張衍軍，王志杰，王天儀，陳學(xué)明，崔利賓，許崧杰，袁鑫，劉亞東，趙鵬，吳啟超

1.首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京潞河醫(yī)院骨科，北京市101149；2.承德醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院兒內(nèi)科，河北承德市067000；3.解放軍266醫(yī)院骨一科，河北承德市067000

脊髓損傷是具有高發(fā)病率、高致殘率、高花費、低齡化特點的中樞神經(jīng)系統(tǒng)創(chuàng)傷性疾病[1-2]。近年來隨著經(jīng)濟發(fā)展和社會建設(shè)，脊髓損傷發(fā)病率逐年升高[3]。脊髓損傷不但嚴重影響患者的生命健康和生活質(zhì)量，其治療所需的高花費也給家庭、社會帶來極大負擔(dān)。因此，行之有效的脊髓損傷治療方案是整個社會亟待尋求的目標。

微RNA(microRNA,miRNA)是一類長19～25個核苷酸的非編碼RNA，通過靶向靶基因3 "非編碼區(qū)，從而在翻譯水平抑制靶基因的表達[4-5]。miRNA參與生物體生長、發(fā)育和疾病的發(fā)生、發(fā)展等過程[6-7]，也參與神經(jīng)細胞的分化、成熟，神經(jīng)介質(zhì)的釋放等復(fù)雜的分子生物學(xué)過程[8]。信號傳導(dǎo)子和轉(zhuǎn)錄激活子(signal transducer and activator of transcription,STAT)3是STAT家族中的一員，作為轉(zhuǎn)錄因子，對基因表達具有重要的調(diào)控作用[9-10]。STAT3作為上游轉(zhuǎn)錄因子，能夠促進生長相關(guān)蛋白(growth-associated protein 43,GAP43)在神經(jīng)元中的表達，從而促進神經(jīng)元軸突的再生[3,11-12]。

脊髓損傷發(fā)生后，脊髓中上行感覺傳導(dǎo)和下行運動傳導(dǎo)纖維束遭到破壞，軸突與其神經(jīng)元胞體分離并導(dǎo)致瓦勒式變性(Wallerian degeneration)[13]。為了重建神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)恢復(fù)功能，神經(jīng)元自身所擁有的較弱的修復(fù)本能會使其軸突通過再生、塑形、出芽等方式在有限范圍內(nèi)生長[14-16]。本研究通過監(jiān)測脊髓損傷后發(fā)生顯著表達變化的miRNA，運用生物信息學(xué)方法找到具有生物學(xué)意義的miRNA并通過分子生物學(xué)方法進行驗證，為脊髓損傷的治療找到關(guān)鍵的治療靶點。

1 材料與方法

1.1 動物實驗分組

雌性Wistar大鼠15只，體質(zhì)量(220±10)g，由中國軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院實驗動物中心提供，隨機分組為對照組(n=3)和脊髓損傷組(n=12)。脊髓損傷組在脊髓損傷后4 h、3 d、7 d、14 d(T1～T4)取材。每個時間點3只。

本研究方案通過首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京潞河醫(yī)院倫理委員會審批。

1.2 方法

1.2.1 造模

10%水合氯醛0.33 ml/100 g腹腔麻醉成功后，備皮、消毒，以T10節(jié)段棘突為標志點，切開皮膚，長約2 cm，鈍性分離皮下筋膜、椎旁肌，顯露T9～T11胸椎椎板，咬骨鉗完整咬除T10椎板，充分暴露T10節(jié)段脊髓組織，以微型眼科剪剪取脊髓組織2 mm，充分止血后關(guān)閉傷口。腹腔注射頭孢唑林預(yù)防感染，每天0.5 ml，共 3 d[17]。

1.2.2 取材

10%水合氯醛0.33 ml/100 g腹腔麻醉后，用冷PBS灌注。手術(shù)暴露脊髓組織，取以T10損傷處為中心的脊髓標本，共2 cm。

1.3 總RNA抽提

使用mirⅤanaTM RNA提取工具盒提取總RNA。使用杜恩斯勻漿器手動研磨脊髓組織，研磨在10倍于脊髓標本體積的Lysis/Binding Buffer中進行，充分研磨后將勻漿液放入Lysis/Binding Buffer快速混勻后轉(zhuǎn)移到新的離心管中。在勻漿液中添加1/10體積的miRNA勻漿添加劑，充分勻漿后0℃孵育10 min。隨后加入等體積的三氯甲烷后震蕩30～60 s后離心，10 000 r/min，共5 min；取上清加入1.25倍體積的無水乙醇震蕩混勻，反復(fù)過純化柱后離心，10 000 r/min，共 15 s。700 μl wash 1 清洗純化柱后，500 μl wash 2/3清洗純化柱2次。將離心柱放在新的收集管中，加入100 μl預(yù)熱的Elution Solution(95℃)，室溫下離心，10 000 r/min，共30 s。收集管中液體即為總RNA，置于-80℃冰箱保存。

1.4 數(shù)據(jù)分析

本實驗應(yīng)用Affymetrix miRNA 3.0芯片。利用NanoDrop ND-2100(Thermo Scientific)定量總RNA，并用Agilent 2100(Agilent Technologies)檢測RNA完整性。質(zhì)檢確定樣品可用性后，按照基因芯片標準方案進行試驗，對樣本標記、芯片雜交并洗脫。采用Affymetrix Scanner 3000(美國AFFYMETRⅠX公司)掃描得到原始圖像。使用Expression Console(version 1.3.1,美國AFFYMETRⅠX公司)數(shù)據(jù)分析軟件對所得的掃描原始圖像進行分析，將所得原始數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)化為RMA標準化算法信號值，應(yīng)用分層聚類分析的方法對不同分組中差異表達的miRNA進行分析。

1.5 逆轉(zhuǎn)錄實時定量聚合酶鏈反應(yīng)(reverse transcription real-time quantitative polymerase chain reaction,RT-qPCR)

采用RT-qPCR檢測miR-20a-3p表達。采用miS-criptⅠⅠReverse Transcription Kit(德國 QⅠAGEN 公司)和PrimerScript RT reagent Kit(日本TaKaRa公司)分別進行miRNA和mRNA的檢測。應(yīng)用U6作為miRNA表達的內(nèi)參，應(yīng)用GAPDH mRNA作為mRNA表達的內(nèi)參。

1.6 Western blotting

采用Western blotting技術(shù)檢測STAT3表達量。RⅠ-PA裂解液(加入蛋白酶抑制劑)加入到取材的脊髓樣品中，提取不同分組樣本中的總蛋白。樣品中蛋白經(jīng)過SDS-PAGE電泳分離，轉(zhuǎn)膜到PⅤDF膜上，隨后放入緩沖液中37℃封閉2 h，加入一抗，4℃孵育過夜，二抗后，ECL化學(xué)發(fā)光試劑檢測[18]。

1.7 細胞培養(yǎng)及轉(zhuǎn)染

為了驗證體內(nèi)篩選出的miRNA是否具有調(diào)控神經(jīng)元軸突生長的作用，在體外培養(yǎng)神經(jīng)元中調(diào)控miR-20a-3p。取新生1～2 d的Wistar大鼠大腦皮層，嚴格無菌操作，將皮層剪碎后放入高糖DMEM培養(yǎng)基中，放入培養(yǎng)板，待4 h神經(jīng)元貼壁后，更換為Neurobasal添加維生素B27的完全神經(jīng)元培養(yǎng)基，培養(yǎng)3 d后進行下一步實驗。實驗分為control組(無任何處理的空白對照組)、scramble組(加入無意義的寡聚核苷酸序列對照組)和miR-20a-3p inhibitor組(加入抑制細胞內(nèi)miR-20a-3p抑制劑的實驗組)。按照說明書將scramble、miR-20a-3p inhibitor序列(中國 GENEPHARMA公司)進行轉(zhuǎn)染(中國YⅠJUN公司)。轉(zhuǎn)染24 h后更換培養(yǎng)基后繼續(xù)培養(yǎng)3 d，隨后進行細胞免疫熒光染色檢測軸突長度。

1.8 細胞免疫熒光染色

將4%多聚甲醛1 ml液放置6孔板上，室溫固定15 min；PBST液分別清洗各個標本3次，每次2 min；用0.5%Triton X-100液孵育10 min；PBST液分別清洗標本各3次，每次2 min；封閉血清，孵育30 min；吸棄封閉液后PBST清洗3次，每次5 min，加入一抗，4℃孵育過夜；PBST液分別清洗各標本3次，每次5 min；用Cy3標記的熒光二抗在37℃孵育30 min；PBST液清洗3次，每次5 min；細胞核染色使用DAPⅠ，室溫孵育30 min，雙蒸水沖洗10 min；甘油封片，熒光顯微鏡照相。

本研究用Ⅰmage-Pro Plus 6.0軟件對實驗圖像進行分析，每個指標隨機抽取5張圖片，每張圖片隨機取5個不同視野，手動計數(shù)神經(jīng)元的軸突長度[4]。

1.9 統(tǒng)計學(xué)分析

采用SPSS 17.0軟件對本研究中所得的數(shù)據(jù)進行分析。計量資料以(xˉ±s)表示。組間比較采用單因素方差分析(ANOⅤA)和SNK檢驗。兩樣本比較采用Student t檢驗。顯著性水平α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 脊髓損傷大鼠的MicroRNA表達譜分析

基因芯片所得數(shù)據(jù)顯示，脊髓損傷組與對照相比在脊髓損傷后各時間點，共有658個miRNA發(fā)生表達變化。見圖1。其中miR-20a-3p在脊髓損傷后表達明顯上調(diào)，miR-20a-3p在7 d和14 d時間點上調(diào)倍數(shù)排名分別為第7。RT-qPCR檢測miR-20a-3p表達結(jié)果與基因芯片結(jié)果一致。見圖2。上述結(jié)果使得miR-20a-3p納入研究者視線。

2.2 miR-20a-3p靶基因預(yù)測

使用TargetScan數(shù)據(jù)庫對miR-20a-3p可能靶向的基因進行預(yù)測，預(yù)測結(jié)果顯示miR-20a-3p的靶基因可為STAT3。見表1。

2.3 STAT3蛋白變化趨勢

Western blotting結(jié)果顯示，脊髓損傷后，STAT3蛋白表達相對于對照組7 d和14 d時均下調(diào)，與miR-20a-3p的表達趨勢相反。見圖3、圖4。

2.4 miR-20a-3p通過STAT3影響神經(jīng)元軸突生長

實驗結(jié)果顯示，與control組相比，miR-20a-3p抑制組的神經(jīng)元生長狀態(tài)相對較好，軸突明顯延長。見圖5、圖6。Western blotting結(jié)果顯示，與對照組相比，miR-20a-3p inhibitor組STAT3蛋白表達上調(diào)。見圖7、圖8。

3 討論

脊髓損傷后基因芯片結(jié)果顯示miR-20a-3p明顯上調(diào)，提示miR-20a-3p可能參與脊髓損傷后的病理生理過程。經(jīng)過數(shù)據(jù)庫預(yù)測發(fā)現(xiàn)其靶基因可能為STAT3，體外實驗證實調(diào)控皮層神經(jīng)元中miR-20a-3p可以調(diào)控STAT3的表達，并且二者具有相反的表達趨勢，證實miR-20a-3p可以調(diào)控STAT3表達。進一步研究證實，miR-20a-3p參與調(diào)節(jié)皮層神經(jīng)元軸突生長過程。

圖1 脊髓損傷大鼠的MicroRNA表達譜分析

圖2 各組miR-20a-3p表達(RT-qPCR)

表1 TargetScan數(shù)據(jù)庫查詢預(yù)測miR-20a-3p的靶基因為STAT3

圖3 五組STAT3蛋白表達比較(Western blotting)

圖4 五組STAT3蛋白表達比較

本研究證實，miR-20a-3p可以靶向STAT3基因，從而靶向調(diào)節(jié)皮層神經(jīng)元軸突的生長。

脊髓中含有起源于大腦皮層運動神經(jīng)元的運動神經(jīng)纖維和起源于背根神經(jīng)節(jié)(dorsal root ganglion,DRG)神經(jīng)元的感覺神經(jīng)纖維。脊髓損傷后功能的恢復(fù)依賴于感覺纖維和運動纖維的再生。脊髓損傷不同于外周神經(jīng)損傷，大量研究證實，外周神經(jīng)損傷后軸突可以再生，而中樞神經(jīng)系統(tǒng)軸突損傷后卻難以再生[19-20]。因此促進神經(jīng)元軸突的再生對于恢復(fù)脊髓損傷后的功能具有至關(guān)重要的作用。

隨著生物體生長發(fā)育，中樞神經(jīng)系統(tǒng)神經(jīng)再生能力逐漸下降，因其神經(jīng)生長相關(guān)基因表達下降，導(dǎo)致神經(jīng)元內(nèi)在生長能力下降[20-21]。miRNA作為調(diào)控細胞生物學(xué)過程的關(guān)鍵分子，通過調(diào)節(jié)神經(jīng)元內(nèi)部信號通路，在神經(jīng)系統(tǒng)中發(fā)揮重要的調(diào)控作用。近年來，miRNA可以作為診斷靶點和治療靶點在臨床及基礎(chǔ)研究中被大量報道[22-24]。

圖5 三組神經(jīng)元細胞免疫熒光染色(×200)

圖6 三組軸突長度比較

圖7 三組STAT3蛋白表達比較(Western blotting)

圖8 三組STAT3蛋白表達比較

Janssen等[25]報道，miRNA可以作為治療丙型病毒性肝炎的靶點，并且已經(jīng)進入二期臨床試驗；提示探究miRNA可以作為靶點參與坐骨神經(jīng)預(yù)損傷促進脊髓后索損傷修復(fù)的過程，針對關(guān)鍵miRNA的調(diào)控為找到替代坐骨神經(jīng)預(yù)損傷的治療策略帶來新的希望。STAT3是細胞內(nèi)部的重要轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)分子，在調(diào)節(jié)神經(jīng)元軸突再生中發(fā)揮重要作用，本研究發(fā)現(xiàn)miR-20a-3p可以靶向STAT3蛋白，從而調(diào)節(jié)皮層神經(jīng)元軸突內(nèi)在生長能力，發(fā)揮潛在的調(diào)控脊髓損傷后神經(jīng)元軸突再生的作用。

本研究從miRNA組學(xué)角度篩選出可能具有調(diào)控作用的miR-20a-3p，探討其調(diào)節(jié)脊髓損傷修復(fù)的機制。脊髓損傷后至少在任一時間窗發(fā)生改變的miRNA有658個，miR-20a-3p-STAT3通路可能只是其發(fā)揮作用的重要通路之一。期待后續(xù)實驗?zāi)軌虬l(fā)現(xiàn)更多的關(guān)鍵靶點與通路來進一步促進脊髓損傷修復(fù)。