1.重慶醫(yī)科大學(xué)附屬兒童醫(yī)院，重慶 400014；2.重慶市中藥研究院，重慶 400065

西藏棱子芹為常用藏藥，習(xí)稱藏當(dāng)歸，為傘形科(Umbelliferae) 棱子芹屬(PleurospermumHoffm．) 植物，藥用部位為根和根莖，有清熱解毒的功效，用于治療月經(jīng)不調(diào)、消化不良等證[1]。收載于《中國(guó)藏藥》[2]，在《西藏自治區(qū)藏藥材標(biāo)準(zhǔn)》[3]第一冊(cè)中只有薄層色譜定性鑒別，沒(méi)有含量測(cè)定。本實(shí)驗(yàn)選用高效液相色譜法為西藏棱子芹中有效成分阿魏酸的含量測(cè)定建立了一種分離效率高、穩(wěn)定性好、分析速度快的方法，為控制西藏棱子芹的質(zhì)量提供了可靠的方法。經(jīng)方法學(xué)考察，符合含量測(cè)定要求。

1 儀器與材料

1.1 儀器 Waters e2965型 HPLC(美國(guó)沃特斯儀器有限公司)；KQ-3200B 型超聲波清洗儀(鞏義市予華儀器有限責(zé)任公司)。

1.2 材料 阿魏酸對(duì)照品(批號(hào)：110773-201614，中國(guó)食品藥品檢定研究院)；西藏棱子芹藥材(批號(hào)：1703001、1704002、1709003，西藏甘露制藥有限公司)經(jīng)重慶市中藥研究院生藥室副主任藥師舒抒鑒定為真品；色譜純的甲醇，Ⅰ級(jí)水，分析純?cè)噭?/p>

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件及系統(tǒng)適用性試驗(yàn) 色譜條件：Waters C18(150 mm×4.6 mm, 5 μm)色譜柱；甲醇-1%冰乙酸(40∶60)為流動(dòng)相；25℃柱溫；318 nm檢測(cè)波長(zhǎng)[4]；1 mL/min流速；10 μL進(jìn)樣量。在此色譜條件下，阿魏酸與樣品中其它組分分離良好，理論塔板數(shù)按阿魏酸色譜峰計(jì)大于4 000。HPLC色譜圖如圖1所示。

2.2 對(duì)照品溶液的制備 取阿魏酸對(duì)照品，精密稱取0.012 06 g于50 mL容量瓶中，加甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，即得阿魏酸對(duì)照品貯備液。將阿魏酸對(duì)照品貯備液稀釋10倍，即得阿魏酸對(duì)照品溶液的濃度為24.12 μg/mL。

2.3 樣品溶液的制備 取西藏棱子芹藥材，粉碎，過(guò)四號(hào)篩，取約2 g，精密稱定，置于100 mL容量瓶中，加水適量，超聲處理30 min，取出，放置過(guò)夜，用水定容至刻度，混勻，過(guò)濾，精密量取續(xù)濾液25 mL于分液漏斗中，加稀鹽酸調(diào)節(jié)pH值至2，加乙醚20 mL，提取4次，合并乙醚液，揮干，殘?jiān)蛹状既芙獠⒍ㄈ葜? mL，即得樣品溶液。

2.4 線性關(guān)系考察 取阿魏酸對(duì)照品溶液(24.12 μg/mL)，分別進(jìn)樣2、4、6、8、10、12 μL各2次，在上述色譜條件下測(cè)定峰面積。以進(jìn)樣量為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，線性方程為Y=5 372 670.30X-56 939.91(r=0.999 9)。結(jié)果：阿魏酸進(jìn)樣量與峰面積呈良好線性關(guān)系的范圍為0.048 24～0.289 4 μg。

2.5 精密度考察 取阿魏酸對(duì)照品溶液，進(jìn)樣量：10 μL；進(jìn)樣次數(shù)：6次，計(jì)算阿魏酸的平均峰面積，其RSD值為0.47%(n=6)，結(jié)果儀器精密度良好。

2.6 穩(wěn)定性考察 取同一樣品(批號(hào)201709003)，按樣品溶液制備方法制備，照上述色譜條件，精密吸取10 μL注入液相色譜儀，每隔2 h 進(jìn)樣1次，測(cè)定供試液12 h 的穩(wěn)定性。其RSD值為0.52%。

2.7 重復(fù)性考察 取同一樣品(批號(hào)201709003)6份，按樣品溶液制備方方法制備,分別精密吸取10 μL，連續(xù)進(jìn)樣6次，測(cè)得RSD值為0.43%。

2.8 加樣回收率考察 取樣品(批號(hào)1709003，阿魏酸含量為0.121 0 mg/g)約1 g，精密稱定，共9份，分別精密加入阿魏酸對(duì)照品溶液(0.241 2 mg/mL)0.4、0.5、0.6 mL各3份，按供試品溶液制備方法制成供試品溶液，按上述色譜條件測(cè)定峰面積，對(duì)加樣回收率進(jìn)行計(jì)算，平均回收率為98.06 %，其RSD值為1.25%(n=9)。見(jiàn)表1。

表1 阿魏酸加樣回收率的考察

2.7 藥材含量測(cè)定 取不同批號(hào)的西藏棱子芹藥材約1.0 g，取西藏棱子芹藥材粉(過(guò)四號(hào)篩)約1.0 g，精密稱定，按樣品溶液制備方法制得樣品溶液，再按上述色譜條件測(cè)定峰面積，按外標(biāo)法計(jì)算阿魏酸的含量。樣品(批號(hào)：1703001、1704002、1709003) 中阿魏酸含量分別為0.179 5、0.168 3、0.121 0 mg/g。與文獻(xiàn)報(bào)道[5]基本一致。

3 討論

3.1 提取溶劑的選擇 阿魏酸溶于水、乙醇和乙酸乙酯，本試驗(yàn)將上述3種溶劑作為提取溶劑，同等溶劑用量，超聲提取。結(jié)果水的提取效果好，故提取溶劑選用水。

3.2 提取方法的選擇 對(duì)樣品進(jìn)行了加水超聲提取和水浴加熱回流提取考察，結(jié)果水浴加熱回流提取與超聲提取差別不大，但超聲提取簡(jiǎn)便，故提取方法選用超聲提取。

3.3 流動(dòng)相的選擇 本試驗(yàn)分別采用了甲醇-0.1%磷酸(50∶50)、甲醇-乙腈-1%冰乙酸(30∶20∶50)、甲醇-水(65∶35)、甲醇-1%冰乙酸(40∶60)和乙腈-水(42∶58)為流動(dòng)相，結(jié)果表明樣品中阿魏酸以甲醇-1%冰乙酸(40∶60)為流動(dòng)相時(shí)分離度能達(dá)到要求。

3.4 檢測(cè)波長(zhǎng)的確定 阿魏酸的對(duì)照品溶液在波長(zhǎng)200～600 nm進(jìn)行紫外掃描，結(jié)果阿魏酸在318 nm處有最大吸收，故檢測(cè)波長(zhǎng)確定為318 nm。

西藏棱子芹主要含阿魏酸、甘草查爾酮甲、川陳皮素、異甘草素等化學(xué)成分，試驗(yàn)采用HPLC法測(cè)定阿魏酸含量，方法準(zhǔn)確、簡(jiǎn)便，重現(xiàn)性好，可作為西藏棱子芹藥材質(zhì)量控制的有效方法。