梁卓政 郭 程 孟 平 李洪濤 張?zhí)焱?/p>

支氣管哮喘是一種以慢性氣道炎癥為基礎(chǔ)的異質(zhì)性疾病，發(fā)作時(shí)其主要癥狀包括胸悶、咳嗽、喘息氣短等，并有可逆性氣流受限[1-2]。哮喘作為一種與過敏相關(guān)的疾病，CD4+T細(xì)胞在其發(fā)病過程中起著重要作用。在免疫應(yīng)答過程中CD4+T細(xì)胞在不同類型抗原刺激下可繼續(xù)分化，根據(jù)所分泌的細(xì)胞因子不同可分為Th1和Th2兩個(gè)亞群。Th1/Th2細(xì)胞發(fā)揮正常功能及數(shù)量上保持平衡狀態(tài)是維持機(jī)體正常免疫的基礎(chǔ)；Th1/Th2細(xì)胞功能異常或失衡，是引起多種免疫相關(guān)疾病的重要因素。一般認(rèn)為哮喘發(fā)病機(jī)制中存在向Th2細(xì)胞的免疫偏離。

直到現(xiàn)在，盡管哮喘的病因仍然不明，但是可以確定基因與其發(fā)病密切相關(guān)[3]。近幾年來，全基因組技術(shù)的應(yīng)用證實(shí)了多種基因與哮喘發(fā)生的密切關(guān)系。Toll樣受體2和4(TLR2、TLR4)、血清類黏蛋白1樣蛋白3(ORMDL3)、整合素和金屬蛋白酶33(ADAM33)、CD14、IL-4R和IL-6R等的基因多態(tài)性與哮喘易感性之間的關(guān)系已得到大量的研究支持[4-9]。有文獻(xiàn)顯示TIM-3-574 G>T基因多態(tài)性與中國人群支氣管哮喘的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)有關(guān)，然而由于單個(gè)研究樣本量有限，各研究結(jié)果存在一定差異。因此，本文利用已發(fā)表的中國漢族人群支氣管哮喘與TIM-3-574G>T基因多態(tài)性的相關(guān)研究進(jìn)行Meta分析，旨在通過對多個(gè)獨(dú)立研究進(jìn)行定量合并，增大樣本量，增加結(jié)果的說服力，彌補(bǔ)單個(gè)研究樣本量不足的缺點(diǎn)。

資料與方法

一、數(shù)據(jù)庫和檢索詞

選擇Pubmed、Embase、Web of Science(WOS)、CNKI、萬方數(shù)據(jù)庫以及SinoMed進(jìn)行檢索，末次檢索時(shí)間為2017年12月20日。使用如下關(guān)鍵詞檢索：哮喘(asthma)、多態(tài)(polymorphism* or variant*)、T細(xì)胞免疫球蛋白黏蛋白域蛋白-3(T cells immunoglobulin domain and mucin domain protein-3 or TIM-3)，結(jié)合高級(jí)檢索(將字段限定在中文的“主題”與英文的“Title/Abstract”)和主題詞檢索策略對相關(guān)文獻(xiàn)進(jìn)行篩選，同時(shí)采用文獻(xiàn)追蹤的方法繼續(xù)跟蹤之后可能出現(xiàn)的最新研究文獻(xiàn)。篩選流程如圖1所示。

二、文獻(xiàn)資料的納入標(biāo)準(zhǔn)和排除標(biāo)準(zhǔn)

1. 納入標(biāo)準(zhǔn)

(1)所有文獻(xiàn)均需提供診斷其患者為支氣管哮喘診斷標(biāo)準(zhǔn)：①反復(fù)發(fā)作的胸悶、咳嗽、喘息氣短；②發(fā)作時(shí)在雙肺可聞及散在或彌漫性、以呼氣相為主的哮鳴音，呼氣相延長；③上述癥狀經(jīng)平喘藥物治療后可緩解或自行緩解；④排除其他疾病引起的胸悶、咳嗽、喘息氣短；⑤臨床表現(xiàn)不典型者應(yīng)至少具備以下一項(xiàng)試驗(yàn)陽性：a.支氣管激發(fā)試驗(yàn)或運(yùn)動(dòng)試驗(yàn)陽性；b.支氣管舒張?jiān)囼?yàn)陽性(1 s用力呼氣容積增加15%以上，且增加絕對值>200 ml)；c.最大呼氣流量日內(nèi)變異率或晝夜波動(dòng)率≥20%；符合以上1～4項(xiàng)或4～5項(xiàng)者，可以診斷為哮喘。

圖1 Meta分析納入文獻(xiàn)篩選流程圖

(2)文獻(xiàn)設(shè)計(jì)類型病例對照研究。

(3)文獻(xiàn)中有提供TIM-3-574 G>T(rs10515746)多態(tài)性的檢測信息，并提供統(tǒng)計(jì)軟件分析所需的數(shù)據(jù)。

(4)對照組人群的基因型頻率分布需滿足Hardy-Weinberg平衡(P>0.05)。

(5)病例組與對照組之間具有可比性，即年齡、種族等比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2. 排除標(biāo)準(zhǔn)：①以家族系為背景的研究;②文獻(xiàn)提供的信息不全或無法進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析的文獻(xiàn)；③同一篇文獻(xiàn)結(jié)果重復(fù)發(fā)表，取其樣本量最大，可提供信息最全的一篇作為納入文獻(xiàn);④學(xué)位論文、會(huì)議文獻(xiàn);⑤研究對象為非中國漢族人種；⑥參考The Newcastle-Ottawa quality assessment scale(NOS)的病例對照研究文獻(xiàn)質(zhì)量評價(jià)標(biāo)準(zhǔn)[10]進(jìn)行文獻(xiàn)質(zhì)量評估，剔除評分比較低的文獻(xiàn)。

三、研究方法

由兩名研究人員使用上述統(tǒng)一的納入標(biāo)準(zhǔn)和排除標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行文獻(xiàn)篩選，獨(dú)立提取數(shù)據(jù)，并制成數(shù)據(jù)提取表，而后相互交換核對，最后達(dá)到意見統(tǒng)一，數(shù)據(jù)一致。提取的內(nèi)容包括：第一作者、發(fā)表年份、研究類型、國家、人群的種族、基因多態(tài)性檢測手段以及TIM-3-574 G>T(rs10515746)基因型頻率分布數(shù)據(jù)等。

四、統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用RevMan 5.3軟件對提取的數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。由于納入的文獻(xiàn)中均沒有TIM-3 rs10515746 TT基因型數(shù)據(jù)，故使用顯性模型GT/GG以及位點(diǎn)比較模型G/T對提取的數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，以O(shè)R值和95%CI作為研究效應(yīng)指標(biāo)，并對研究結(jié)果的進(jìn)行異質(zhì)性檢驗(yàn)。若檢驗(yàn)統(tǒng)計(jì)量I2<50%，說明各納入文獻(xiàn)之間異質(zhì)性比較小，可采用固定效應(yīng)模型進(jìn)行合并；若檢驗(yàn)統(tǒng)計(jì)量I2>50%，說明各納入文獻(xiàn)之間異質(zhì)性相對比較大，則應(yīng)采用更為保守的隨機(jī)效應(yīng)模型進(jìn)行合并。如果存在異質(zhì)性，則需尋找異質(zhì)性來源，對納入的文獻(xiàn)進(jìn)行亞組分析、敏感性分析等。利用Stata 12軟件做Begg法和Egger直線回歸對文獻(xiàn)發(fā)表偏倚進(jìn)行評估。

結(jié) 果

一、納入文獻(xiàn)的基本信息

從外文數(shù)據(jù)庫和中文數(shù)據(jù)庫中共找到相關(guān)文獻(xiàn)57篇，根據(jù)預(yù)先制定好的納入標(biāo)準(zhǔn)，并排除研究數(shù)據(jù)重復(fù)的和不滿足Hardy-Weinberg平衡的文獻(xiàn)，最終納入5篇文獻(xiàn)，其基本信息見表1。累計(jì)哮喘組患者1 241例，均符合現(xiàn)公認(rèn)的支氣管哮喘診斷標(biāo)準(zhǔn)，對照組患者1 005例。各研究對象的提取的信息及基因頻率，見表2。

二、異質(zhì)性檢驗(yàn)

各研究的Hardy-Weinberg平衡P值均>0.05，說明納入的5篇文獻(xiàn)所收集的人群代表性比較好。由于缺乏TT基因型的數(shù)據(jù)，故使用顯性模型GT/GG以及位點(diǎn)比較模型G/T的OR值和95%CI作為合并各個(gè)研究資料的效應(yīng)指標(biāo)，并對各模型中的文獻(xiàn)作異質(zhì)性檢驗(yàn)。經(jīng)RevMan 5.3分析，顯性模型GT/GG和位點(diǎn)比較模型G/T中納入的各研究中不存在異質(zhì)性，故兩模型均采用固定效應(yīng)模型來分析。

三、TIM-3基因-574 G>T多態(tài)性與哮喘易感性的分析結(jié)果

哮喘病例組和對照組在顯性模型和位點(diǎn)比較模型中差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，結(jié)果見圖2、圖3。顯性模型GT/GG合并后的OR值為4.06(95%CI：2.34,7.05)，結(jié)果表明GT基因型的分布與哮喘的易感性有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，攜帶有GT突變基因型的個(gè)體患哮喘的風(fēng)險(xiǎn)是野生型純合子GG個(gè)體的4.06倍。位點(diǎn)比較模型G/T的合并OR值為4.31(95%CI：2.50,7.43)，結(jié)果說明TIM-3 -574位點(diǎn)上T基因的突變會(huì)增加哮喘的易感性。與野生型G等位基因相比，TIM-3 -574位點(diǎn)上攜帶有T基因的個(gè)人患哮喘的風(fēng)險(xiǎn)增加3.31倍。

表1 Meta分析納入的5篇文獻(xiàn)基本信息特征

注：Pa：為對照組的Hardy-Weinberg遺傳平衡定律統(tǒng)計(jì)量

表2 5篇納入文獻(xiàn)中基因型和等位基因頻率的分布特點(diǎn)[n(%)]

注：a：均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差；b：年齡范圍

圖2 TIM-3基因-574 G>T多態(tài)性與哮喘易感性(顯性模型GT/GG)

圖3 TIM-3基因-574 G>T多態(tài)性等位基因與哮喘易感性(位點(diǎn)比較模型G/T)

四、發(fā)表偏倚

利用Stata 12對該研究納入文獻(xiàn)的發(fā)表偏倚情況進(jìn)行定量分析。Begg法結(jié)果值為Z=1.22，P=0.221，Egger法結(jié)果值為t=3.42，P=0.042，按照α=0.1檢驗(yàn)水準(zhǔn)，兩者結(jié)果不一致，說明本文納入文獻(xiàn)可能存在發(fā)表偏倚。

五、敏感性分析

本文中納入的文獻(xiàn)之間不存在異質(zhì)性，利用隨機(jī)效應(yīng)模型對納入文獻(xiàn)的顯性模型再次合并計(jì)算，結(jié)果并未發(fā)生改變。顯性模型中剔除一篇權(quán)重最大的李際盛等[14]的研究后，利用固定效應(yīng)模型進(jìn)行計(jì)算，合并的OR值為5.41(95%CI：2.62,11.16)，I2=0。因此，上述處理結(jié)果均顯示本文結(jié)果較為穩(wěn)定。

六、亞組分析

以年齡作為劃分，將資料病例人群分為兒童組和成人組，利用亞組分析對顯性模型進(jìn)行分析，由于巫學(xué)蘭[12]這篇文獻(xiàn)納入的病例組和對照組人群中有成人也有兒童，故無法納入亞組分組，合并結(jié)果見圖4。兒童組的合并OR值為4.07(95%CI：1.62，10.20)，I2=0；成人組的合并OR值為3.49(95%CI，1.92,6.37)，I2=13%。說明TIM-3基因-574 G>T多態(tài)性與兒童和成人哮喘的易感性有關(guān)系。

圖4 TIM-3基因-574 G>T多態(tài)性與哮喘易感性的年齡亞組分析(顯性模型GT/GG)

討論

T細(xì)胞免疫球蛋白黏蛋白域蛋白(TIM)家族是T細(xì)胞Ⅰ型跨膜蛋白，其N末端有Ⅴ型Ig結(jié)構(gòu)域，該結(jié)構(gòu)域上有長度可變的黏蛋白結(jié)構(gòu)域、包含一個(gè)與N原子連接的糖基化位點(diǎn)以及數(shù)個(gè)與O原子連接的糖基化位點(diǎn)[16]。小鼠的TIM基因家族定位于染色體11B1.1，包含TIM1-8，而人類的TIM基因家族定位于染色體5q33.2，包含3個(gè)成員，即TIM-1、TIM-3和TIM-4，其在嚙齒類動(dòng)物和人類之間無論從表達(dá)情況還是功能結(jié)構(gòu)都具有同源性，其余5種TIM基因只在嚙齒類動(dòng)物中表達(dá)[17]。TIM-1、TIM-3、TIM-4在分子結(jié)構(gòu)和功能上都具有不同的特點(diǎn)。TIM-1主要在Th2細(xì)胞中表達(dá)，Umetsu等[18]發(fā)現(xiàn)利用抗原和TIM-1單克隆抗體(TIM-1 Ig)對體外Th2細(xì)胞進(jìn)行共刺激培養(yǎng)，可見T細(xì)胞大量增殖，IL-4分泌明顯升高，但不分泌IFN-γ；而與對照組相比，小鼠體內(nèi)給予TIM-1 Ig處理后，體外分離得到的T細(xì)胞大量增殖，分泌大量的IL-4、IL-10和IFN-γ。Xie等[19]的相關(guān)性分析表明TIM-1 416G>C的基因多態(tài)性與中國漢族人的哮喘易感性有關(guān)，但5383_5397位點(diǎn)上插入/缺失的多態(tài)性與哮喘的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)無關(guān)。TIM-3主要表達(dá)于分化成熟的Th1細(xì)胞而不表達(dá)于Th2 細(xì)胞，負(fù)性調(diào)節(jié)Th1型免疫反應(yīng)。Th17也有少量表達(dá)，而Th2細(xì)胞不表達(dá)[20]。Anderson等[21]研究發(fā)現(xiàn)TIM-3在單核細(xì)胞以及樹突狀細(xì)胞中也有表達(dá)，而且在固有免疫與獲得性免疫中TIM-3發(fā)揮著截然不同的作用。在固有免疫中，TIM-3協(xié)同Toll樣受體增加TNF-α的分泌，從而促進(jìn)炎癥發(fā)展；在獲得性免疫中，TIM-3通過IFN-γ上調(diào)其配體半乳凝素-9，后者結(jié)合在Th1細(xì)胞表面的TIM-3后，可使鈣離子內(nèi)流增加，從而介導(dǎo)Th1細(xì)胞凋亡[22]。

本文顯示TIM-3-574 G>T多態(tài)性與哮喘易感性有關(guān)，攜帶有GT突變基因型的個(gè)體患哮喘的風(fēng)險(xiǎn)是野生型純合子GG個(gè)體的4.06倍。因此，推測TIM-3-574 位點(diǎn)上T基因的突變可能會(huì)激活TIM-3或者增強(qiáng)其活性，IFN-γ分泌增多，促使半乳凝素-9上調(diào)，后者與Th1細(xì)胞表面的TIM-3結(jié)合后，可使鈣離子內(nèi)流增加，Th1細(xì)胞發(fā)生鈣超載，從而介導(dǎo)Th1細(xì)胞凋亡，導(dǎo)致Th1/Th2 平衡向Th2偏移，最終導(dǎo)致哮喘的發(fā)生。

另外，以年齡作分組進(jìn)行亞組分析，發(fā)現(xiàn)TIM-3-574位點(diǎn)上T基因的突變對兒童哮喘發(fā)病的影響可能比成人的影響更大(兒童組：OR=4.07，95%CI：1.62，10.20；成人組：OR=3.09，95%CI：1.40,6.85)，我們推測導(dǎo)致該結(jié)果的原因可能有兩個(gè)：①兒童免疫系統(tǒng)發(fā)育尚未成熟，對外來刺激反應(yīng)更為敏感，TIM-3-574位點(diǎn)可能更容易發(fā)生突變，導(dǎo)致哮喘發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)增加；②可能由于兩組樣本量不足導(dǎo)致結(jié)果偏差。

目前國內(nèi)外有多個(gè)TIM-3-574 G>T多態(tài)性與人類支氣管哮喘的易感性相關(guān)的研究，但大部分都是中國漢族人種，對伊朗波斯人和韓國人與TIM-3基因多態(tài)性相關(guān)性的研究各有一篇[23-24]，考慮到其他人種的研究數(shù)量不足，為了排除人種的影響，故本文僅納入中國漢族地區(qū)人群的研究。本文納入的研究數(shù)目較少，每個(gè)研究納入的樣本量不夠大，人種相對單一，從而無法進(jìn)一步分層分析，故存在一定局限性，尚需要更大的樣本量予以支持以及不同人種的哮喘與TIM-3基因多態(tài)性的研究。此外，本文納入的文獻(xiàn)NOS評分不高，未能得到每一個(gè)研究中更多的詳細(xì)信息(如巫學(xué)蘭等[12]的研究中未把研究對象分為兒童組與成人組)。因納入的文獻(xiàn)中未能提供有關(guān)環(huán)境的信息，也無法對基因-基因及基因-環(huán)境的交互作用進(jìn)行分析，因而需要更全面更高質(zhì)量評分的文獻(xiàn)來進(jìn)一步支持研究結(jié)果和闡明哮喘的發(fā)病機(jī)制。

綜上所述，TIM-3-574 G>T單核苷酸多態(tài)性變異與中國漢族人群支氣管哮喘患病風(fēng)險(xiǎn)有高度相關(guān)性，且T基因的突變可能使兒童組的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)比成人組的更高。