殖的影響 EdU陽性細胞率反應細胞增殖能力，0 μmol/L組細胞EdU陽性細胞率為(33.83±1.43)%，25、50、100 μmol/L的刺囊酸組分別為(25.83±1.43)%、(17.31±2.02)%和(10.47±1.85)%，與0 μmol/L組比較差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，見圖1。

表1 不同濃度刺囊酸對MCF-7生長的抑制率比較

與0.0 μmol/L比較：1)P<0.05；與24 h比較：2)P<0.05

藍色：DAPI染核，綠色：增殖的EdU陽性細胞圖1 不同濃度刺囊酸對MCF-7細胞增殖的影響(×200)

2.3刺囊酸對MCF-7細胞凋亡的影響 0 μmol/L組凋亡率為(7.19±0.86)%，25、50、100 μmol/L的刺囊酸組凋亡率分別為(15.67±5.13)%、(29.00±4.10)%和(44.52±7.77)%，與0 μmol/L組比較差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。

2.4刺囊酸對MCF-7細胞凋亡相關(guān)蛋白的影響 隨刺囊酸劑量增加，Bax蛋白表達顯著增加(P<0.05)，而Bcl-2蛋白表達顯著降低(P<0.05)。Bax/Bcl-2比例顯著增加(P<0.05)。見圖2和表2。

圖2 刺囊酸對MCF-7細胞中Bax和Bcl-2蛋白表達的影響

劑量(μmol/L)BaxBcl-2Bax/Bcl-201.00±0.191.00±0.151.00±0.17251.41±0.211)0.82±0.141)1.72±0.161)501.86±0.131)2)0.62±0.101)2)3.00±0.121)2)1002.12±0.241)2)0.43±0.081)2)4.93±0.191)2)

與0 μmol/L組比較：1)P<0.05；與25 μmol/L組比較：2)P<0.05

3 討 論

研究者從植物、動物、微生物中分離并鑒定出一系列具有強生理活性的天然產(chǎn)物，其中很大部分具有優(yōu)良的抗癌活性〔6〕。從天然產(chǎn)物中篩選抗腫瘤藥物已經(jīng)成為治療癌癥的有效途徑，例如，臨床上應用廣泛的抗腫瘤藥物紫杉醇〔7〕和伊立替康(喜樹堿衍生物)〔8〕。此外，多種天然產(chǎn)物正在進行抗腫瘤臨床前研究。例如，葡萄中提取的多酚類化合物白藜蘆醇〔9〕、綠茶茶多酚的主要成分表沒食子兒茶素沒食子酸酯(EGCG)〔10〕等均表現(xiàn)出顯著的抗腫瘤活性，有望發(fā)展成新型的抗腫瘤藥物。

刺囊酸可通過破壞線粒體膜功能，促進細胞色素C釋放進入胞質(zhì)，從而誘導肝癌細胞HepG2凋亡〔3〕。刺囊酸促進人早幼粒白血病細胞HL-60的氧化應激產(chǎn)生大量的活性氧簇(ROS)，破壞線粒體膜功能，引起凋亡〔4〕。研究表明，刺囊酸對卵巢癌和子宮內(nèi)膜癌也具有顯著的抗癌作用，其可抑制SKOV3、A2780、OVCAR3 和HEC1A等細胞增殖〔5〕。本研究表明刺囊酸能抑制乳腺癌細胞的增殖，并促進其凋亡。

癌細胞的異常增殖和耐凋亡是腫瘤發(fā)生發(fā)展的重要病理過程。細胞凋亡受多種凋亡相關(guān)基因調(diào)控，其中Bcl-2基因家族是調(diào)控細胞凋亡的關(guān)鍵基因。促凋亡基因Bax和抗凋亡基因Bcl-2是Bcl-2基因家族中的重要成員〔11〕。癌細胞中Bcl-2表達較高，與Bax形成異源二聚體從而抑制凋亡，因此，癌細胞具有強力的耐凋亡能力。反之，當癌細胞受到抗癌藥物刺激時，Bax表達增高，形成同源二聚體促進凋亡〔12〕。本研究發(fā)現(xiàn)，不同濃度刺囊酸促進MCF-7細胞凋亡。