河南省開封市兒童醫(yī)院（475000）郭春娜

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 標(biāo)本來源與分期 收集2016年3月～2018年5月在我院接受治療的26例嬰兒血管瘤患者的血管瘤切片標(biāo)本，所有標(biāo)本都是在單純的手術(shù)切除過程中獲得，患者未經(jīng)過其他方法治療，且經(jīng)過免疫組織化學(xué)染色及光鏡證實?；颊吣挲g為3個月～10歲，處于增生早期的患者有2例，處于增生中期的患者有4例，處于增生晚期的患者有9例，處于消退早期的患者有6例，處于消退中期的患者有3例，處于消退晚期的患者有2例。

1.1.2 HE染色材料 二甲苯、石蠟、甲醛溶液（10%）、鹽酸乙醇、酒精、伊紅、蘇木精、樹脂。

1.1.3 透射電鏡觀察材料 鋨酸（1%）、戊二醇、丙酮、環(huán)氧樹脂、枸櫞酸鉛染液、氫氧化鈉丸、飽和醋酸鈾溶液。

1.1.4 電泳材料 TE緩沖液、溴化乙錠、ACD抗凝劑、DNA提取液、電泳級瓊脂糖、蛋白酶、二甲苯、無水乙醇。

1.2 方法

1.2.1 HE染色方法 對所有標(biāo)本進(jìn)行切片（切片厚度4μm），使用二甲苯脫蠟10min，使用無水酒精洗去標(biāo)本上的二甲苯（清洗1min，清洗2次），用清水洗去酒精，使用蘇木精給標(biāo)本染色并用清水洗去多余的蘇木精，使用鹽酸乙醇對標(biāo)本進(jìn)行分化（20s）并用清水洗去殘留的鹽酸乙醇，使用伊紅進(jìn)行染色[1]。

1.2.2 透射電鏡觀察方法 將活體組織修成1×1×2mm的長條形，使用戊二醇—鋨酸雙重固定法對長條形標(biāo)本進(jìn)行固定，并用緩沖液進(jìn)行漂洗，漂洗時間為20min，漂洗完成后使用不同濃度的丙酮溶液進(jìn)行梯度脫水[2]。使用多孔橡膠包埋模板對組織塊進(jìn)行包埋，并置于烘箱中烘烤，形成包埋塊。對包埋塊進(jìn)行處理漏出組織來，以組織為中心進(jìn)行包埋塊清理，形成一個錐形。對組織進(jìn)行切片并放到載玻片上同時使用甲苯胺藍(lán)進(jìn)行染色，使用枸櫞酸鉛溶液對切片進(jìn)行染色，放置到電鏡下進(jìn)行觀察。

1.2.3 瓊脂糖凝膠電泳 瓊脂糖凝膠電泳使用的標(biāo)本為消退早期和增殖晚期的標(biāo)本，將新鮮組織放入液氮中凍結(jié)將其砸碎并研成粉末，將粉末倒入含有DNA提取液的離心管中，放入水浴中溫育1小時。加入蛋白酶裂解細(xì)胞消化蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)。加入飽和酚溶液使試管中的組織離心15min，加入醋酸鈉與無水乙醇沉淀DNA，用玻璃棒將DNA轉(zhuǎn)移到零一支試管中，在試管中加入乙醇洗滌DNA[3]。使用紫外分光光度計測量DNA純度，記錄DNA純度并將其放入瓊脂糖凝膠電泳液中，接入電源電泳2h，在UV燈下觀察DNA條帶遷移位置。

1.3 觀察 觀察切片的各個位置的形態(tài)特征，拍照記錄下有代表性的切片，定性觀察HE染色、瓊脂糖凝膠電泳及透鏡電鏡觀察的結(jié)果。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法 采取SPSS20.0統(tǒng)計學(xué)軟件對本文數(shù)據(jù)進(jìn)行分析處理，計數(shù)資料用n、%表示，組間比較采用t、X2檢驗，當(dāng)差異具有統(tǒng)計學(xué)意義時，P＜0.05。

2 結(jié)果

2.1 血管瘤病理演變過程

2.1.1 增生早期 增生早期的血管瘤細(xì)胞是一些堆積在一起的細(xì)胞團(tuán)，細(xì)胞團(tuán)沒有特定的形狀，呈星形擴(kuò)散生長，細(xì)胞排列較為緊密，多數(shù)生長于真皮層，少數(shù)生長于皮下組織中。細(xì)胞之間排列混亂，細(xì)胞核較大。瘤細(xì)胞中可見微血管的細(xì)胞群，這些血管直徑大約為10μm。

2.1.2 增生中期 細(xì)胞團(tuán)變大，細(xì)胞團(tuán)之間有清晰的界限，細(xì)胞排列緊密，可看到核分裂現(xiàn)象。細(xì)胞團(tuán)中具有直徑大小不一的微血管，且相較于增生早期數(shù)量明顯增多。微血管管腔中可見紅細(xì)胞，大多微血管直徑較小。

2.1.3 增生晚期 細(xì)胞團(tuán)生長速度變慢，細(xì)胞排列較為疏松，細(xì)胞團(tuán)之間不再有清晰的界限，出現(xiàn)大量免疫細(xì)胞及凋亡的細(xì)胞，可見到細(xì)胞凋亡后出現(xiàn)的凋亡小體及碎裂的細(xì)胞核。

2.1.4 消退早期 當(dāng)患者1歲時，血管瘤的生長進(jìn)入衰退期，細(xì)胞團(tuán)之間出現(xiàn)較多組織，細(xì)胞團(tuán)之間沒有清晰的界限與脂肪組織交錯在一起，細(xì)胞內(nèi)部結(jié)構(gòu)松散。免疫細(xì)胞數(shù)量較多，微血管形態(tài)更加明顯，形成了微血管團(tuán)，這些血管團(tuán)圍繞著周細(xì)胞，被EC包裹著。血管瘤組織中細(xì)胞消退的階段不同，一些存在于皮下組織的細(xì)胞處于細(xì)胞團(tuán)階段，真皮乳頭層的細(xì)胞則分化為微血管。

2.1.5 消退中期 患者在3～5歲時，多數(shù)血管瘤細(xì)胞消退完成，處于消退中期。細(xì)胞團(tuán)形態(tài)模糊，被微血管取代，微血管管徑變大，數(shù)量減少，血管管壁依舊不完整，微血管之間被纖維脂肪組織填充。間質(zhì)中免疫細(xì)胞數(shù)量減少，纖維細(xì)胞數(shù)量增多。

2.1.6 消退完成期 患者5歲之后，血管瘤細(xì)胞基本消退完成，細(xì)胞團(tuán)消失，細(xì)胞團(tuán)的位置被小葉狀纖維脂肪組織填充，存在少數(shù)微血管和小靜脈。殘存的血管瘤細(xì)胞內(nèi)色素沉積，毛細(xì)血管在真皮內(nèi)擴(kuò)張。

2.2 血管瘤組織的凋亡現(xiàn)象觀察

2.2.1 HE染色 細(xì)胞大多在7～12個月后開始凋亡，1～6個月內(nèi)凋亡的數(shù)量很少。凋亡的內(nèi)皮細(xì)胞多呈散在分部，少數(shù)為小叢狀分布。凋亡細(xì)胞的細(xì)胞核碎裂，染色體致密，與中性細(xì)胞和淋巴細(xì)胞的形態(tài)比較接近。進(jìn)入消退期后，細(xì)胞開始凋亡，數(shù)量減少，至消退完成期血管里細(xì)胞基本消失。

2.2.2 透射電鏡觀察 凋亡早期部分細(xì)胞內(nèi)線粒體增殖，線粒體內(nèi)部空泡化。凋亡細(xì)胞周圍有環(huán)形帶出現(xiàn)，與周圍組織和細(xì)胞脫離。細(xì)胞核染色質(zhì)電子密度很高，向核膜下聚集。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)面積擴(kuò)大，轉(zhuǎn)變?yōu)樽允审w的包裹膜。到了凋亡晚期，凋亡細(xì)胞形成球形突起，球形突起脫落形成含有核碎片、細(xì)胞質(zhì)與細(xì)胞器的凋亡小體。

2.2.3 瓊脂糖凝膠電泳 處于增殖晚期的血管瘤細(xì)胞組織的瓊脂糖凝膠電泳的形態(tài)特征為梯狀條帶，條帶模糊，由DNA基因組斷裂形成的不同大小的片段組成。電泳圖中還可觀察到DNA鏈，說明血管里細(xì)胞中染色體中的DNA發(fā)生了降解。

3 討論

嬰兒性血管瘤是一種先天性疾病，可在出生或出生幾周后發(fā)病，女性多于男性，發(fā)病率為1.1～2.6%，是一種良性腫瘤，多發(fā)于面部、頭部、頸部[4]。血管瘤呈現(xiàn)為鮮紅色斑塊狀，會被誤認(rèn)為是胎記。血管瘤的生長過程可分為：增殖期、消退期和消退完成期。增殖期血管瘤瘤體生長迅速，會高出正常皮膚形成凸起，瘤體表面溫度高，有較強(qiáng)的張力。在患病前6個月，瘤體急速擴(kuò)張，常會引起患兒家屬恐慌。6個月后，瘤體生長變慢，表皮顏色由鮮紅色變成暗紅色?；純?歲時，瘤體生長停止，表皮顏色呈暗紫色。隨著時間推移，瘤體會變小，從中心部位開始消退，恢復(fù)正常膚色，多數(shù)血管瘤能在9歲前自行消退，但會留下色素沉著及毛細(xì)血管擴(kuò)張等遺留癥狀。臨床上尚無有效治療血管瘤的辦法，其醒目的外觀會對兒童的心理健康造成不利影響，使患兒因為外形異樣而被群體排斥，導(dǎo)致其內(nèi)向、孤僻。因此，研究血管瘤的病理特征尋找治療辦法具有重要意義。

實驗中透鏡結(jié)果顯示，血管瘤細(xì)胞在1～6個月之內(nèi)細(xì)胞團(tuán)內(nèi)存在大量微血管，這是導(dǎo)致患兒血管瘤呈鮮紅色、表皮溫度較高的原因。7～12個月瘤體細(xì)胞開始凋亡，因此血管瘤生長變慢。由于微血管擴(kuò)張，能容納的靜脈血增多導(dǎo)致瘤體表面顏色變暗?；純?～3歲時，血管瘤細(xì)胞增殖停滯，微血管團(tuán)取代瘤細(xì)胞團(tuán)，瘤體細(xì)胞變小。到了消退期，微血管被纖維脂肪取代，所有之前的瘤體部位皮膚顏色開始恢復(fù)正常。