李鵬程,鄭根建,云 蔓,何 龍

(海南醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院口腔科，?？?570102)

口腔黏膜下纖維性變又稱(chēng)口腔黏膜下纖維化(oral submucous fibrosis，OSF),是一種慢性、隱匿性、具有癌變傾向的口腔黏膜疾病[1]。OSF主要病理特征包括早期黏膜固有層及黏膜下層膠原纖維堆積，隨后形成致密的膠原纖維束，晚期伴不同程度的玻璃樣變及上皮組織萎縮。OSF的具體發(fā)病機(jī)制并不明確，但咀嚼檳榔導(dǎo)致成纖維細(xì)胞纖維化、自身免疫反應(yīng)等因素是目前國(guó)內(nèi)外公認(rèn)的致病因素之一。OSF最大的危害在于具有癌變傾向，WHO已將OSF定義為癌前病變[1-4]。

1 資料與方法

1.1一般資料 根據(jù)pindborg病理學(xué)標(biāo)準(zhǔn)收集海南醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院2016年1月至2017年12月就診且確診的35例OSF患者，由3名病理科醫(yī)師光鏡下對(duì)病例進(jìn)行分期，其中早期9例、中期14例、晚期12例。同時(shí)選擇正?？谇火つそM織35例，組織樣本采集均經(jīng)過(guò)海南醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院倫理學(xué)委員會(huì)批準(zhǔn)，患者均簽署知情同意書(shū)?；颊咝詣e、年齡見(jiàn)表1。各期診斷標(biāo)準(zhǔn)，OSF早期：口腔黏膜有燒灼感，進(jìn)食時(shí)有刺激痛，檢查見(jiàn)局灶性或散在性口腔黏膜灰白色改變，質(zhì)地?zé)o改變或粗糙，開(kāi)口度大于或等于30 mm;OSF中期：進(jìn)刺激性食物時(shí)口腔黏膜疼痛，黏膜顏色呈片狀灰白色改變，質(zhì)地變硬，翼下頜韌帶及軟腭捫及纖維條索，張口度為20～30 mm;OSF晚期：進(jìn)刺激性食物時(shí)口腔黏膜疼痛，黏膜顏色呈灰白色改變，質(zhì)地變硬，捫診呈板狀或皮革樣，舌運(yùn)動(dòng)受限，伸舌困難，病變侵及口咽及咽喉部，張口度小于20 mm。

1.2試劑 OSF臨床標(biāo)本均由海南醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院口腔科提供，胎牛血清購(gòu)自美國(guó)PAA公司，Trizol購(gòu)自美國(guó)Invitrogen公司，RNA提取試劑盒、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、 熒光定量PCR試劑盒均購(gòu)自日本Takara公司，IL-6、STAT3、p-STAT3兔單克隆抗體均購(gòu)自美國(guó)Abcam公司，寡核苷酸鏈由生工生物工程(上海)股份有限公司合成，所用的寡核苷酸序列見(jiàn)表2。

表1 患者性別、年齡及分期

表2 引物序列

1.3方法

1.3.1免疫組織化學(xué) 將兩張OSF切片常規(guī)脫蠟至水，常溫下滴加3%過(guò)氧化氫甲醇溶液于標(biāo)本切片上孵育10 min，消除內(nèi)源性過(guò)氧化物酶的活性，PBS液在搖床上洗3次，每次2 min；將兩張切片置于盛有枸櫞酸溶液的高壓鍋內(nèi)加熱，待高壓鍋排氣管排氣后調(diào)低火，繼續(xù)加熱2 min，自然冷卻至室溫，PBS液在搖床上洗3次，每次2 min；5%BSA封閉液室溫孵育30 min，以減少一抗非特異性結(jié)合；分別加入兔來(lái)源的IL-6、STAT3一抗(1∶200)，4 ℃過(guò)夜，PBS液搖床上洗3次，每次2 min；標(biāo)本切片上滴入生物素化山羊抗兔二 抗，37 ℃恒溫箱內(nèi)孵育30 min，PBS液搖床上洗3次，每次2 min；加入鏈酶親和素-生物素-過(guò)氧化物酶復(fù)合物室溫下孵育20 min，PBS洗3次，每次3 min；DAB顯色2～3 min，自來(lái)水沖洗，蘇木素復(fù)染標(biāo)本切片6 s；切片經(jīng)梯度乙醇脫水干燥，并經(jīng)二甲苯透明后中性樹(shù)膠封固。棕褐色反應(yīng)物顆粒狀或彌散性分布在細(xì)胞核為IL-6、STAT3、P-STAT3陽(yáng)性表達(dá)。

1.3.2RT-PCR測(cè)定 因患者病理分期數(shù)目不同，無(wú)法取統(tǒng)一整數(shù)比較，故取正常組織9例及早、中、晚期OSF 組織各9例(共27例)，用Trizol一步法提取組織中的總RNA，Qubit Fluorometer檢測(cè)RNA水平及純度，按反轉(zhuǎn)錄試劑盒說(shuō)明將總RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA,用RT-PCR檢測(cè)相關(guān)基因。

1.3.3Western blot 取正常組織4例及早、中、晚期OSF 組織各4例(共12例)，RIPA裂解液裂解混勻，4 ℃ 16 000 r/min離心20 min，吸取上清液棄沉淀，考馬斯亮藍(lán)法檢測(cè)組織樣本蛋白濃度，樣本凝膠電泳后浸泡于轉(zhuǎn)移緩沖液中15 min，裝配轉(zhuǎn)移“三明治”120 V，35～55 min，用TBS漂洗膜10～15 min，置于封閉液中室溫?fù)u動(dòng)2 h，4 ℃過(guò)夜，之后常規(guī)加入IL-6、STAT3、P-STAT3一抗室溫孵育2 h，與之相應(yīng)的兔抗人二抗室溫孵育1 h。采用Quantity One v4.62軟件分析條帶灰度值，并做統(tǒng)計(jì)分析。

2 結(jié) 果

2.1免疫組化 OSF患者免疫組化染色切片顯示，OSF組織內(nèi)可見(jiàn)呈棕褐色的STAT3、IL-6、P-STAT3陽(yáng)性細(xì)胞(圖1)。

2.2RT-PCR IL-6及P-STAT3在各期OSF組織中的mRNA表達(dá)量OSF晚期最高(P<0.05)；STAT3在對(duì)照組及各期OSF組織中的表達(dá)量，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見(jiàn)圖2。

2.3Western blot IL-6及P-STAT3在各期OSF組織中的蛋白表達(dá)灰度值較對(duì)照組織顯著升高，STAT3在各期OSF組織中的蛋白灰度值較對(duì)照組無(wú)明顯變化，見(jiàn)圖3。

A：OSF STAT3陽(yáng)性細(xì)胞(棕褐色)；B:OSF IL-6陽(yáng)性細(xì)胞(棕褐色)；C:OSF P-STA3陽(yáng)性細(xì)胞(棕褐色)；D:陰性細(xì)胞

圖1 OSF結(jié)締組織免疫組化染色切片

a：P<0.05

圖2 STAT3、IL-6、P-STAT3 mRNA表達(dá)差異分析

圖3 STAT3、IL-6、P-STAT3蛋白表達(dá)情況

3 討 論

口腔黏膜下纖維性變主要的臨床癥狀有口腔黏膜蒼白、僵硬，張口受限，不能進(jìn)食熱、辣食物等，突出的病理特征是口腔黏膜固有層大量膠原堆積。上皮下膠原的過(guò)度累積和玻璃樣變是OSF患者口腔黏膜發(fā)生不可逆改變并致張口困難的重要原因和重要特征之一，其本質(zhì)是成纖維細(xì)胞和肌纖維母細(xì)胞等產(chǎn)生膠原蛋白等過(guò)多沉積于黏膜上皮下所致，如何防止這一過(guò)程的發(fā)生和發(fā)展仍是當(dāng)今OSF治療的重大挑戰(zhàn)[5]。但是黏膜下纖維化是一個(gè)極其復(fù)雜的病理生理過(guò)程，迄今為止關(guān)于OSF上皮損傷、膠原的過(guò)度沉積和血管病變形成和發(fā)展機(jī)制尚不明確，導(dǎo)致沒(méi)有直接針對(duì)OSF有效的治療方法。因此探索其形成機(jī)制和阻斷辦法具有重要的理論和實(shí)際意義。由于OSF發(fā)生、發(fā)展的機(jī)制尚不明確,使得OSF在過(guò)去30年中嘗試的大多數(shù)化學(xué)預(yù)防性或其他系統(tǒng)性醫(yī)療方法仍然是不佳的。OSF當(dāng)前的治療方法可分為3種：物理治療、手術(shù)治療和藥物治療，但是治療效果都無(wú)法令人滿意。單純的營(yíng)養(yǎng)補(bǔ)充或行為干預(yù)，對(duì)纖維化程度沒(méi)有任何改善[6-9]。

白細(xì)胞介素-6(interleukin-6，IL-6)是一種主要由單核巨噬細(xì)胞、靜止的T細(xì)胞、B細(xì)胞等產(chǎn)生的具有多種生物功能、廣泛免疫調(diào)節(jié)功能的細(xì)胞因子[10-11]，它在許多疾病中都被檢測(cè)到表達(dá)升高，如：類(lèi)風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎、銀屑病、自身免疫性疾病等[12-13]。IL-6作為一種細(xì)胞趨化因子，其中主要參與機(jī)體的纖維化形成和炎性反應(yīng)，其抑制細(xì)胞外基質(zhì)分解，使膠原蛋白聚集增加，促進(jìn)成纖維細(xì)胞增殖，從而使組織纖維化。

STAT3屬于STAT家族(signal transducer and activator of transcription factors)重要成員之一，即信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)及轉(zhuǎn)錄活化因子3，STAT3功能結(jié)構(gòu)域主要包括：N-末端結(jié)構(gòu)域、螺旋-螺旋結(jié)構(gòu)域、DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域、連接子結(jié)構(gòu)域、SH2結(jié)構(gòu)域及C-末端的激活區(qū)[14]。SH2結(jié)構(gòu)域是STAT3最保守和功能最重要的部分，主要介導(dǎo)STAT3與其他磷酸化酪氨酸蛋白的耦聯(lián)，形成STAT3二聚體，從而激活該通路[15]。細(xì)胞因子如IL-17與跨膜受體結(jié)后，激活受體耦聯(lián)的JAK，在STAT3與磷酸化的受體結(jié)合后，誘發(fā)STAT3的C-末端Tyr-705磷酸化[16]。磷酸化的STAT3從受體上解離，并通過(guò)SH2結(jié)構(gòu)域相互作用，形成P-STAT3二聚體，P-STAT3二聚體與PIAS結(jié)合阻斷P-STAT3二聚體與DNA結(jié)合部位，進(jìn)而負(fù)反饋調(diào)控STAT磷酸化作用[17]。近年來(lái)有研究報(bào)道，磷酸化的STAT3(p-STAT3)的異常表達(dá)在銀屑病發(fā)生中起重要作用，并認(rèn)為與黏膜或皮膚的纖維化等行為相關(guān)。

本研究通過(guò)免疫組化、RT-PCR、Western blot對(duì)正?？谇火つそM織及各期OSF組織中的IL-6、STAT3、P-STAT3進(jìn)行檢測(cè)，免疫組化實(shí)驗(yàn)表明在口腔黏膜發(fā)生纖維性變的結(jié)締組織內(nèi)IL-6、STAT3呈陽(yáng)性表達(dá)，RT-PCR及Western blot實(shí)驗(yàn)表明，IL-6、P-STAT3在OSF組織中早期、中期表達(dá)較正常黏膜組織無(wú)顯著升高，晚期較正常黏膜組織表達(dá)顯著升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，STAT3在各期OSF組織中表達(dá)較正常組織無(wú)顯著升高，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

綜上所述，在OSF組織中，IL-6的表達(dá)隨著病變從早期向晚期的發(fā)展呈顯著性升高，然后誘導(dǎo)下游信號(hào)通路分子STAT3的磷酸化，即P-STAT3表達(dá)增加，由此說(shuō)明，IL-6可以通過(guò)激活信號(hào)通路STAT3的磷酸化同時(shí)促進(jìn)口腔黏膜組織纖維化由早期向晚期的轉(zhuǎn)變，該結(jié)果表明，IL-6和P-STAT3在OSF發(fā)生、發(fā)展過(guò)程中可能起到促進(jìn)的作用，這為臨床治療OSF提供了新的關(guān)鍵靶點(diǎn)。