黃慧 楊穎 王衛(wèi)云 陳芳 楊帆 成晨 陳欣林* 郭健*

(1. 湖北省婦幼保健院 超聲診斷科，湖北 武漢 430070；2. 深圳華大生命科學(xué)研究院，廣東 深圳 518120)

法洛四聯(lián)癥(tetralogy of Fallot，TOF)是一種常見的嚴(yán)重性心臟病，臨床癥狀為肺動(dòng)脈狹窄、主動(dòng)脈騎跨、室間隔缺損和右心室肥大[1]。在胎兒中，其主要表現(xiàn)為肺動(dòng)脈狹窄、主動(dòng)脈騎跨和室間隔缺損[2,3]。它是最常見的發(fā)紺型先天性心臟病之一，在活產(chǎn)兒中的發(fā)生率為1/3000，占到了主要先心病的10%[4]。隨著外科手術(shù)和藥物治療的巨大進(jìn)步，TOF導(dǎo)致的早期致死很少見，但是有長(zhǎng)期后遺癥，包括心臟功能障礙、心律不齊和生活質(zhì)量下降，仍然是TOF患者人群的挑戰(zhàn)[5,6]。和大多數(shù)先天性心臟病一樣，目前我們對(duì)TOF的病因了解較少。更好地了解TOF可能的原因?qū)⒂兄谏钊肓私釺OF的病理生物學(xué)基礎(chǔ)，有助于改善疾病風(fēng)險(xiǎn)。

據(jù)研究表明，法洛四聯(lián)癥與產(chǎn)前感染、致畸物暴露、母親疾病，以及遺傳物質(zhì)改變等因素密切相關(guān)[1]?；加蟹逅穆?lián)癥的孕婦的后代中，先天性心臟病的發(fā)生率約為3.1%，說明遺傳因素在心臟發(fā)育中具有重要貢獻(xiàn)[7,8]。研究表明，一些與心臟發(fā)育的信號(hào)通路中的基因改變，包含心臟轉(zhuǎn)錄因子基因(NKX2.5、TBX1、TBX5和GATA4)或跨膜受體NOTCH1和NOTCH2及其配體JAG1的單倍劑量不足，會(huì)引發(fā)法洛四聯(lián)癥及其他心臟缺陷[9]。染色體22q11.2微缺失及21、18或13-三體，也會(huì)導(dǎo)致出現(xiàn)法洛四聯(lián)癥癥狀[5]，其中染色體22q11.2缺失或21-三體在法洛四聯(lián)癥患者的檢出率較高，分別占到了TOF患者的15%和7%[10,11]。但是這些患者通常具有多種非心臟異常。盡管對(duì)法洛四聯(lián)癥相關(guān)的遺傳物質(zhì)改變的報(bào)道較多，對(duì)于單純性和散發(fā)性的法洛四聯(lián)癥的報(bào)道較少。Greenway等[1]使用高分辨率芯片對(duì)114例單純性法洛四聯(lián)癥患者及其父母的拷貝數(shù)變異(copy numbervariations，CNVs)進(jìn)行研究，觀察到10%的散發(fā)性非綜合征法洛四聯(lián)癥病例是由新發(fā)CNVs突變引起的，說明單純性法洛四聯(lián)癥與CNVs密切相關(guān)。

在目前的臨床實(shí)踐中，核型分析結(jié)合染色體微陣列分析被認(rèn)為是檢測(cè)拷貝數(shù)變異的金標(biāo)準(zhǔn)[12]。然而，隨著測(cè)序技術(shù)的發(fā)展，全基因組低深度測(cè)序技術(shù)已被證實(shí)為可用于CNVs檢測(cè)，是一種可行的CMA替代方法[12-19]。Wang等[13]通過對(duì)3429例羊膜穿刺樣本的染色體非整倍體和CNV分析發(fā)現(xiàn)，全基因組低深度測(cè)序技術(shù)在臨床胎兒樣本檢測(cè)中具有很高的特異性和重復(fù)性。由于目前關(guān)于胎兒?jiǎn)渭冃苑逅穆?lián)癥與染色體異常(包含染色體非整倍體和拷貝數(shù)變異)的報(bào)道較少[1]，本研究擬采用全基因組低覆蓋度測(cè)序技術(shù)檢測(cè)引產(chǎn)的單純性法洛四聯(lián)癥胎兒的染色體異常，初步探討單純性法洛四聯(lián)癥胎兒的遺傳學(xué)特征。

1 材料和方法

1.1 研究對(duì)象 選取2014年1月至2017年12月因胎兒心臟發(fā)育異常在湖北省婦幼保健院進(jìn)行產(chǎn)前超聲會(huì)診的中孕期孕婦，進(jìn)行胎兒心臟超聲系統(tǒng)篩查及胎兒超聲心動(dòng)圖檢查，所有超聲篩查均按照國(guó)際婦產(chǎn)超聲學(xué)會(huì)推薦的規(guī)范化指南[20]進(jìn)行。入組胎兒經(jīng)由2名胎兒心臟超聲專家會(huì)診，排除心臟合并畸形和心外畸形，最終確診為單純性法洛四聯(lián)癥。對(duì)胎兒超聲心動(dòng)圖結(jié)果進(jìn)行多學(xué)科預(yù)后咨詢后決定終止妊娠的孕婦，在其及家屬充分知情同意后，留取胎兒樣本進(jìn)行病理解剖，最終獲得經(jīng)產(chǎn)前超聲會(huì)診及/或病理解剖確診為單純性法洛四聯(lián)癥的胎兒24例。孕婦年齡22～38(30.2±4.8)歲，終止妊娠時(shí)孕周20～38(25.1±4.2)周，均為單胎妊娠。本研究經(jīng)湖北省婦幼保健院醫(yī)學(xué)倫理學(xué)委員會(huì)批準(zhǔn)，并獲得終止妊娠孕婦及家屬簽署的同意胎兒病理解剖及遺傳學(xué)檢查的知情同意書。

1.2 主要儀器和試劑 QIAamp DNA試劑盒(Qiagen公司)；NanoDrop分光光度計(jì)(Thermo Fisher Scientific公司)；BGISEQ-500測(cè)序平臺(tái)(華大基因)。

1.3 檢測(cè)方法 對(duì)于終止妊娠的胎兒，取近胎兒端臍帶組織，立即保存于-80℃，并送往深圳華大基因研究院進(jìn)行遺傳檢測(cè)。使用QIAamp DNA試劑盒提取胎兒臍帶組織的基因組DNA，用1%瓊脂糖凝膠電泳分析DNA降解程度以及是否有RNA污染，用NanoDrop分光光度計(jì)測(cè)定DNA濃度和純度。對(duì)于所有通過質(zhì)量控制(>500ng；吸光度OD260/OD280>1.8；吸光度OD260/OD230>1.5)的基因組DNA，采用華大基因BGISEQ-500測(cè)序平臺(tái)，按照BGISEQ-500標(biāo)準(zhǔn)操作流程，進(jìn)行DNA文庫(kù)構(gòu)建和測(cè)序，最小精度100kb，測(cè)序深度1乘。采用Dong等[21]的方法進(jìn)行染色體變異(包含非整倍體和100kb以上拷貝數(shù)變異)的全基因組低覆蓋度測(cè)序分析。參照美國(guó)醫(yī)學(xué)遺傳學(xué)會(huì)[22,23]的解讀流程，對(duì)檢測(cè)出來的不小于100 kb的拷貝數(shù)變異進(jìn)行致病、疑似致病、意義不明疑似良性和良性的判定。CNVs(重復(fù))采用QPCR驗(yàn)證，CNVs(缺失)采用PCR及瓊脂糖凝膠電泳驗(yàn)證。

2 結(jié)果

24例單純性法洛四聯(lián)癥胎兒中，無染色體非整倍檢出，5例胎兒檢出有CNVs。其中3例檢出有致病性CNVs(12.5%，3/24)，1例檢出有致病性和疑似致病性CNVs(4.17%，1/24)，1例檢出有疑似致病CNVs(4.17%，1/24)，無意義不明疑似良性或良性CNVs檢出(見表1)。5例胎兒共檢出7處異常CNVs，其中檢出有1Mb以上CNVs有4例，1 Mb以下CNVs有2例，相關(guān)的綜合征包含DiGeorge綜合征(4例)，8p倒位重復(fù)伴末端缺失綜合征(待驗(yàn)證，1例)。

表1 低深度基因組測(cè)序檢出的單純性法洛四聯(lián)癥胎兒中致病和疑似致病拷貝數(shù)變異一覽表

3 討論

法洛四聯(lián)癥是最嚴(yán)重的發(fā)紺型先天性心臟病，世界范圍內(nèi)新生兒患病率約為1/3000[4]，占所有先天性心臟病患兒的5%。TOF 是一種多病因的復(fù)雜性疾病，一般認(rèn)為有遺傳因素和環(huán)境因素的參與。大量研究表明遺傳因素在法洛四聯(lián)癥的發(fā)病機(jī)制中具有重要的作用。Bellucco等[24]研究發(fā)現(xiàn)，大約30%的法洛四聯(lián)癥患者具有染色體異常；McDonald-McGinn等[25]研究發(fā)現(xiàn)，產(chǎn)前診斷為法洛四聯(lián)癥的患者中，16%的患者檢出有22q11.2微缺失，這些研究表明染色體異常與法洛四聯(lián)癥密切相關(guān)。在目前的臨床實(shí)踐中，核型分析結(jié)合染色體微陣列分析被認(rèn)為是檢測(cè)拷貝數(shù)變異的金標(biāo)準(zhǔn)。隨著測(cè)序技術(shù)的發(fā)展，全基因組低深度測(cè)序也可用于拷貝數(shù)變異的檢測(cè)，除了具有可靠性、準(zhǔn)確性和可重復(fù)性外，還由一些重要的實(shí)驗(yàn)室優(yōu)勢(shì)，包括高效的實(shí)驗(yàn)室工作流程、測(cè)序周期短(<12小時(shí))、DNA模板用量低(小于10ng)，可同時(shí)對(duì)樣本進(jìn)行批量測(cè)序，試劑成本更低[13]。Wang等[13]通過對(duì)3429例羊水組織的拷貝數(shù)變異分析，認(rèn)為低深度基因組測(cè)序可以作為普通高危妊娠孕婦的拷貝數(shù)變異的首選檢測(cè)方法。

本研究應(yīng)用全基因組低深度測(cè)序技術(shù)檢測(cè)單純性法洛四聯(lián)癥胎兒的染色體異常，共檢出5例胎兒存在CNVs，其中4例發(fā)現(xiàn)致病性CNVs，陽性率為16.7%(4/24)。目前關(guān)于單純性法洛四聯(lián)癥患者的拷貝數(shù)變異的報(bào)道較少。Greenway等[1]使用高分辨率基因芯片對(duì)114例單純性法洛四聯(lián)癥患者及其父母的CNVs研究發(fā)現(xiàn)，至少10%的散發(fā)性單純性法洛四聯(lián)癥是由CNVs新發(fā)突變引起的。Aguayo-Gomez等[26]采用多重連接探針擴(kuò)增技術(shù)(multiplex ligation-dependent probe amplification，MLPA)，在52位單純性法洛四聯(lián)癥患者中發(fā)現(xiàn)了1例CNVs自發(fā)突變。這些研究都說明單純性法洛四聯(lián)癥與CNVs密切相關(guān)。

染色體22q11.2缺失綜合征，這也被稱為DeGorge綜合征，是先天性心臟病的常見病因之一，在不同類型的先天性心臟病中檢出率為0～18%[24，27-29]。在22q11.2缺失綜合征患者中，法洛四聯(lián)癥，主動(dòng)脈弓離斷，室間隔缺損和永存動(dòng)脈干是最常見的心臟異常。已報(bào)發(fā)表的文章中，法洛四聯(lián)癥患者中22q11.2缺失的檢出率為0～18%[24.27，30]。在本研究中，16.7%(4/24)的患者檢出了22q11.2微缺失，其中3例為致病，1例為疑似致病。IG20154609患者檢出的22q11.21區(qū)段的缺失為疑似致病突變，片段大小為0.12Mb，該片段包括4個(gè)基因(PRODH、DGCR5、DGCR9、DGCR6)，其中DGCR6基因是22q11.2缺失綜合征(DiGeorge綜合征)的關(guān)鍵區(qū)域基因。胎兒IG20160988、IG20155445和IG20162966檢出有22q11.21區(qū)段缺失，為致病突變，片段大小為1.43～2.64Mb，包含43～66個(gè)基因。

IG20160988除了檢出在致病性的22q11.21區(qū)段缺失，還檢出有16p13.3區(qū)段缺失，為疑似致病，片段大小為0.11Mb，該片段包括1個(gè)基因(RBFOX1)。文獻(xiàn)報(bào)道RBFOX1基因缺陷與多種臨床癥狀有關(guān)，包括顱內(nèi)蛛網(wǎng)膜囊腫、智力障礙、發(fā)育遲緩、小頭畸形或巨頭畸形、先天性心臟病、腎臟畸形、骨骼畸形、原發(fā)性膽汁性肝硬化、癲癇、注意力缺陷多動(dòng)障礙、自閉癥、雙相情感分裂情感障礙等[31-35]。

胎兒IG20161472檢出有8號(hào)染色體8p23.1p23.3區(qū)段有約7.15Mb缺失，該片段包括33個(gè)基因；8號(hào)染色體8p21.2p23.1區(qū)段內(nèi)有12.9 Mb的重復(fù)，該片段包括96個(gè)基因。該缺失和重復(fù)為疑似CNVs致病，相關(guān)的綜合征可能為8p倒位重復(fù)伴末端缺失綜合征(ORPHA：96092)。該綜合征在新生兒中患病率估計(jì)為1/22 000～1/30 000，特征是8號(hào)染色體短臂(8p)部分倒位重復(fù)，并伴末端缺失[36]。該綜合征是一種罕見的染色體異常，臨床表現(xiàn)包括精神發(fā)育遲滯、面部畸形、中樞神經(jīng)系統(tǒng)異常、肌張力減退、骨科異常、脊柱側(cè)凸/脊柱后凸和先天性心臟病等[36-41]。但是由于該檢測(cè)技術(shù)方法限制，不能檢測(cè)出倒置這種染色體異常，此外，建議結(jié)合臨床。建議父母進(jìn)行核型及染色體微重復(fù)/缺失檢查及遺傳咨詢。

本研究采用低深度全基因組測(cè)序的方法，在引產(chǎn)的單純性法洛四聯(lián)癥胎兒中，5例檢出有CNVs，其中4例為致病性CNVs，陽性率為 16.7%(4/24)，說明CNVs與單純性法洛四聯(lián)癥密切相關(guān)，建議對(duì)產(chǎn)前檢出有單純性法洛四聯(lián)癥的胎兒進(jìn)行拷貝數(shù)變異的檢查。本研究由于種種原因，未對(duì)檢出有拷貝數(shù)變異的胎兒父母進(jìn)行拷貝數(shù)變異的檢查。由于部分CNVs遺傳自父母，建議對(duì)胎兒父母雙方進(jìn)行CNVs檢測(cè)，以確定患者變異來源于父母遺傳還是新發(fā)變異，對(duì)指導(dǎo)胎兒畸形孕史患者的下次妊娠及產(chǎn)前診斷具有重要的意義。