黃德智 綜述，蒲曉允審校

(陸軍軍醫(yī)大學(xué)新橋醫(yī)院檢驗(yàn)科，重慶 400037)

1 免疫層析技術(shù)簡(jiǎn)介

免疫層析技術(shù)是在20世紀(jì)60年代在發(fā)達(dá)國(guó)家興起并被用于檢測(cè)血清蛋白的一種結(jié)合了免疫技術(shù)和色譜層析技術(shù)的快速檢測(cè)分析方法，利用膠體金、膠體碳、磁性納米材料、稀土納米材料、量子點(diǎn)等著色標(biāo)記物，在層析時(shí)，標(biāo)記物與待測(cè)物的絡(luò)合物被相應(yīng)的配體捕獲而濃集顯色于硝酸纖維素膜上的檢測(cè)線，以纖維膜上顯色條帶的有無(wú)、顏色深淺和反射光線來(lái)定性或定量，在即時(shí)檢測(cè)(POCT)中應(yīng)用極為廣泛。免疫層析試紙條由樣品墊、結(jié)合墊、硝酸纖維素(NC)膜、檢測(cè)線(T線)、質(zhì)控線(C線)、吸水墊、聚氯乙烯(PVC)底板等部分組成，根據(jù)待檢測(cè)物的大小和抗原抗體結(jié)合的方式，分為雙抗體夾心法和競(jìng)爭(zhēng)法[1-2]。

2 免疫層析技術(shù)發(fā)展及應(yīng)用

免疫層析技術(shù)關(guān)鍵在于依靠標(biāo)記抗體的免疫標(biāo)記材料，而納米材料由于優(yōu)越的信號(hào)放大作用，能達(dá)到良好的靈敏度和特異度而備受青睞。下面主要從膠體碳、量子點(diǎn)、稀土納米材料、上轉(zhuǎn)換發(fā)光技術(shù)和超順磁性納米材料以及適配體等方面進(jìn)行介紹。

2.1膠體碳 與膠體金相比，膠體碳的優(yōu)點(diǎn)包括更高的顏色強(qiáng)度，即更高的靈敏度和標(biāo)記效率，動(dòng)力學(xué)檢測(cè)范圍更廣，成本低廉，制作工藝簡(jiǎn)單，可大規(guī)模生產(chǎn)且更環(huán)保，但由于其標(biāo)記和封閉時(shí)間長(zhǎng)，并未體現(xiàn)出對(duì)膠體金的絕對(duì)優(yōu)勢(shì)，故其商業(yè)化程度較低[3-4]。何卓等[3]利用碳納米顆粒制作的膠體碳試紙條用于檢測(cè)瘧原蟲(chóng)，并可通過(guò)掃描檢測(cè)帶灰度值以定量。最近，YU等[4]利用一種新的膠體碳材料氧化石墨烯作為標(biāo)記物，成功制作出用于檢測(cè)黃曲霉素B1的試紙條，肉眼最低檢測(cè)限可達(dá)0.3 ng/mL。材料學(xué)的進(jìn)步能促進(jìn)檢測(cè)的進(jìn)步，諸如碳量子點(diǎn)和石墨烯量子點(diǎn)等材料也是免疫層析研究中可以利用的標(biāo)記材料。

2.2量子點(diǎn) 量子點(diǎn)被認(rèn)為是免疫層析中最有前途的熒光半導(dǎo)體納米材料，與一般熒光染料相比，量子點(diǎn)具有尺寸可調(diào)的熒光，發(fā)射光譜窄而對(duì)稱(chēng)，高量子產(chǎn)率，寬吸收光譜，熒光強(qiáng)度高，耐光漂白和穩(wěn)定性好等優(yōu)點(diǎn)[5-6]。水溶性量子點(diǎn)表面富含羧基或氨基以用于連接蛋白質(zhì)。表面是羧基的量子點(diǎn)被1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽(EDC)和N-羥基琥珀酰亞胺(NHS)激活，并且這些激活的羧基和抗體的氨基相連接。這些特性使得量子點(diǎn)是一個(gè)可以達(dá)到高靈敏度和同時(shí)對(duì)多種檢測(cè)物定量的免疫層析標(biāo)記物[7]。為了檢測(cè)樣本中不同的物質(zhì)，有兩種不同模式的檢測(cè)方法。第一種模式是不同的T線去檢測(cè)與之對(duì)應(yīng)的分析物；第二種模式是一條T線去檢測(cè)不同的分析物。例如，第一種模式，TARANOVA等[8]設(shè)計(jì)了一種“交通信號(hào)燈”式的競(jìng)爭(zhēng)性免疫層析方法，他們使用的多色彩的量子點(diǎn)作為標(biāo)記物以同時(shí)檢測(cè)牛奶中的氧氟沙星、氯霉素和鏈霉素，有625、585、525 nm的3種不同發(fā)射峰的水溶性量子點(diǎn)被用于制作成3條不同顏色的檢測(cè)線，分別是紅色、黃色和綠色。在這種“交通信號(hào)燈”式的檢測(cè)方法中，氧氟沙星、氯霉素和鏈霉素的檢測(cè)限分別達(dá)到了0.30、0.12、0.20 ng/mL，比酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)方法的檢測(cè)限低了80～200倍。第二種模式，WANG等[7]設(shè)計(jì)的一種以多色量子點(diǎn)為標(biāo)記物的雙抗體夾心免疫層析試紙條，這種試紙條只有一條T線，可同時(shí)檢測(cè)甲胎蛋白和癌胚抗原，檢測(cè)限分別為3、2 ng/mL。雖然量子點(diǎn)有諸多優(yōu)點(diǎn)，但量子點(diǎn)也有缺點(diǎn)。例如，量子點(diǎn)在生物環(huán)境下化學(xué)性質(zhì)和膠體性質(zhì)的不穩(wěn)定性可能會(huì)導(dǎo)致定量不準(zhǔn)確。所以，最近已經(jīng)有幾個(gè)研究小組都已經(jīng)開(kāi)發(fā)了一種新的方法，把量子點(diǎn)包被到納米顆粒表面或里面形成量子點(diǎn)微球，以提升其化學(xué)和膠體穩(wěn)定性，并借此通過(guò)量子點(diǎn)的數(shù)量來(lái)擴(kuò)大檢測(cè)信號(hào)[8-9]。丁喬棋等[10]以羧基化CdTe/ZnSe量子點(diǎn)熒光微球?yàn)闃?biāo)記物制作的免疫層析試紙條檢測(cè)牛奶中的氯霉素，檢出限為0.1 μg/L。量子點(diǎn)提高穩(wěn)定性后，在多聯(lián)檢測(cè)上是很有前途的納米材料。

2.3鑭系元素 鑭系元素是第57號(hào)元素鑭到71號(hào)元素镥共15種元素的統(tǒng)稱(chēng)，用符號(hào)Ln表示，鑭系元素和免疫層析技術(shù)相結(jié)合形成時(shí)間分辨熒光免疫分析層析技術(shù)(TRFICA)[11]。與傳統(tǒng)熒光標(biāo)記物相比，鑭系元素有獨(dú)特的熒光特性：熒光壽命長(zhǎng)，激發(fā)光和發(fā)射光的波長(zhǎng)差(stokes位移)大，激發(fā)光譜和發(fā)射光譜無(wú)交叉，特征峰非常尖銳，標(biāo)記物體積小(原子標(biāo)記)，標(biāo)記物不會(huì)影響被標(biāo)記物(尤其對(duì)蛋白質(zhì)的影響小)的空間立體結(jié)構(gòu)，保證了被檢物質(zhì)的穩(wěn)定性，且可以實(shí)現(xiàn)多位點(diǎn)標(biāo)記等特點(diǎn)。通過(guò)有效利用波長(zhǎng)分辨和時(shí)間分辨技術(shù)排除非特異熒光，實(shí)現(xiàn)了高信噪比和靈敏度，以時(shí)間分辨技術(shù)測(cè)量特異熒光，對(duì)待檢物質(zhì)進(jìn)行定量分析，解決了普通熒光分析中材料和樣品中非特異熒光產(chǎn)生的高背景問(wèn)題，其中Eu最為常用[12-13]。LIANG等[14]用 Eu3+敖合的聚苯乙烯微球作為標(biāo)記物制作的時(shí)間分辨熒光免疫層析試紙條以檢測(cè)甲胎蛋白，該研究小組是以T線熒光值/C線熒光值(HT/HC比率)來(lái)定量檢測(cè)甲胎蛋白，以HT/HC比率來(lái)定量可以消除試紙條之間的固有異質(zhì)性和檢測(cè)標(biāo)本的基質(zhì)效應(yīng)，使得結(jié)果準(zhǔn)確性和重復(fù)性更好。最后該小組檢測(cè)甲胎蛋白的線性范圍達(dá)到1.0～1 000.0 IU/mL，最低檢測(cè)限達(dá)到了0.1 IU/mL，與商用的化學(xué)發(fā)光試劑盒結(jié)果符合性?xún)?yōu)異。同樣地，TRFICA一樣可以實(shí)現(xiàn)一個(gè)試紙條檢測(cè)多種物質(zhì)。WANG等[15]用競(jìng)爭(zhēng)法，在NC膜上劃了1條C線和3條T線，3條T線分別用于檢測(cè)3種不同的β-受體激動(dòng)劑：鹽酸克倫特羅、萊克多巴胺、沙丁胺醇。理論上講，TRFICA的靈敏度可以達(dá)到10～18 mol/L，但在現(xiàn)有的研究中還不能達(dá)到，所以以后的研究仍須進(jìn)一步發(fā)揮其高靈敏度的優(yōu)勢(shì)。

2.4上轉(zhuǎn)換發(fā)光技術(shù) 上轉(zhuǎn)換發(fā)光技術(shù)即以稀土金屬元素 (主要是鑭系) 構(gòu)成的納米或亞微米顆粒作為標(biāo)記物的免疫層析技術(shù)[16]。上轉(zhuǎn)換發(fā)光材料在紅外激發(fā)光下可發(fā)射出不同波長(zhǎng)的可見(jiàn)光，使其具有抗光漂白能力強(qiáng)、反斯托克斯位移寬、毒性低、背景熒光干擾小、發(fā)光特性穩(wěn)定等有點(diǎn)，在免疫檢測(cè)中可提高靈敏度和信噪比，尤其適用于復(fù)雜樣本的檢測(cè)[17-20]。雷萌等[21]研制基于上轉(zhuǎn)換納米熒光快速定量檢測(cè)降鈣素原的免疫層析檢測(cè)技術(shù)，最低檢測(cè)限為0.02 ng/mL，線性范圍為0.05～44.00 ng/mL。 基于上轉(zhuǎn)換發(fā)光尤其適用于復(fù)雜樣本的檢測(cè)的特點(diǎn)，可以開(kāi)發(fā)基于上轉(zhuǎn)換發(fā)光的多聯(lián)檢測(cè)試紙條。

2.5磁性納米微球 在傳統(tǒng)的免疫層析方法中，定量主要依賴(lài)于測(cè)試儀去讀取可見(jiàn)光或熒光，但這種方法的劣勢(shì)就是只能檢測(cè)到膜表面及以下10 μm這部分的可見(jiàn)光或熒光。然而，通常NC膜的厚度一般是數(shù)百微米，分析物在層析時(shí)，從膜表面到底部均有指示物質(zhì)的分布，這樣就造成了多達(dá)90%或以上的指示物質(zhì)未被肉眼或光學(xué)儀器所測(cè)量到，這對(duì)于檢測(cè)的靈敏度是個(gè)極大的損失。而基于超順磁納米顆粒(MNPs)作為標(biāo)記物的免疫層析方法，利用磁信號(hào)分析儀(MAR)可以實(shí)現(xiàn)對(duì)膜上信號(hào)的完整讀取，不用去考慮膜的厚度問(wèn)題，這樣可以把靈敏度提高10～1 000倍，而且試紙條在長(zhǎng)時(shí)間放置后磁信號(hào)并不會(huì)有明顯損失，生物材料中有鮮有磁信號(hào)，因此，對(duì)試紙條的干擾很小，所以這樣的方法可以達(dá)到很高的靈敏度、準(zhǔn)確性和穩(wěn)定性[9,22-23]?；诔槾偶{米顆粒的免疫層析法，定量的檢測(cè)模式有兩種：第一種模式是在振蕩的磁場(chǎng)中，用巨磁阻傳感器去檢測(cè)T線上所有磁性納米顆粒的磁化飽和強(qiáng)度；第二種模式是在磁場(chǎng)中，利用磁信號(hào)檢測(cè)儀去掃描NC膜上各個(gè)部分以得到磁通量[9]。然而兩種模式使用的檢測(cè)儀器不適宜普及，WU等[24]利用智能手機(jī)的相機(jī)和成像技術(shù)把質(zhì)控線和檢測(cè)線上的磁珠抗體顏色強(qiáng)度轉(zhuǎn)化成數(shù)字信號(hào)來(lái)給尿液中的可卡因定量。GONG等[25]也利用磁性微球建立了同時(shí)檢測(cè)心肌肌鈣蛋白I和肌酸激酶同功酶(CK-MB)的方法，最低檢測(cè)限達(dá)到了0.049 ng/mL和0.085 ng/mL。這也為以后用磁性微球建立免疫層析的方法做出了一定的指引，可以利用身邊的智能設(shè)備如手機(jī)等作為檢測(cè)設(shè)備，做到更加高效快速的檢測(cè)。

2.6適配體 傳統(tǒng)的免疫層析法用抗體作為標(biāo)記物和捕獲物，現(xiàn)在隨著指數(shù)富集的配基系統(tǒng)進(jìn)化技術(shù)(SELEX)的應(yīng)用，配對(duì)的適配體也逐漸篩選出來(lái)。適配體相對(duì)于傳統(tǒng)的抗體來(lái)講，具有諸多的優(yōu)勢(shì)：篩選周期短，親和力和穩(wěn)定性高，特異度強(qiáng)，重復(fù)性好，易于合成和修飾，成本低，易于保存，無(wú)免疫原性和毒性，可與細(xì)胞、重金屬、蛋白質(zhì)、細(xì)菌和病毒等靶標(biāo)適配[26-27]。AHMAD RASTON等[28]利用SELEX篩選絲氨酸蛋白酶抑制劑的同源適配體結(jié)合膠體金技術(shù)檢測(cè)絲氨酸蛋白酶抑制劑，在溶液和血清中的檢測(cè)限分別達(dá)到了0.137 nmol和0.105 nmol。WU等[26]也首次用適配體檢測(cè)玉米赤霉烯酮，檢測(cè)限達(dá)到了20 ng/mL。由于適配體的諸多優(yōu)點(diǎn)以及SELEX技術(shù)的逐漸成熟應(yīng)用，在免疫層析上用適配體來(lái)代替抗體檢測(cè)是一個(gè)好的方向。

3 結(jié)論和展望

本綜述介紹了免疫層析法的設(shè)計(jì)組裝、反應(yīng)原理及主要標(biāo)記物種類(lèi)和在POCT的應(yīng)用，包括床旁檢測(cè)、食物檢測(cè)和環(huán)境監(jiān)測(cè)等。經(jīng)過(guò)幾十年的發(fā)展，從最初的膠體金，到后來(lái)的膠體碳、量子點(diǎn)、稀土發(fā)光材料、上轉(zhuǎn)換發(fā)光材料、超順磁納米微球和適配體等，以及本文中還未提及的脂質(zhì)體等材料，各種材料都被人們發(fā)現(xiàn)并運(yùn)用，使得免疫層析得到長(zhǎng)足的發(fā)展和廣泛應(yīng)用。定量、提高靈敏度、多聯(lián)檢測(cè)和環(huán)保是未來(lái)依然要努力的方向?？傊喾N多樣的標(biāo)記材料已經(jīng)在免疫層析法上有所使用，也各自展現(xiàn)了自己的優(yōu)勢(shì)和劣勢(shì)，應(yīng)進(jìn)一步對(duì)此深入研究，以使得其更好地應(yīng)用于臨床檢測(cè)、食品檢測(cè)和環(huán)境監(jiān)測(cè)等。