丁超，單建芝，呂婭，曾云

(1昆明醫(yī)科大學第一附屬醫(yī)院，昆明 650032;2云南省血液病研究中心)

急性淋巴細胞白血病(ALL)是一種起源于單個B或T淋巴細胞前體細胞的惡性腫瘤，可分為急性B淋巴細胞白血病(B-ALL)和急性T淋巴細胞白血病(T-ALL)。ALL的病因不明，可能與離子輻射、先天易感性、化學物質、污染、病毒感染等因素有關。ALL總發(fā)病率約為1.0～1.5/10萬，4～5歲、50～60歲兩個年齡段高發(fā)峰。ALL是最常見的兒童急性白血病，其發(fā)病率逐占15歲以下兒童急性白血病的76%；而成人急性白血病中ALL僅占20%?；煛⒓爸С种委熓茿LL的主要治療方法，多數(shù)患者誘導化療后可達到形態(tài)學緩解(光學顯微鏡下骨髓原始細胞<5%，造血功能恢復[1])甚至治愈；兒童ALL患者治愈率達到75%～80%；，僅30%～40%的成年ALL患者可長期生存。即使達到形態(tài)學緩解，ALL患者體內仍有106～108個白血病細胞，即微小殘留病(MRD)[2]。MRD是指白血病患者經(jīng)誘導化療完全緩解后(或骨髓移植后)，在患者體內殘存有形態(tài)學上不能檢測到微量白血病細胞的狀態(tài)。檢測ALL患者MRD對改善患者長期生存率具有重要意義?，F(xiàn)將ALL患者MRD檢測的常用方法[3]、標本選擇及其臨床意義研究進展綜述如下。

1 ALL患者MRD檢測方法

1.1 多參數(shù)流式細胞儀(FCM) FCM由液流系統(tǒng)、光學系統(tǒng)及電子系統(tǒng)三部分組成，通過在液流系統(tǒng)中快速測定單個細胞的電阻、光散射和光吸收等性質來定量測算細胞直徑、細胞膜受體和表面抗原等，快速測量對細胞或亞細胞結構。主要特點有：①測量速度快,1秒內可檢測數(shù)萬個細胞；②多參數(shù)測量,可對同一個細胞進行物理、化學特性的多參數(shù)測量，所得結果可用于統(tǒng)計學分析；③綜合性高,FCM綜合了激光技術、計算機技術、流體力學、細胞化學、圖像技術等多領域知識和成果；④識別白血病相關免疫表型(LAIPs), LAIPs存在于白血病細胞表面，包括抗原非同步表達、跨系列表達、過度表達/表達缺失；在正常骨髓細胞上不表達或低頻率表達[4]，從而與正常細胞區(qū)分。FCM識別LAIPs的靈敏度可達0.01%～0.001%，超過90%的ALL患者可采用FCM測定MRD[5]。藥物治療及白血病細胞的異質性可導致LAIPs并發(fā)生免疫表型改變，即抗原漂移[6]，此時初診時建立的模板無法準確判斷MRD，導致結果出現(xiàn)假陰性。糖皮質激素可導致B-ALL患者血清CD10、CD34表達下降[7]。different from normal是利用FCM檢測MRD的另一種方法，是指利用已經(jīng)確定的健康人骨髓細胞的免疫表型譜檢測并區(qū)分異常白血病細胞，主要優(yōu)勢是可不考慮初診時患者LAIPs，避免抗原漂移導致的假陰性，但此方法較為費時[8]。文獻[9]報道，在急性髓系白血病中，增加人類髓樣抑制性凝集素C和CD123至FCM抗體組合中，可規(guī)避抗原漂移所致假陰性結果；但在ALL中，尚未見類似報道。實際上，增加抗體組合，選用多種檢測方式，可提高MRD測定的陽性率。但FCM亦面臨著諸多問題，如抗體組合的選擇、設門方式、檢驗者的經(jīng)驗等，需要統(tǒng)一、規(guī)范的標準。閾值方面，雖然現(xiàn)在多為0.1%～0.01%，受制于儀器的種類、檢驗者的技術，各實驗室間也缺乏統(tǒng)一的標準。

1.2 PCR 主要包括實時熒光定量RCR(qPCR)、逆轉錄PCR(RT-PCR)兩種。qPCR檢測MRD的靈敏度為0.01%～0.001%。其原理為檢測淋巴細胞表面克隆性的免疫球蛋白(Ig)或T細胞受體(TCR)基因重排[10]，適用于90%～95%的ALL患者，其高靈敏度、高標準化的特點使其在歐洲廣泛運用。Ig/TCR基因重排時，由于不同V、D、J基因片段的隨機組合，及其連接處隨機丟失或插入部分堿基形成N區(qū)，使重排具有高度多樣性；此外，體細胞突變進一步擴大了多樣性，因此Ig/TCR基因重排對細胞及其子細胞具有特異性，可作為腫瘤特異性的標志。T-ALL、B-ALL患者均可出現(xiàn)TCR基因重排，且每個患者的基因重排具有特異性。因此Ig或TCR基因重排序列常作為PCR檢測ALL MRD的靶基因。由于Ig/TCR基因重排具有高度多樣性，因此，為提高檢測的特異性，需要在每個患者初診時檢測其Ig/TCR基因重排，以此設計特異性引物和探針，從而增加了檢測的難度；另外，在白血病病程中，10%～20% Ig/TCR基因重排可能發(fā)生克隆演化，將造成假陰性結果。RT-PCR測定MRD的原理為檢測融合基因，其靈敏度為0.01%～0.001%。染色體易位常導致斷裂點或其附近的基因結構或表達異常，形成特異性的融合基因，與白血病的發(fā)生、發(fā)展密切相關，由于其在白血病的發(fā)展過程中表達穩(wěn)定，可直接反映了白血病的特征。如t(9;22)形成的BCR/ABL融合基因及兒童ALL中最常見的t(12;21)形成的TEL-AML1融合基因。但在ALL中，只有25%～40%的B-ALL、10%～15%的T-ALL可檢測到融合基因的存在[11]，故其適用范圍較窄，只針對有特殊融合基因的ALL患者。同時，RT-PCR法需提取RNA，再經(jīng)過逆轉錄生成cDNA進行PCR擴增，有基因降解及交叉污染的可能性。

1.3 二代測序(NGS) NGS又稱高通量測序、深度測序，可以一次對幾十萬到幾百萬條DNA分子進行序列測定，通常用來作全基因組測序、外顯子測序、轉錄組測序及白血病MRD的檢測。與qPCR法相同，其檢測MRD時需要初診時Ig/TCR重排相關信息，對ALL細胞Ig/TCR基因重排進行正確鑒定，靈敏度為0. 000 1%，較FCM及PCR法均高。其靈敏度一方面取決于測序讀長的數(shù)量[12]；另一方面取決于投入DNA的總量：為了達到0. 000 01%的精確度，必須分析65 μg的DNA[13]。因為NGS允許使用共有引物進行快速、平行測序，所以不需要費力構建患者特異性引物，較qPCR法省時。NGS還提供有關生理B細胞庫或T細胞庫的有價值信息，因為樣本中靶基因座的所有重排都是按順序排列的。Michael等[14]比較了FCM與NGS對ALL MRD檢測的差異，結果發(fā)現(xiàn)NGS較FCM對預測疾病復發(fā)與2年總生存率更準確，特別是對MRD陰性患者(復發(fā)率0%vs16%，P=0.02；2年總生存率96%vs77%,P=0.003)。且移植后檢測MRD NGS較FCM能更好的預測復發(fā)，特別是移植后30 d(+30天時FCM MRD陽性與 NGS MRD陽性復發(fā)率分別為35%、67%，P=0.004)。Kotrova 等[15]比較了qPCR與NGS檢測MRD對復發(fā)的影響，也得出了NGS較PCR更優(yōu)。可以得出，NGS較PCR、FCM靈敏度更高，對ALL的危險分層、復發(fā)預測均更優(yōu)，但其面臨著復雜的生物學信息、校準器的應用、豐富的經(jīng)驗、后期數(shù)據(jù)的處理、費用昂貴、標本污染等一系列問題，需要更多的努力來解決。

2 ALL患者MRD檢測標本的選擇

臨床上檢測MRD的標本首選骨髓，尤其是B-ALL患者，骨髓能更好反應患者的疾病狀態(tài)，但骨髓穿刺畢竟是一個有創(chuàng)性操作。那外周血能否作為MRD選擇的標本呢？實際上，對兒童ALL經(jīng)一線誘導化療后完全緩解、MRD陰性的患兒，其復發(fā)風險極其低；若以骨髓MRD作為常規(guī)監(jiān)測復發(fā)手段，頻繁行骨髓穿刺，勢必給患兒帶來更多的痛苦。若能改進檢測方法，優(yōu)化測定方案，爭取對所有ALL患者，用外周血代替骨髓測定MRD，可減少患者(尤其兒童)的痛苦及經(jīng)費。Elaine 等[16]分析了226例初診的ALL患兒，采集了718對外周血及骨髓標本，以FCM檢測外周血及骨髓MRD，閾值為0.01%。發(fā)現(xiàn)有72對標本中，外周血及骨髓MRD均陽性；67對標本中，骨髓MRD陽性而外周血陰性；其余579對標本，骨髓及外周血MRD均陰性。值得注意的是，在150對T-ALL患兒標本中，骨髓及外周血MRD具有很好的一致性；且其中35對骨髓MRD陽性，而外周血亦陽性。而在B-ALL中，骨髓MRD陽性的104對標本僅有37份外周血MRD陽性。Van Der Velden等[17]亦得出了T-ALL中外周血和骨髓MRD一致性較好，而B-ALL中則不然。且在同一患者同時間的骨髓及外周血標本中，即使MRD均陽性，骨髓MRD較外周血MRD數(shù)值高約1 000倍。以上兩組研究可以得出在T-ALL中，外周血或許可替代骨髓作為MRD檢測的標本，而在B-ALL中則不能。而B-ALL外周血MRD可作為強烈的預后指標；若外周血MRD陽性，提示疾病越容易復發(fā)，預后越差。原因可能為前B細胞來源于骨髓，故骨髓MRD陽性率高于外周血；而前T細胞則來源于胸腺，白血病T細胞通過外周血遷移至骨髓，骨髓MRD與外周血MRD一致率較高。

3 ALL患者檢測MRD的臨床意義

3.1 危險分層指導治療 初診時我們常常根據(jù)患者的年齡、白細胞計數(shù)、細胞遺傳學等相關因素進行危險分層，但治療后發(fā)現(xiàn)，即使初診時的低?；颊?，經(jīng)過規(guī)范化的治療，緩解后仍有部分復發(fā)，提示此危險分層方式并不完善，此時以MRD的水平進行危險分層顯得格外重要。ALL治療早期白血病細胞清除越多，殘留越少，預后明顯改善。AIEOP協(xié)作組[18]強調了誘導化療第15天的MRD水平(FCM法)是一個獨立的預后因素，并可用來預測復發(fā)。根據(jù)d15骨髓的MRD水平，分為3組：標危組(<0.01%)、中危組(0.1%-10%)、高危組(>10%)，5年累計復發(fā)率分別為7.5% 、17.5%,、47.2%，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.001)。Vora等[19]回顧性分析了533例費城染色體陰性的1～24歲ALL患者，以開始治療第29天骨髓MRD為標準，將MRD>0.01%(qPCR法)歸為高危組，其后接受額外的強化治療。與標準治療的相比，中位隨訪70個月，5年無事件生存(EFS) (89.6% vs.82.8%,P=0.04)及總體生存率(OS)均有提高((92.9%vs88.9%，P=0.16)。提示對誘導緩解后MRD高水平患者，給予額外強化方案化療能讓患者獲益。相反地，Vora等[20]將MRD低?；颊?誘導化療后MRD陰性或第29天MRD陽性但11周時MRD轉陰)隨機分成2組，一組接受1療程強化治療，另外一組接受2療程強化治療。最后得出兩組患者EFS無明顯差異(94.4% vs.95.5%)。Nathalie等[21]發(fā)現(xiàn)，誘導治療后第一次緩解的費城染色體陰性的ALL患者接受造血干細胞移植，雖累計復發(fā)率較非移植組低，但其相當高的非復發(fā)死亡率似乎并不能讓患者獲益。提示對誘導化療后MRD反應良好的低危患者，減少化療次數(shù)是可行的，可避免過度治療，減少化療相關不良反應。

3.2 判斷預后 Borowitz等[22]發(fā)現(xiàn)，外周血第8天及骨髓第29天的MRD陽性預示著更短的EFS；第29天(誘導治療后)骨髓MRD陰性(<0.01%)與MRD可測到(0.01%～0.1%)相比，5年EFS分別為88%±1%、59%±5%，側面得出MRD以0.01%為閾值具有臨床意義。另外，多變量分析得出第29天骨髓MRD是最重要的預后因素。且鞏固治療后，MRD>0.01%提示預后不佳。另有文獻[23]報道，ALL患者治療6周后MRD陽性(PCR法，>0.01%)，復發(fā)率較MRD陰性患者明顯增加。此外，ALL患者移植前后的MRD水平與疾病預后密切相關。Bar 等[24]回顧性分析了160例ALL完全緩解期患者接受了清髓性預處理的allo-HSCT，移植前50天內MRD陽性增加了復發(fā)率(風險比3.64,95%CI，1.87～7.06；P=0.0001)及死亡率(風險比2.39,95%CI，1.46～3.90；P=0.0005)。Peter等[25]研究發(fā)現(xiàn)移植后任何時間MRD>0.01%預示著疾病終會復發(fā)。提示隨著時間的推移，移植后MRD持續(xù)陰性患者其累計復發(fā)率較MRD陽性者明顯降低；對移植后任何時間MRD>0.01%的患者，需要密切監(jiān)測，適時采取提前干預，避免血液學全面復發(fā)。

3.3 療效判定指標 CD20單克隆抗體—利妥昔單抗在CD20+B細胞淋巴瘤的作用已經(jīng)得到證明，那么其能否在B-ALL治療中起到正性作用呢？Dieter 等[26]報道，在pre-B-ALL中，其原始細胞CD20陽性率為30%～50%。比較了117例CD20+使用利妥昔單抗(甲組)與70例CD20+未使用利妥昔單抗(乙組)的2組患者。觀察了治療后21天、16周甲組與乙組MRD陰性(<0.01%)率，得出了21天時甲組MRD陰性率與乙組分別為60%、19%，16周時分別為89%、57%，3年持續(xù)緩解率64%vs48%、總生存率75%vs54%。Rebecca A. Gardner等[27]的一項Ⅰ期試驗表明，對CD19陽性的復發(fā)/難治B-ALL患者，行嵌合抗原受體T細胞免疫治療(CAR-T)可使患者MRD陰性，且其可逆的相關不良反應，無治療相關性死亡發(fā)生。

利妥昔單抗對降低CD20+pre-B-ALL MRD的水平具有一定作用，且針對CD7、CD5、CD3/CD7的免疫毒素在皮膚T細胞淋巴瘤、其他T細胞淋巴瘤及移植物抗宿主病的治療中進行了測試[28]，其在T-ALL的作用需要更多的研究。

綜上所述，ALL患者MRD常用的監(jiān)測方法有FCM、PCR、NGS。F臨床上檢測MRD的首選標本為骨髓，但T-ALL患者外周血可作為MRD檢測的標本。 ALL患者檢測MRD可對患者并進行危險分層，危險分層，評估治療反應，以采取不同的治療策略，指導個體化治療。 ALL患者檢測MRD可幫助患者判斷預后。ALL患者檢測MRD可作為CD20單克隆抗體—利妥昔單抗治療ALL效果的判定標準。