楊雨旸 常 青 高靜媛△ 張 放 梁芳倩 劉 靜

(華北理工大學(xué), 1 中醫(yī)學(xué)院, 2 附屬醫(yī)院老年病科, 唐山 063000； 3 甘肅省人民醫(yī)院, 蘭州 730000)

2型糖尿病(type 2 diabetes mellitus, T2DM)是一種受多基因影響的代謝性疾病,其患病率呈逐年上升趨勢[1],成為21 世紀(jì)威脅人類健康最重要的慢性非傳染性疾病之一[2]。在我國,東鄉(xiāng)族是甘肅省特有的少數(shù)民族,是糖尿病高發(fā)民族[3],且保持有純化程度比較高的遺傳特性[4]。視黃醇結(jié)合蛋白4(retibol-binding protein 4, RBP4)是糖尿病的獨(dú)立危險(xiǎn)因素,與胰島素抵抗及胰島素分泌密切相關(guān),其遺傳變異可能是評(píng)估2型糖尿病患病風(fēng)險(xiǎn)的重要因素。對(duì)于不同的種族,RBP4基因的遺傳易感性不同,因此本研究采用聚合酶鏈?zhǔn)?變性高效液相色譜(polymerase chain reaction-denaturing high performance liquid chromatography, PCR-DHPLC)和DNA測序技術(shù)相結(jié)合對(duì)甘肅省東鄉(xiāng)族人群2型糖尿病群體RBP4基因的rs17484721和rs36035572位點(diǎn)多態(tài)性進(jìn)行篩查和測序分析,探討RBP4基因多態(tài)性與東鄉(xiāng)族人群2型糖尿病的關(guān)系。

1 材料和方法

1.1 研究對(duì)象

隨機(jī)選取甘肅省臨夏自治州東鄉(xiāng)族2型糖尿病患者107例,其中男74例,女33例,平均年齡(53.65±9.73)歲及同期115例健康體檢人群,其中男80例,女35例,平均年齡(51.83±9.10)歲。分別設(shè)為Ⅱ型糖尿病組和對(duì)照組。彼此間無血緣關(guān)系。均排除吸煙嗜酒者；排除高血壓、冠心病以及肝、腎疾??；排除1型糖尿病、繼發(fā)性糖尿病等。2型糖尿病診斷按照2005年世界衛(wèi)生組織規(guī)定的診斷標(biāo)準(zhǔn),空腹血糖(fasting plasma glucose,FPG)≧7.0mmol/L和(或)口服葡萄糖耐量(OGTT) 2h血糖≧11.1mmol/L?；颊呔炇鹬橥?。

1.2 臨床數(shù)據(jù)及生化指標(biāo)檢測

按照統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn),采取面對(duì)面問卷調(diào)查詢問,測量受試者身高、體質(zhì)量(body mass index, BMI)、收縮壓(systolic blood pressure, SBP)、舒張壓(diastolic blood pressure, DBP)。抽取受試者清晨空腹靜脈血10ml,5ml EDTA抗凝用于DNA提取,其余5ml用于檢測空腹血糖(fasting plasma glucose, FPG)；空腹血漿胰島素(fasting plasma insulin, FPI)；胰島素抵抗指數(shù)(insulin resistance index, HOMA-IR)；血清總膽固醇(total cholesterol, TC)；血清甘油三酯(triglyceride, TG)；高密度脂蛋白膽固醇(high-density lipoprotein cholesterol, HDL-C)； 低密度脂蛋白膽固醇(low-density lipoprotein cholesterol, LDL-C)。

1.3 分子生物學(xué)檢測

1.3.1 基因組DNA提取 取靜脈血5ml與EDTA抗凝,SDS-蛋白酶K消化蛋白質(zhì)及肽類,用苯酚-氯仿法萃取法除蛋白,多糖,酚類等雜質(zhì),再加入乙醇沉淀即可使核酸分離,提取DNA后,溶于TE緩沖液,置-20℃冰箱保存以備用。

1.3.2 PCR擴(kuò)增 參照NCBI GenBank中nt_030059序列用Primer 5軟件設(shè)計(jì)RBP4基因第5內(nèi)含子區(qū)PCR擴(kuò)增特異性引物,正向引物5′-agggtgccttctggctc ttc-3′和反向引物5′-ctttactgggctgctcaatc-3′。PCR條件如下： 95℃預(yù)變性1分鐘,95℃ 30s下進(jìn)行30次變性,56℃退火30s,72℃處延長40s,72℃延長10min。然后以0.01℃/s的速度緩慢降至45℃,使之充分形成雜合雙鏈。產(chǎn)物經(jīng)1.5%的瓊脂糖凝膠電泳確認(rèn)后待檢測。

1.3.3 變性高效液相色譜分析 將產(chǎn)物置于WAVE的DNA片段分析系統(tǒng)(Transgenomic公司)的96孔板上,根據(jù)解鏈曲線,利用DHPLC檢測儀和WAVE-Maker 4.1軟件選出全部擴(kuò)增片段的最適檢測溫度(60.5℃)和分離梯度。取6μl PCR擴(kuò)增產(chǎn)物自動(dòng)上樣至DNA分離柱,用緩沖液A[pH7.0,0.1mmol/L三乙胺乙酸鹽(TEAA),0.1mmol/L EDTA]、緩沖液B(pH 7.0,0.1mmol/L TEAA中含25%的乙腈)以0.9ml/min 的流速進(jìn)行洗脫。被分離柱洗脫的異源雙鏈DNA溶液用吸收峰為OD 260nm波長紫外檢測儀檢測。

1.3.4 DNA測序 DHPLC檢測后再在色譜圖中顯示為峰的數(shù)目和寬度異常的PCR產(chǎn)物在自動(dòng)ABI 3730遺傳基因分析儀上進(jìn)行核苷酸序列測定(上海生工測序有限公司)。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 兩組人群一般情況比較

結(jié)果如表1所示,東鄉(xiāng)族受試者2型糖尿病組人群WHR、FPG、HOMA-IR、SBP較對(duì)照組高,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0．05)。

表1 東鄉(xiāng)族所有受試者的臨床數(shù)據(jù)特征比較

BMI： body mass index; WHR： waist hip ratio; FPG： fasting plasma glucose; FPI： fasting plasma insulin; HOMA-IR： insulin resistance index; SBP： systolic blood pressure; DBP： diastolic blood pressure;*P<0.05vscontrol group

2.2 PCR-DHPLC篩查

DHPLC法分析表明RBP4第5內(nèi)含子片段中存在兩個(gè)單核苷酸多態(tài)性(single nucleotide polymorphism, SNP)(rs17484721和rs36035572位點(diǎn)),且每個(gè)SNP有兩個(gè)等位基因(分別為rs17484721的T/C等位基因和rs36035572的 I/D等位基因)和3種基因型(rs17484721的TT、TC和CC基因型和 rs36035572的II 、ID和 DD基因型)。2個(gè)位點(diǎn)的突變存在強(qiáng)連鎖不平衡,并且兩者的等位基因頻率均小于5%。本實(shí)驗(yàn)得出3個(gè)色譜(圖1)： 147例野生型(圖1A),71例為雜合子突變(圖1C)和4例純合突變(圖1B)。DNA測序分析表明,這2個(gè)單核苷酸多態(tài)性的變化總是同時(shí)發(fā)生的,當(dāng)rs17484721是T等位基因時(shí),rs36035572會(huì)插入I突變基因；當(dāng)檢測rs17484721是C等位基因,在rs36035572會(huì)缺失D突變基因。DNA測序分析的結(jié)果如圖2所示。

圖1 DHPLC檢測RBP4基因PCR產(chǎn)物的色譜圖。A： 無突變患者色譜圖；B： 純合突變攜帶者色譜圖；C： 雜合突變攜帶者色譜圖.

圖2 DNA序列分析結(jié)果。左邊是rs17484721；右邊是rs36035572。這2個(gè)位點(diǎn)之間的距離68bp。I代表T變異；D表示因rs36035572變異所失去的T。A： 雜合子變異與T/C和I/D序列；B： 沒有任何突變的序列；C： 純合子變異C/C和D/D序列.

Fig 1 Chromaotgraphic WAVE pattern by DHPLC for the RBP4 PCR products. A： DHPLC chromatogram of the carriers without mutation; B： DHPLC chromatogram of the carriers with homozygous mutation; C： DHPLC chromatogram of the carriers with heterozygous mutation.

Fig 2 The result of DNA sequence analysis. On the left is rs17484721; on the right is rs36035572. The distance between the two SNPs is 68bp. I represented the inserted variation of T; D represents T at rs36035572 that was lost due to mutation. A： Heterozygous variant with T/C and I/D; B： Sequence without any mutation; C： Homozygous variant with C/C and D/D.

2.3 等位基因和基因型頻率的比較

測試所有受試者基因型的遺傳變異,基因型頻率分布符合哈迪-溫伯格遺傳平衡定律(Hardy-Weinberg quilibrium),即： 2型糖尿病PH-W=0.962；對(duì)照組PH-W=0.662。顯示T和I等位基因頻率為82.2%,C和D等位基因頻率為17.8%。觀察到的2個(gè)SNPs的基因型頻率的不偏離。2型糖尿病組的TT和Ⅱ 2個(gè)基因型的頻率較對(duì)照組顯著增高(P<0.05)；2型糖尿病組的等位基因T等位基因頻率較高,C等位基因和D等位基因較對(duì)照組降低(P<0.05)。基因型和等位基因頻率數(shù)據(jù)見表2。

*P<0.05vscontrol

2.4 單體型對(duì)照分析

由2個(gè)SNPs構(gòu)建的2型糖尿病患者中的單體型基因(T/T-I/I or C/C-D/D)與對(duì)照組相比,T/T-I/I單體型較高和C/C-D/D單體型顯著降低,即在2型糖尿病患者中,T、I等位基因頻率較高,C、D等位基因頻率降低,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。評(píng)估緊密連鎖不平衡(LD)區(qū)域,具有較強(qiáng)的成對(duì)連鎖不平衡(D>0.9,R2>0.9)(表3)。

*P<0.05vscontrol

2.5 基因型臨床特征分析

按單體型分組,本次實(shí)驗(yàn)檢測東鄉(xiāng)族所有受試者的臨床指標(biāo),顯示不同的基因型與血清甘油三酯(TG)之間存在關(guān)聯(lián)。在TG水平上,2型糖尿病組中TT+Ⅱ基因型顯著高于TC+CC和ID+DD基因型(P<0.05)；對(duì)照組中TT+Ⅱ基因型顯著高于TC+CC和ID+DD基因型,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)(表4)。

表4 東鄉(xiāng)族不同基因型的臨床指標(biāo)比較

BMI： body mass index; WHR： waist hip ratio; FPG： fasting plasma glucose; FPI： fasting plasma insulin; HOMA-IR： insulin resistance index; SBP： systolic blood pressure; DBP： diastolic blood pressure; TC： totalcholesterol; TG： triglyceride; HDL-C： high-density lipoprotein cholesterol; LDL-C： low-density lipoprotein cholesterol;*P<0.05vsTT/Ⅱ group

3 討論

目前,2型糖尿病受到越來越多的關(guān)注,它是一種多源性病因所引起的疾病,主要受遺傳因素、社會(huì)因素、生活方式及環(huán)境因素等綜合影響,而這些因素是2型糖尿病的高危發(fā)病因素[5]。本次研究對(duì)象選取基因純合性較高的東鄉(xiāng)族人群,由于東鄉(xiāng)族人群的飲食習(xí)慣主要是高糖高脂,多以從事體力勞動(dòng),對(duì)疾病認(rèn)知不足,地處偏遠(yuǎn)且經(jīng)濟(jì)文化落后,這可能是高發(fā)2型糖尿病的主要因素[6]。2型糖尿病其發(fā)病機(jī)制主要是胰島素抵抗。RBP4是近幾年研究比較熱門的易感基因,臨床研究表明升高血清中RBP4水平可增加代謝性疾病的發(fā)病率,包括肥胖、胰島素抵抗、心血管疾病、2型糖尿病[7-8]。且流行病學(xué)研究表明,人體循環(huán)中RBP4水平的升高會(huì)標(biāo)志著這些疾病的發(fā)生[9]。有動(dòng)物實(shí)驗(yàn)表明,升高小鼠RBP4基因的mRNA表達(dá)水平可發(fā)生胰島素抵抗,而降低RBP4基因mRNA表達(dá)水平則提高胰島素敏感性[10]。RBP4基因非編碼區(qū)SNP位點(diǎn)可能引起胰島素抵抗,并參與糖尿病的發(fā)生發(fā)展[11-12],其原因可能是RBP4通過阻斷抗原呈遞和T細(xì)胞活化從而誘導(dǎo)的胰島素抵抗[10-13]。本研究選取東鄉(xiāng)族人群作為研究對(duì)象,DHPLC法分析表明RBP4第5內(nèi)含子片段中存在兩個(gè)單核苷酸多態(tài)性(SNP)(rs17484721和rs36035572位點(diǎn)),且每個(gè)SNP有兩個(gè)等位基因(分別為rs17484721的T/C等位基因和rs36035572的 I/D等位基因)和3種基因型(rs17484721的TT、TC和CC基因型和 rs36035572的II 、ID和 DD基因型)。DNA測序分析表明,rs17484721和rs36035572處于連鎖不平衡(LD)區(qū)域,具有較強(qiáng)的成對(duì)連鎖不平衡。

測試所有受試者基因型的遺傳變異,其基因型頻率分析結(jié)果表明,相比其他位點(diǎn)的基因型,在2型糖尿病組中,rs17484721位點(diǎn)的TT基因型頻率明顯增高,rs36035572位點(diǎn)的Ⅱ基因型頻率也明顯增高,說明相對(duì)于攜帶其他基因型的人,攜帶有TT基因型和(或)Ⅱ基因型的人更易患2型糖尿病；且構(gòu)建的單體型模型表明,2型糖尿病組中的單體型基因中,T/T-I/I單體型較對(duì)照組顯著增高；C/C-D/D單體型較對(duì)照組顯著降低,即在2型糖尿病患者中T、I等位基因頻率較高,C、D等位基因頻率降低,說明單體型TT-II可能與2型糖尿病具有相關(guān)性,并且可能是2型糖尿病的易患多態(tài)位點(diǎn)。rs17484721和rs36035572位于RBP-4 基因密集LD 區(qū)域,此區(qū)域包括RBP4下游基因G 蛋白偶聯(lián)受體120基因(GPR120)的部分序列。GPR120基因在體內(nèi)分布廣泛[14],分別是通過激活GPR120偶聯(lián)G蛋白(Gq/11)或β-抑制蛋白這兩條途徑來促進(jìn)葡萄糖依賴的胰島素分泌、促進(jìn)GLP-1 釋放、抗炎等,目的是改善對(duì)2型糖尿病的體內(nèi)代謝狀態(tài)[15-16]。因此,可推測rs17484721位點(diǎn)的TT基因型頻率和rs36035572位點(diǎn)的Ⅱ基因型頻率的增高可能引起了GPR120在mRNA水平上的轉(zhuǎn)錄和蛋白水平上的翻譯,進(jìn)一步說明,基因型頻率的變異可能與2型糖尿病的發(fā)病率有相關(guān)性。

膜葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白一方面是胰島素敏感的靶組織的主要胞膜轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白,另一方面有助于細(xì)胞對(duì)葡萄糖的吸收[17]。它的缺陷是胰島素抵抗的一個(gè)早期特征[18]。研究表明[20]RBP 4血清水平的升高能夠通過抑制肌肉中的胰島素信號(hào)通路和增加肝糖輸出而增加胰島素抵抗,并且RBP4-GLUT4系統(tǒng)可改善2型糖尿病癥狀。有研究采用logistic回歸和Cox回歸分析確定視黃醇暴露水平對(duì)2型糖尿病風(fēng)險(xiǎn)的影響[20-21]。說明RBP4-GLUT4系統(tǒng)與2型糖尿病存在一定的關(guān)聯(lián)性。

本研究分析了脂代謝紊亂與2型糖尿病的基因易感性之間的關(guān)系,顯示在TG水平上,2型糖尿病組和對(duì)照組中TT+II基因型顯著高于TC+CC和ID+DD基因型,因此表明,TG水平的高低與東鄉(xiāng)族2型糖尿病的rs17484721和rs36035572多態(tài)性具有相關(guān)性。本研究還顯示兩組TT-II基因型的HOMA-IR水平差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,因此可以增大樣本量,減小誤差,進(jìn)行深層次的研究和證實(shí)。

總之, RBP4基因變異可能與東鄉(xiāng)族人2型糖尿病和血清甘油三酯水平有關(guān)。rs17484721和rs36035572基因多態(tài)性參與東鄉(xiāng)族2型糖尿病的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn),它們的變化與東鄉(xiāng)族人群血清甘油三酯水平相關(guān)。本次研究由于東鄉(xiāng)族總?cè)丝跀?shù)較少,樣本量相對(duì)較少,及因2型糖尿病是多基因遺傳性疾病,而且每個(gè)易感基因功能不同且作用微效,因此應(yīng)該進(jìn)行多基因綜合檢測,以后應(yīng)在這兩方面進(jìn)行深入研究。