吳敏 胡天寒

【摘 要】組織的固定是組織病理學(xué)中最基本的實(shí)驗(yàn)技術(shù)方法和技術(shù)手段，固定液的正確選擇對(duì)組織切片的制作、大體標(biāo)本的保存以及免疫組織化學(xué)的檢測(cè)等都有重要的意義，實(shí)驗(yàn)室里錯(cuò)誤選擇組織固定液的情況屢見不鮮，本文從組織固定的目的入手對(duì)常見固定液的分類和選擇做一個(gè)簡(jiǎn)單的探討以期對(duì)科研實(shí)驗(yàn)人員有所提醒和幫助。

【關(guān)鍵詞】組織;組織固定;固定液

中圖分類號(hào)： R361.2 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼： A文章編號(hào)： 2095-2457（2019）03-0136-002

DOI：10.19694/j.cnki.issn2095-2457.2019.03.057

An experimental review on the selection of tissue fixative solution

WU Min1 HU Tian-han2

（1.Department of Histology and Embryology， Wannan medical college， Wuhu Anhui 241002，China;

2. Experimental Training Center for Medical Information，Wannan medical college， Wuhu Anhui 241002，China）

【Abstract】Tissue fixation is the most basic experimental technique in histopathology. ? The correct selection of fixative is of great significance to the production of tissue section， the preservation of gross specimens and the detection of immunohistochemistry. The misselection of tissue fixatives in laboratories is common. This paper makes a simple discussion on the classification and selection of common fixatives and hope to give some reminders and help to researchers and experimenters.

【Key words】Tissue; Tissue fixation; Fixative solution

組織的固定是組織病理學(xué)[1-4]及其它科學(xué)實(shí)驗(yàn)[5-6]中最基本的實(shí)驗(yàn)技術(shù)方法和技術(shù)手段，無論是組織切片的制作還是大體標(biāo)本的保存，為保持其生前的狀態(tài)與結(jié)構(gòu)，均應(yīng)在取材后進(jìn)行及時(shí)有效的固定才能進(jìn)行后續(xù)的實(shí)驗(yàn)工作。

1 組織固定的目的

知其然必須先知其所以然，不了解組織固定的目的就談不上正確地選擇組織固定液，很多老師和同學(xué)自以為已經(jīng)了解了固定的目的，但實(shí)際常常是一知半解，組織固定的目的主要有：

（1）迅速阻止組織、細(xì)胞的自溶和腐敗;

（2）使細(xì)胞內(nèi)的蛋白質(zhì)、脂肪、糖、酶等成分凝固成不溶性的物質(zhì)，保持其生前的狀態(tài);

（3）使組織內(nèi)的各種成分產(chǎn)生不同的折光率，方便染色后的觀察與鑒別;

（4）使各種組織成分對(duì)不同的染料產(chǎn)生不同的親和力，使細(xì)胞各部易染;

（5）使組織硬化成組織快，方便制備組織切片;

（6）防止細(xì)胞過分收縮或膨脹，保持其原有的形態(tài)結(jié)構(gòu)。

2 組織固定液的分類及選擇

常見的組織固定液分為兩大類，由單一試劑組成的為單純固定液，由兩種或以上混合試劑組成的為混合固定液。

2.1 單純固定液

甲醛是最常使用的單純固定液之一，飽和的甲醛水溶液濃度為37-40%，用作固定液時(shí)的甲醛水溶液稱為福爾馬林，其甲醛濃度為4%，為一份飽和甲醛水溶液與九份水混合而成，甲醛水溶液的滲透力強(qiáng)，不易使組織收縮，適合大塊組織的固定，經(jīng)福爾馬林固定的組織細(xì)胞核染色較好，但細(xì)胞質(zhì)染色較差。若要對(duì)長期使用福爾馬林溶液固定的組織塊進(jìn)行染色須經(jīng)過24-48小時(shí)的流水沖洗。甲醛水溶液久置會(huì)產(chǎn)生甲酸，嚴(yán)重時(shí)會(huì)影響細(xì)胞核的嗜堿性染色，可以在配置福爾馬林固定液時(shí)用自來水代替蒸餾水中和，也可以在甲醛水溶液中投入碳酸鎂、碳酸鈣等堿性物質(zhì)中和，如普通的粉筆主要成分為碳酸鈣（石灰石）和硫酸鈣（石膏），是比較容易得到的甲酸的中和劑，可直接投入到福爾馬林溶液中使用，保持溶液pH值在7.0左右。

80-95%濃度的酒精也可作為單純固定液使用，它的主要缺點(diǎn)是固定后會(huì)使組織塊收縮比較大，同時(shí)因其滲透力較弱，雖然能沉淀球蛋白、白蛋白和核蛋白，但沉淀后的核蛋白仍可溶于水，所以酒精固定后的組織細(xì)胞核著色較差，最常用于糖元的固定。

其它常用的單純固定液還有氯化汞、冰醋酸、苦味酸、重鉻酸鉀、鋨酸、丙酮、鉻酸、三氯醋酸等。

2.2 混合固定液

混合固定液是采用兩種或兩種以上化學(xué)試劑混合配成，混合的各種試劑要考慮對(duì)組織的互補(bǔ)作用。如固定糖原的Gendre液，其內(nèi)有乙醇和冰醋酸，其中的乙醇可沉淀糖原，但會(huì)使組織收縮，而配以冰醋酸后，因醋酸可使組織膨脹，從而抵消乙醇對(duì)組織的收縮，多種化學(xué)試劑混合配成的混合固定液則起多種作用，在選擇固定液時(shí)要考慮每種試劑成份對(duì)組織起到的作用。實(shí)驗(yàn)室中常見的混合固定液有以下幾種。

2.2.1 Bouin液

Bouin固定液是實(shí)驗(yàn)室最常用的混合固定液之一，它由飽和苦味酸水溶液、飽和甲醛水溶液和冰醋酸按15：5：1的比例配置而成，固定液中的苦味酸可使蛋白質(zhì)沉淀并使組織適當(dāng)硬化，冰醋酸能固定染色質(zhì)，甲醛水溶液可以調(diào)節(jié)苦味酸和冰醋酸對(duì)組織的膨脹作用。Bouin固定液的滲透速度快，對(duì)組織的固定均勻、收縮輕微，適合大多數(shù)組織與器官的固定，染色效果較好。

Bouin固定液在配置和使用時(shí)應(yīng)該注意以下幾點(diǎn)：

（1）由于苦味酸難以溶解，在配置飽和苦味酸溶液時(shí)至少要等靜置過夜且容器底部仍能見到苦味酸晶體沉淀方可認(rèn)為上方苦味酸溶液為飽和溶液;

（2）由于固定液滲透能力較強(qiáng)在使用時(shí)要注意固定時(shí)間不要太長，小的組織塊一到數(shù)小時(shí)即可，較大的組織塊可以適當(dāng)延長固定時(shí)間，但也不應(yīng)超過24小時(shí);

（3）Bouin固定液固定后的組織塊上容易產(chǎn)生苦味酸的黃色沉著，可在固定后用70%酒精洗去，少量的黃色沉著不影響染色，但在后期觀察時(shí)要予以區(qū)別辨認(rèn)。

2.2.1 Zenker液和Helly液

Zenker固定液也是組織學(xué)切片中常用的固定液，它按升汞（氧化汞）5.0g、重鉻酸鉀2.5g、硫酸鈉1.0g、蒸餾水100ml和冰醋酸5ml比例配置而成，配制時(shí)將重鉻酸鉀、升汞和硫酸鈉溶于加溫的蒸餾水制成儲(chǔ)存液，冰醋酸臨用前加入。其中硫酸鈉為經(jīng)典配方中含有，目前普遍認(rèn)為硫酸鈉在此固定液中不起任何作用，常舍去不用，經(jīng)Zenker固定液固定的組織，細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)染色效果都比較好，但在配置和使用時(shí)應(yīng)該注意以下幾點(diǎn)：

（1）儲(chǔ)存液需避光放置棕色玻璃瓶中保存;

（2）組織固定的時(shí)間控制在12-24小時(shí)左右，不應(yīng)超過24小時(shí);

（3）因固定液中含重鉻酸鉀，故固定后的組織塊需經(jīng)流水沖洗24小時(shí)以上方可進(jìn)入后續(xù)步驟;

（4）因?yàn)楣自诮M織內(nèi)形成結(jié)晶不利于切片和觀察，故沖洗后必須在70%的酒精中加碘去汞（一般為0.5%的碘酒精），去汞后再用5%的硫代硫酸鈉去除碘的黃色。

把Zenker固定液用甲醛飽和水溶液替代則為Helly液，故Helly液又常被稱Zenker-formol固定液，Helly液對(duì)細(xì)胞質(zhì)的固定較好，適合白細(xì)胞顆粒、胰島和腦垂體前葉各細(xì)胞等的固定。

2.2.3 Carnoy液

Carnoy液按無水乙醇60ml、三氯甲烷 30ml和冰醋酸10ml比例配置而成，其中無水乙醇用于固定細(xì)胞質(zhì)，冰醋酸固定染色質(zhì)，Carnoy液常用于糖原、尼氏體和肌纖維等染色，經(jīng)其固定的組織塊適合甲綠-派洛寧法染色顯示DNA和RNA。

2.2.4 中性甲醛固定液

中性甲醛也是實(shí)驗(yàn)室常規(guī)使用的固定液之一，它由磷酸二氫鈉4.0g，磷酸氫二鈉6.5g，37%甲醛100.0ml，蒸餾水900.0ml按比例充分混合而成，適合大多數(shù)組織病理標(biāo)本的固定，且標(biāo)本可以在其中長期保存，中性甲醛固定液的滲透能力強(qiáng)、組織收縮小，大多數(shù)的抗原物質(zhì)在其中保存較好，故常在免疫組織化學(xué)實(shí)驗(yàn)時(shí)使用。

其他常用的混合固定液還有4%多聚甲醛固定液、Orth液、Regaud液、Susa液、酒精-甲醛液、乙醚-酒精液等。

3 討論

良好的固定是組織學(xué)制片、大體標(biāo)本保存以及其他科學(xué)實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)，即使前期取得的材料很好，如果固定不當(dāng)，也無法得到滿意的切片和實(shí)驗(yàn)結(jié)果，很多從事科研實(shí)驗(yàn)的老師和同學(xué)經(jīng)常忽視了固定液選擇的重要性[7-9]，在固定液的選擇上很隨意，或者有時(shí)為了方便就從實(shí)驗(yàn)室現(xiàn)有的固定液中選取一種使用，不僅可能浪費(fèi)材料，而且還常嚴(yán)重影響了實(shí)驗(yàn)結(jié)果卻仍不自知，筆者結(jié)合自身從事人體解剖與組織胚胎學(xué)實(shí)驗(yàn)工作以來的經(jīng)驗(yàn)教訓(xùn)[10-12]，圍繞實(shí)驗(yàn)室常用的組織固定液及其分類做一個(gè)簡(jiǎn)單的探討以期對(duì)廣大實(shí)驗(yàn)和科研人員在固定液的正確選擇上有所提醒和幫助。

【參考文獻(xiàn)】

[1]杜卓民.實(shí)用組織學(xué)技術(shù)[M].北京：人民衛(wèi)生出版社，1982，17-32.

[2]李繼承.組織學(xué)與胚胎學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù)[M].北京：醫(yī)藥科技出版社，2010，1-42.

[3]姚建設(shè).提高組織切片標(biāo)本質(zhì)量的要點(diǎn)[J].解剖學(xué)雜志，2012，35（5）：686-689.

[4]姚建設(shè).組織切片標(biāo)本的質(zhì)量評(píng)價(jià)[J].解剖學(xué)雜志，2010，33（6）：852-853.

[5]馬云，張燕，孫長華.固定液對(duì)原位雜交的影響[J].中國組織化學(xué)與細(xì)胞化學(xué)雜志，2002，11（3）：345-346.

[6]周會(huì)芹，楊江輝，余琦.不同組織固定液對(duì)免疫組化結(jié)果的影響[J].診斷病理學(xué)雜志，2009，16（6）：478.

[7]唐從國.幾種常用病理組織固定液的比較[J].中國現(xiàn)代醫(yī)藥雜志，2015，17（10）：110-112.

[8]戴軍，謝敏浩，沈海燕.使用環(huán)保組織處理試劑的應(yīng)用體會(huì)[J].臨床與實(shí)驗(yàn)病理學(xué)雜志，2009，25（2）：219.

[9]吳平，張聲.無醛固定液與甲醛固定液對(duì)組織形態(tài)學(xué)保存效果比較[J].臨床與實(shí)驗(yàn)病理學(xué)雜志，2015，31（3）：343-345.

[10]吳敏，胡天寒，吳讓讓.一條新發(fā)現(xiàn)的頸叢無名神經(jīng)的解剖與觀察[J].南方醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào)，2018，38（10）：1261-1265.

[11]吳敏，胡天寒，姚建設(shè).大動(dòng)脈切片標(biāo)本的制作體會(huì)[J].解剖學(xué)雜志，2013，36（5）：993-994.

[12]吳敏，胡天寒，姚建設(shè).甲苯胺藍(lán)快速顯示肥大細(xì)胞的制作方法探討[J].四川解剖學(xué)雜志，2013，21（1）：11-12.