惠董娜，任文娟，馮曉琴，雷鑫，王治平，劉建榮，李弘

(山西省人民醫(yī)院生殖醫(yī)學(xué)科，太原 030012)

人卵母細(xì)胞體外成熟培養(yǎng)(in vitro maturation，IVM)自1991年獲得首次成功妊娠后，取得了飛速發(fā)展，臨床上已不僅限于多囊卵巢綜合征(PCOS)的患者，而且在卵巢高/低反應(yīng)患者、癌癥患者生育力保存等方面也有了一定的應(yīng)用[1]。目前，全世界范圍內(nèi)應(yīng)用IVM技術(shù)出生的健康嬰兒大約有5 000個(gè)，臨床妊娠率可達(dá)到35%～40%[2]。雖有研究報(bào)道人未成熟卵母細(xì)胞經(jīng)IVM后的成熟率可達(dá)70%，但I(xiàn)VM卵母細(xì)胞的發(fā)育潛能仍低于體內(nèi)成熟的卵母細(xì)胞，表現(xiàn)在受精后卵裂率低、囊胚形成率和種植率低等方面[3]，成為限制該技術(shù)應(yīng)用和發(fā)展的重要因素之一?，F(xiàn)有的培養(yǎng)體系多為單純添加一些物質(zhì)，難以達(dá)到卵母細(xì)胞IVM的最佳條件，影響卵母細(xì)胞IVM及隨后的發(fā)育潛能[4]。本研究通過(guò)在培養(yǎng)液中添加成熟卵母細(xì)胞的顆粒細(xì)胞復(fù)合體，建立共培養(yǎng)體系，模擬體內(nèi)卵母細(xì)胞生長(zhǎng)的微環(huán)境，探索更適合ICSI-ET周期中卵母細(xì)胞IVM的培養(yǎng)條件，以期取得更好的IVM效果。

資料與方法

一、研究對(duì)象

根據(jù)《臨床診療指南-輔助生殖技術(shù)與精子庫(kù)分冊(cè)》的標(biāo)準(zhǔn)，收集2015年1月至2017年6月在我院生殖醫(yī)學(xué)科接受ICSI-ET治療的156例不育患者促排卵周期中廢棄的未成熟卵母細(xì)胞為研究對(duì)象?；颊吣挲g21～38歲，平均年齡(29.96±4.37)歲，不孕年限1～10年，平均年限(3.82±2.67)年，治療指征包括輸卵管阻塞、少弱畸精子癥和無(wú)精子癥等。排除PCOS及子宮內(nèi)膜異位癥患者。本研究獲得山西省人民醫(yī)院生殖醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，經(jīng)患者知情同意后簽字進(jìn)入本研究。

二、方法

1.卵母細(xì)胞采集：采用促性腺激素釋放激素激動(dòng)劑(GnRH-a，注射用醋酸曲普瑞林，輝凌制藥，德國(guó))和促性腺激素(FSH/HMG，果納芬，雪蘭諾，瑞士)聯(lián)合長(zhǎng)/短方案及微刺激方案。卵泡直徑達(dá)到18 mm后，肌注HCG，36 h后B超引導(dǎo)下經(jīng)陰道穿刺取卵，采集卵冠丘復(fù)合體(OCCC)，取發(fā)育未成熟卵母細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)。

2.收集未成熟卵母細(xì)胞：符合研究標(biāo)準(zhǔn)且擬行ICSI-ET治療的患者，取卵日收集OCCC后繼續(xù)培養(yǎng)2～4 h后，用透明質(zhì)酸酶80 U/ml(Quinn’s，SAGE，美國(guó))處理OCCC，以機(jī)械法剝除卵丘顆粒細(xì)胞，在倒置鏡下觀察卵母細(xì)胞成熟度。剝除卵丘顆粒細(xì)胞的卵母細(xì)胞按成熟度分為：MⅡ期，即成熟卵母細(xì)胞，可見(jiàn)第一極體；MⅠ期，無(wú)第一極體也無(wú)生發(fā)泡；GV期，可見(jiàn)生發(fā)泡，收集MⅠ期、GV期卵母細(xì)胞用于IVM培養(yǎng)。

3.培養(yǎng)液及顆粒細(xì)胞復(fù)合體的準(zhǔn)備：(1)IVM培養(yǎng)液的配制：HTF培養(yǎng)基+10%SPS+20%hFF +75 U/L FSH+75 U/L LH，充分混勻并用0.22 μm過(guò)濾器過(guò)濾，制成30 μl微滴置于共培養(yǎng)皿微孔中，覆蓋礦物油，置于5%CO2培養(yǎng)箱中平衡；(2)卵丘顆粒細(xì)胞復(fù)合體的剝離：選取同一患者呈旭日狀、放射冠與卵丘界限分明且具有粘附培養(yǎng)皿傾向的成熟的高質(zhì)量卵母細(xì)胞，體視顯微鏡下(20×)用1 ml注射器前端針尖切割部分卵丘顆粒細(xì)胞團(tuán)塊組織，測(cè)微尺測(cè)量卵丘顆粒細(xì)胞團(tuán)在500 μm，巴氏德吸管吸出，在未成熟卵母細(xì)胞培養(yǎng)液中洗滌數(shù)次，置于未成熟卵共培養(yǎng)皿微滴中。

4.未成熟卵母細(xì)胞分組及培養(yǎng)：將收集到的MⅠ、GV期未成熟卵母細(xì)胞以隨機(jī)方式分組到對(duì)照組(C組，培養(yǎng)時(shí)不添加顆粒細(xì)胞復(fù)合體)和實(shí)驗(yàn)組(T組，培養(yǎng)時(shí)添加顆粒細(xì)胞復(fù)合體)中進(jìn)行培養(yǎng)，并按照MⅠ期和GV期未成熟卵母細(xì)胞的不同分為4個(gè)亞組：MⅠ-C組、MⅠ-T組和GV-C組、GV-T組。對(duì)照組是將隨機(jī)入組的未成熟卵母細(xì)胞置于IVM培養(yǎng)液配制的共培養(yǎng)皿微滴中；實(shí)驗(yàn)組將隨機(jī)入組的未成熟卵母細(xì)胞置于IVM培養(yǎng)液配制的共培養(yǎng)皿微滴中，并加入同一患者的成熟卵母細(xì)胞的顆粒細(xì)胞復(fù)合體，將上述分組的未成熟卵母細(xì)胞置于5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)。

5.ICSI及胚胎培養(yǎng)：分別于培養(yǎng)后24 h、48 h觀察卵母細(xì)胞的成熟情況，以排出第一極體為準(zhǔn)，判斷為成熟的MⅡ期卵母細(xì)胞，取出24 h成熟的卵母細(xì)胞后進(jìn)行ICSI方式受精，受精后轉(zhuǎn)入含卵裂液的胚胎培養(yǎng)皿中，在5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)至第6 d，觀察并記錄胚胎發(fā)育情況。ICSI所用精子來(lái)自于同一患者前一日受精后留存的精子或當(dāng)日IVF/ICSI受精后患者廢棄的精子。卵裂期胚胎評(píng)分按照我科常規(guī)進(jìn)行[5]，囊胚期評(píng)分采用Gardner標(biāo)準(zhǔn)[6]。

6.觀察指標(biāo)：觀察體外培養(yǎng)未成熟卵母細(xì)胞的成熟率(培養(yǎng)成熟的MⅡ卵數(shù)/培養(yǎng)的卵母細(xì)胞數(shù))、正常受精率(2PN數(shù)/ICSI注射的卵母細(xì)胞數(shù))、受精數(shù)(2PN+1PN+3PN/ICSI注射的卵母細(xì)胞數(shù))、卵裂率(卵裂胚胎數(shù)/2PN 受精數(shù))、優(yōu)質(zhì)胚胎率(優(yōu)質(zhì)胚胎數(shù)/卵裂胚胎數(shù))以及囊胚形成率(囊胚數(shù)/可移植胚胎數(shù))。

三、統(tǒng)計(jì)分析

結(jié) 果

一、未成熟卵母細(xì)胞IVM成熟情況的比較

本研究納入156例ICSI-ET患者，共收集到305枚未成熟卵母細(xì)胞，其中MⅠ期卵母細(xì)胞186枚，GV期卵母細(xì)胞119枚，以隨機(jī)方式入組到對(duì)照組(C組)和實(shí)驗(yàn)組(T組)進(jìn)行培養(yǎng)，MⅠ-C組91枚、MⅠ-T組95枚、GV-C組59枚、GV-T組60枚。MⅠ-T組體外培養(yǎng)24 h成熟76枚(成熟率80.00%)顯著高于MⅠ-C組(P<0.05)；GV-T組體外培養(yǎng)24 h的成熟率與對(duì)照組比較無(wú)顯著性差異(P>0.05)。體外培養(yǎng)48 h后，MⅠ-T及GV-T組卵母細(xì)胞成熟率顯著高于同期對(duì)照組(P<0.01)(表1)。

表1 未成熟卵母細(xì)胞IVM情況比較[n(%)]

注：與同期C組比較，*P<0.05，**P<0.01

二、未成熟卵母細(xì)胞體外培養(yǎng)24 h成熟后發(fā)育潛能的比較

體外培養(yǎng)24 h成熟的卵母細(xì)胞采用ICSI方式受精后觀察胚胎發(fā)育情況：(1)MⅠ-T組培養(yǎng)24 h成熟卵母細(xì)胞76枚，正常受精率69.74%(53/76)、受精率75.00%(57/76)及優(yōu)質(zhì)胚胎率35.56%(16/45)均顯著高于MⅠ-C組(P<0.05)；兩組的卵裂率比較無(wú)顯著性差異(P>0.05)。與MⅠ-C組比較，MⅠ-T組囊胚形成數(shù)有所增加，但尚無(wú)顯著性差異(P>0.05)；MⅠ-T組卵母細(xì)胞利用率21.05%(16/76)顯著高于MⅠ-C組(P<0.01)。(2)GV-T組與GV-C組的正常受精率、受精率及卵裂率比較均無(wú)顯著性差異(P>0.05)；GV-T組形成了1枚優(yōu)質(zhì)胚胎，但兩組均未發(fā)育成囊胚，因數(shù)量少未行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析；與GV-C組比較，GV-T組有一定的卵母細(xì)胞利用率，未行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析(表2)。

表2 未成熟卵母細(xì)胞體外培養(yǎng)24 h成熟后發(fā)育潛能比較(%)

注：與同期C組比較，*P<0.05，**P<0.01

討 論

IVM技術(shù)在預(yù)防卵巢過(guò)度刺激、高劑量促性腺激素治療所帶來(lái)的風(fēng)險(xiǎn)上有著很好的優(yōu)勢(shì)，已報(bào)道的IVM臨床妊娠率可達(dá)到45%～50%[7]，因此，更加深入地研究IVM可擴(kuò)大該技術(shù)的應(yīng)用范圍。常規(guī)促排卵周期中約有15%～20%的未成熟卵母細(xì)胞[8]，通常會(huì)將其直接廢棄，增加了部分患者的周期取消率。若能將這些卵母細(xì)胞充分利用，就可為他們?cè)黾右恍┤焉餀C(jī)會(huì)。目前，對(duì)促排卵周期聯(lián)合IVM的應(yīng)用存在一定的爭(zhēng)議，因促排卵周期中的未成熟卵母細(xì)胞經(jīng)過(guò)HCG扳機(jī)作用，阻斷了顆粒細(xì)胞上C型利鈉肽(CNP)前體的分泌，導(dǎo)致卵母細(xì)胞內(nèi)cAMP濃度降低，使減數(shù)分裂恢復(fù)啟動(dòng)，胞核成熟快于胞質(zhì)的成熟[9-11]，不同于通常意義上的IVM；而IVF/ICSI-ET周期中IVM的臨床應(yīng)用價(jià)值有限，還是能夠挽救一部分卵母細(xì)胞，各方觀點(diǎn)不同[11-13]。本研究采集到305枚未成熟卵母細(xì)胞，MⅠ期及GV期卵母細(xì)胞經(jīng)IVM 48 h后分別獲得了88.42%和65.00%的成熟卵率，MⅠ期來(lái)源成熟的卵母細(xì)胞正常受精率及優(yōu)質(zhì)胚胎率有所增加，并有一定數(shù)量的囊胚形成。我們認(rèn)為，體外促排卵周期中獲得的未成熟卵母細(xì)胞仍具有一定的發(fā)育潛能，可用來(lái)補(bǔ)充一次促排卵周期中胚胎的來(lái)源，提高卵母細(xì)胞的利用率。

IVM最為關(guān)鍵的環(huán)節(jié)是通過(guò)調(diào)整培養(yǎng)條件以滿足卵母細(xì)胞成熟所需的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，進(jìn)而促使卵母細(xì)胞恢復(fù)正常的減數(shù)分裂。目前，體外培養(yǎng)系統(tǒng)多以基礎(chǔ)培養(yǎng)基(如TCMl99、Ham’s、HTF等)中添加血清、蛋白質(zhì)、促性腺激素(FSH和LH)、生長(zhǎng)因子及類(lèi)固醇激素等為主，可發(fā)育為MⅡ卵母細(xì)胞，但胚胎發(fā)育潛能較低[14]。近年來(lái)，培養(yǎng)體系研究已從單因素轉(zhuǎn)向多因素聯(lián)合，將卵丘顆粒細(xì)胞與未成熟卵母細(xì)胞體外共培養(yǎng)成為一個(gè)受關(guān)注的研究點(diǎn)。Jahromi等[15]將未成熟卵母細(xì)胞與顆粒細(xì)胞共培養(yǎng)的成熟率為84.28%，可利用胚胎率75.00%，表明顆粒細(xì)胞能夠提高卵母細(xì)胞成熟率和胚胎發(fā)育潛能。顆粒細(xì)胞共培養(yǎng)通過(guò)模擬體內(nèi)卵巢“微環(huán)鏡”，與卵母細(xì)胞構(gòu)成縫隙連接，通過(guò)雙向交流，調(diào)節(jié)其成熟和發(fā)育能力，并可獲得與體內(nèi)成熟卵母細(xì)胞更為相似的基因表達(dá)譜[16]。本研究實(shí)驗(yàn)組中利用共培養(yǎng)皿上相互連通的培養(yǎng)孔建立了一個(gè)共培養(yǎng)體系，將剝離的顆粒細(xì)胞復(fù)合體置入以模擬體內(nèi)的生長(zhǎng)環(huán)境，使顆粒細(xì)胞復(fù)合體發(fā)揮旁分泌和自分泌作用，促進(jìn)卵母細(xì)胞成熟和進(jìn)一步發(fā)育。體外培養(yǎng)48 h后，與同期對(duì)照組相比，MⅠ-T組和GV-T組的卵母細(xì)胞總成熟率(分別為88.42%和65.00%)顯著升高(P<0.01)。本研究進(jìn)一步評(píng)估了成熟后卵母細(xì)胞的發(fā)育潛能，MⅠ期卵母細(xì)胞在含顆粒細(xì)胞復(fù)合體的培養(yǎng)液中培養(yǎng)24 h的成熟率為80.00%、正常受精率69.74%、受精率75.00%及優(yōu)質(zhì)胚胎率35.56%均顯著高于對(duì)照組(P<0.05)，且囊胚形成數(shù)也有所增加，表明顆粒細(xì)胞復(fù)合體在卵母細(xì)胞成熟中發(fā)揮著一定的作用。本研究中，MⅠ-T組的卵母細(xì)胞亦獲得了較好的卵母細(xì)胞利用率，與之前報(bào)道的研究結(jié)果[4]相似。GV期卵母細(xì)胞培養(yǎng)24 h后，GV-T和GV-C兩組間各指標(biāo)比較均無(wú)顯著性差異(P>0.05)，GV期卵母細(xì)胞雖能發(fā)育成熟，但未能形成囊胚，添加顆粒細(xì)胞復(fù)合體的培養(yǎng)體系效果不夠理想。推測(cè)其可能的原因有：(1)促排卵周期中大劑量促性腺激素的作用，使得GV期卵母細(xì)胞發(fā)育受到主導(dǎo)卵泡的影響；(2)本研究中的培養(yǎng)條件還不足以滿足GV期卵母細(xì)胞胞質(zhì)的成熟，可能與基礎(chǔ)培養(yǎng)液、培養(yǎng)環(huán)境、培養(yǎng)時(shí)間等因素相關(guān)[17]；(3)獲取的GV期卵母細(xì)胞存在一些內(nèi)在缺陷，在體內(nèi)生長(zhǎng)過(guò)程中受到了一定的抑制。

綜上，IVM技術(shù)應(yīng)用和發(fā)展了已有20余年，但受體外培養(yǎng)體系和胚胎發(fā)育潛能低等因素的影響，仍處于實(shí)驗(yàn)階段，不能被廣泛地應(yīng)用于臨床。本研究積極探索體外培養(yǎng)體系，通過(guò)體外構(gòu)建含顆粒細(xì)胞復(fù)合體的共培養(yǎng)體系，提高了促排卵周期中不同來(lái)源未成熟卵母細(xì)胞的成熟率，改善了MⅠ期卵母細(xì)胞成熟后胚胎的發(fā)育潛能；而GV期卵母細(xì)胞成熟后的發(fā)育潛能尚不理想。本研究為我們后續(xù)的深入探索提供了方向，同時(shí)，我們也觀察到對(duì)促排卵周期中獲得的GV期未成熟卵母細(xì)胞可能需要在入選標(biāo)準(zhǔn)上做進(jìn)一步研究，以提高IVM的效率和成果。