鄭鴦鴦 ，吉 薇 ，吉宏武 *，2，3，4，蘇偉明 ，2，3，劉書成 ，2，3，4

（1.廣東海洋大學(xué) 食品科技學(xué)院，廣東 湛江 524088；2.廣東省水產(chǎn)品加工與安全重點實驗室，廣東 湛江524088；3.廣東省海洋食品工程技術(shù)研究中心，廣東 湛江524088；4.水產(chǎn)品深加工廣東省普通高校重點實驗室，廣東 湛江 524088）

凡納濱對蝦 （Litopenaeus vannamei）屬于對蝦科、濱對蝦屬[1]，是中國主要的對蝦品種，也是我國出口對蝦的主要品種[2]，深受消費者的歡迎。但是凡納濱對蝦水分含量高，內(nèi)源酶種類豐富，運輸銷售過程中極易出現(xiàn)肌肉自溶、組織軟化等問題，致使品質(zhì)下降、貯藏時間縮短而影響其商業(yè)價值。文獻報道指出，內(nèi)源酶和微生物作用引起的肌原纖維蛋白等細胞骨架成分的蛋白質(zhì)降解是水產(chǎn)品肌肉軟化、腐敗變質(zhì)的主要原因[3-6]。

澳大利亞學(xué)者Wilkins和Williams早在1994年最先提出了“蛋白質(zhì)組”這個概念[7]，定義為一個基因組表達的所有蛋白質(zhì)。蛋白質(zhì)組研究的是不同時間和空間上發(fā)揮功能的特定蛋白質(zhì)群體，目的是要從蛋白質(zhì)水平上探索蛋白質(zhì)的作用方式、調(diào)控機制、功能機理以及蛋白質(zhì)群體內(nèi)的相互作用[8]。蛋白質(zhì)組數(shù)據(jù)庫是生物信息學(xué)的重要信息來源，通過這些已建數(shù)據(jù)庫展開蛋白質(zhì)的生物信息學(xué)分析能夠提供各種生理機制過程中參與決定肌肉品質(zhì)的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)和功能等方面的信息[9]。近年來，蛋白組學(xué)已被廣泛應(yīng)用到水產(chǎn)品的研究中。早期蛋白組學(xué)對水產(chǎn)品的研究主要集中在分類學(xué)上，隨后蛋白組學(xué)又逐步成為了解免疫應(yīng)答機制的的一種手段，如Jiang H等[10]利用比較蛋白組學(xué)從中國對蝦肝胰臟中鑒定出33種能夠承受低氧環(huán)境的蛋白、Silvestre F等[11]指出抗生素對斑節(jié)對蝦血淋巴蛋白表達的影響會被外部養(yǎng)殖條件所誤導(dǎo)。對于大西洋三文魚、鱒魚、鯰魚、鱈魚等這些具有重要商業(yè)價值的魚種，目前研究內(nèi)容主要涉及魚類病原體或致敏蛋白、篩選表征新鮮度和品質(zhì)的標記物、營養(yǎng)價值[12]。Lanfen Fan等[13]利用蛋白組學(xué)技術(shù)研究了對照組和處理組凡納濱對蝦血細胞中的冷應(yīng)激蛋白，結(jié)果表明血藍蛋白在凡納濱對蝦對環(huán)境的調(diào)節(jié)機制中起重要作用。張帥[14]優(yōu)化了凡納對蝦肌肉雙向電泳體系，采用質(zhì)譜鑒定出了精氨酸激酶、肌動蛋白T2和磷酸丙酮酸水合酶這3種差異蛋白能用作新鮮度指示蛋白。李婷婷[15]篩選出8個能代表大黃魚品質(zhì)變化的差異蛋白質(zhì)。李學(xué)鵬[16]采用蛋白組學(xué)技術(shù)研究中國對蝦在冷藏過程中的肌肉蛋白質(zhì)變化，指出腺苷鈷啉胺酸合成酶可作為新鮮度指示蛋白。此外，Verrez.Bagnis等[17]利用單向和雙向電泳探索黑鱸在保藏期間肌肉蛋白質(zhì)變化情況，最后提出了潛在魚肉新鮮度指示蛋白，Capillas和Moral指出鵝肌肽可以作為冰藏鱈魚的新鮮度指示物。

蛋白質(zhì)組學(xué)研究可以應(yīng)用到水產(chǎn)品新鮮度的評價上，雖然目前有關(guān)于凡納濱對蝦蛋白組學(xué)的研究，但是對0℃冰藏這一更接近實際流通過程對蝦保藏溫度的研究鮮有報道。為此，作者以凡納濱對蝦為原料，以0℃作為貯藏溫度，把蛋白組學(xué)技術(shù)應(yīng)用到凡納濱對蝦冰藏期間肌肉蛋白的變化，旨在尋找能代表新鮮度的指示蛋白，以期探索出凡納濱對蝦肌肉蛋白質(zhì)的降解情況與其品質(zhì)性狀之間的相關(guān)性信息。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

干膠條 （24 cm，pH 4-7）：BIORAD 公司產(chǎn)品；蛋白酶抑制劑PMSF、二硫蘇糖醇（DTT）、二硫蘇糖醇 （DTT）、甘氨酸、甘油、N，N-二甲基丙烯酰胺（Acylamide）：Amresco公司產(chǎn)品；胎牛血清標準品BSA、N，N’- 亞 甲 基 雙 丙 烯 酰 胺 （N，N’ -methylenebisacrylamide）、 碳酸氫銨，Sigma公司產(chǎn)品；IPG Buffer（pH4-7）、水化盤、覆蓋油：GE 公司產(chǎn)品；過硫酸銨、四甲基乙二胺（TEMED）、碘乙酰胺（IAA）、硫脲（Thiourea）、脲（Urea），購于 Amersham；胰酶、三氟乙酸、低熔點瓊脂糖：Promega公司產(chǎn)品；普通瓊脂糖公司產(chǎn)品Gene tech companylimited公司產(chǎn)品；甲醇、乙腈：Fisher公司產(chǎn)品；HCCA：ABI公司產(chǎn)品；丙酮：Baker公司產(chǎn)品。

1.2 儀器與設(shè)備

MALDI-TOF-TOF質(zhì)譜儀：德國布魯克（Bruker Dalton）Autoflex speedTM公司產(chǎn)品；等電聚焦儀：GE ETTAN IPGPHOR3公司產(chǎn)品；垂直電泳槽：GE ETTAN DALTsix公司產(chǎn)品；超聲儀：寧波新芝生物科技股份有限公司產(chǎn)品。

1.3 樣品預(yù)處理

用蒸餾水將鮮活的凡納濱對蝦清洗后立即冰猝致死。置于0℃冰箱中冰藏，取樣時間依次為0、2、4、6、8、10 d。

1.4 雙 向 電 泳 （Two-dimensionalgel electrophoresis，2-DE）

用裂解液（20 mmol/L Tris、2 mol/L 硫脲、7 mol/L尿素、2 g/dL CHAPs）溶解、提取凡納濱對蝦肌肉第二腹節(jié)組織中的蛋白，再用分光光度計進行蛋白質(zhì)定量。干膠條泡脹后進行一向等電聚焦，程序參數(shù)設(shè)置如表1所示。等電聚焦結(jié)束后，采用12.5 g/dL的二向膠進行丙烯酰胺凝膠電泳，參數(shù)設(shè)置如表2所示。

表1 等電聚焦程序參數(shù)設(shè)置Table 1 Setting of IEF parameters

表2 二向SDS-PAGE電泳參數(shù)設(shè)置Table 2 Setting of SDS-PAGE parameters

1.5 染色

本實驗所用分析膠采用銀染法，主要包括固定、敏化、漂洗、銀染、漂洗、顯色、終止和漂洗。銀染的分析膠上樣量一般為120 μg。作者所用質(zhì)譜膠采用考馬斯亮藍染色法，以質(zhì)量分數(shù)0.12%G-250、質(zhì)量分數(shù)10%（NH4）2SO4和體積分數(shù)20% 甲醇為染色液。主要包括固定、漂洗、染色和終止?？既镜馁|(zhì)譜膠上樣量一般為1 200 μg。

1.6 圖像掃描和分析

染色完的凝膠當天掃描，采用Image Master 2D platinum 5.0（GE）專業(yè)圖像分析軟件讀取分析二維圖像數(shù)據(jù)。兩組2-DE圖譜中同一蛋白點的灰度值之比＞1.5，且 t-test檢驗p＜0.05，才可判斷為差異蛋白點。當一組2-DE圖譜中蛋白點灰度值高于另一組圖譜中同一蛋白點灰度值1.5倍時記為上調(diào)，灰度值低于1.5倍時則記為下調(diào)。

1.7 質(zhì)譜檢測

利用德國布魯克 （Bruker Dalton）Autoflex speedTMMALDI-TOF-TOF質(zhì)譜儀進行質(zhì)譜分析。參數(shù)設(shè)置：UV波長為355 nm，重復(fù)速率為200 Hz，加速電壓為20 000 V，最優(yōu)質(zhì)量分辨率為1 500。掃描質(zhì)量范圍為700～3 200，收集信號。

數(shù)據(jù)庫檢索：利用軟件 flexAnalysis（Bruker Dalton）過濾基線峰、識別信號峰。采用BioTools（Bruker Dalton）軟件進行NCBI數(shù)據(jù)庫搜索，尋找相關(guān)的匹配蛋白質(zhì)。

2 結(jié)果與分析

2.1 凡納濱對蝦不同冰藏時間點肌肉蛋白質(zhì)的2-DE圖譜

采用24 cm pH4-7 IPG膠條，分析膠采用銀染法，蛋白上樣量為120 μg，進行等電聚焦。采用12.5 g/dL的二向膠對提取后的不同冰藏（0℃）時間的凡納濱對蝦肌肉蛋白進行2-DE分離，銀染后獲得清晰度和分辨率較高的蛋白質(zhì)分離圖譜，如圖1所示。

對不同冰藏時間的肌肉蛋白質(zhì)2-DE圖譜依次進行兩兩比對。2 d與0 d對比的2-DE圖譜中差異蛋白共有200個，4 d與0 d對比的差異蛋白共有190個，6 d與0 d對比的差異蛋白共有171個，8 d與0 d對比的差異蛋白共有167個。再對上述所有差異斑點進行多重比對，篩選得到2-DE圖譜上相同位置的重復(fù)點所對應(yīng)的差異斑點17個，依次挖取相應(yīng)的斑點進行MALDI-TOF-TOF鑒定。

圖1 不同冰藏時間下凡納濱對蝦肌肉蛋白質(zhì)的雙向電泳圖譜Fig.1 2-DE gels of muscle protein of Litopeneaus vannamei during iced storage

2.2 凡納濱對蝦冰藏期間差異蛋白的鑒定與分析

在17個篩選到差異斑點中，12個蛋白斑點得到了成功的鑒定。在成功鑒定的蛋白斑點中，肌原纖維蛋白占的最多，占了1/2以上，包括肌球蛋白、肌動蛋白和肌鈣蛋白。肌球蛋白和肌動蛋白屬于結(jié)構(gòu)蛋白，分別構(gòu)成了肌原纖維蛋白的粗絲和細絲；肌鈣蛋白是肌肉的主要調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)，直接參與鈣所控制的肌肉收縮，占肌原纖維蛋白的5%。酶占了1/4，另外還成功鑒定出了唐氏綜合癥細胞粘附分子和血淋巴凝固蛋白，結(jié)果如表3所示。

從表3可以看出，一些不同的蛋白點，如斑點I19和J02、斑點I62和J29、I72和J16被鑒定為相同的蛋白，這可能是由于蛋白異構(gòu)體的存在和翻譯后修飾所致[18]。

表3 差異蛋白點NCBI數(shù)據(jù)庫檢索結(jié)果Table 3 NCBI search results of differentially expressed protein spots

為進一步篩選出隨冰藏時間具有規(guī)律性變化的差異蛋白，對上述成功鑒定出的差異蛋白進行灰度值和灰度值差異倍數(shù)的分析。結(jié)果顯示，初步篩選出3個隨冰藏時間具有規(guī)律性變化的差異蛋白，分別為差異蛋白 I19、I14、I75。

如圖2所示，差異蛋白點I19和I14的灰度值均隨冰藏時間呈持續(xù)上升趨勢，且這2個差異蛋白點最先的灰度值很小基本為零，說明差異蛋白I19和I14是凡納濱對蝦肌肉中固有的蛋白或酶的降解產(chǎn)物，這與質(zhì)譜鑒定結(jié)果一致，這2個差異蛋白依次為肌球蛋白重鏈1和腺苷酸脫氨酶。隨冰藏時間越久，肌球蛋白重鏈1和腺苷酸脫氨酶產(chǎn)生的降解產(chǎn)物越多，因此這些差異蛋白點灰度值也隨之升高。而差異蛋白點I75為精氨酸激酶，在冰藏前期灰度值也一直上升，但到冰藏末期8 d時精氨酸激酶的降解產(chǎn)物本身也發(fā)生了降解，因此最后I75灰度值開始下降。無脊椎動物的精氨酸激酶與脊椎動物中的肌酸激酶類似，它屬于磷酸激酶，參與細胞代謝。它將ATP上的磷酸基團轉(zhuǎn)移給精氨酸，生成磷酸精氨酸和ADP，這在無脊椎動物的能量代謝中有著重要作用。

凡納濱對蝦蝦肉水分含量較高，同時富含蛋白質(zhì)，肌肉組織較松軟，主要由肌原纖維蛋白組成[19]，其中肌球蛋白是肌原纖維蛋白的重要組成成分，構(gòu)成了肌原纖維蛋白的粗絲。肌球蛋白由2條重鏈和4 條輕鏈組成，肌球蛋白重鏈 1（MHC1，I19）是肌球蛋白的其中一條重鏈。因此，凡納濱對蝦MHC1的降解會造成肌肉組織結(jié)構(gòu)的崩塌和肌肉的軟化，致使對蝦品質(zhì)下降。對蝦死后肌肉發(fā)生的第一個變化是內(nèi)源酶活性引起的肌肉蛋白和結(jié)締組織的降解[20-22]，另外有文獻報導(dǎo)指出蛋白酶水解活動能降解海鯡魚和大西洋鱈魚提取物中的肌球蛋白重鏈[23-24]。

凡納濱對蝦在冰藏期間MHC1在冰藏期間被逐漸降解，降解產(chǎn)物的灰度值呈上升趨勢。為尋找差異蛋白在冰藏期間的變化規(guī)律，對灰度值進行線性回歸，結(jié)果表明差異蛋白點I19即MHC1的灰度值變化與冰藏時間呈良好的線性正相關(guān)，決定系數(shù)R2為0.920。差異蛋白I14腺苷酸脫氨酶是嘌呤腺苷代謝中重要的酶類，它與冰藏時間用二次多項式回歸擬合效果較好，決定系數(shù)R2達到0.986，而差異蛋白點I75精氨酸激酶相關(guān)性較差。不同的蝦類品種在不同的貯藏條件下，蝦肉的蛋白質(zhì)將會發(fā)生不同的變化。李學(xué)鵬[16]在研究中國對蝦4℃和-2℃冷藏過程中的肌肉蛋白質(zhì)變化時，鑒定出的差異蛋白腺苷鈷啉胺酸合成酶，它的灰度變化與冷藏時間有良好的線性關(guān)系，可以作為新鮮度指示蛋白。

圖2 凡納濱對蝦冰藏期間差異蛋白的局部放大2-DE圖譜Fig.2 Local amplification of differentially expressed protein spots in the 2-DE maps of Litopeneaus vannamei during different storage times

3 結(jié) 語

作者通過蛋白組學(xué)技術(shù)研究了冰藏期間凡納濱對蝦肌肉蛋白的變化規(guī)律，實驗結(jié)果表明，肌球蛋白重鏈1和腺苷酸脫氨酶在冰藏期間生成的降解產(chǎn)物為差異蛋白I19和I14，兩者的灰度值均隨冰藏時間呈上升趨勢。其中，差異蛋白肌球蛋白重鏈1的灰度值變化與冰藏時間呈良好的線性正相關(guān)，腺苷酸脫氨酶的灰度值與時間用二次多項式回歸擬合效果較好。因此，肌球蛋白重鏈1和腺苷酸脫氨酶均對凡納濱對蝦新鮮度具有指示作用，有望成為新鮮度的指示蛋白。