羅孝美， 李 碩， 黃麗欣， 彭波輝， 彭 昌△

(遵義醫(yī)科大學(xué) 1基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院生理教研室， 2附屬醫(yī)院兒內(nèi)科， 貴州 遵義 563000)

心臟發(fā)育是個極其復(fù)雜的過程，受到眾多因素的調(diào)控[1-4]。任何微小的變化均會導(dǎo)致心臟發(fā)育異常引起先天性心臟病[5]。研究證實(shí)，孕期飲酒可以導(dǎo)致胎兒酒精綜合征，該綜合征中最嚴(yán)重的畸形之一就是心臟發(fā)育畸形[6-7]。先天性心臟病給家庭及社會均帶來了嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)及社會負(fù)擔(dān)。因此，深入探討孕期飲酒致心臟發(fā)育畸形的研究將為先心病的防治提供重要的理論依據(jù)及干預(yù)靶點(diǎn)。研究表明，組蛋白甲基化修飾在心臟發(fā)育過程中發(fā)揮了重要的調(diào)控作用;組蛋白甲基化包括組蛋白一甲基化、二甲基化及三甲基化;組蛋白包括4種亞型，與心臟發(fā)育關(guān)系較為密切且研究較多的是組蛋白H3;而組蛋白H3的甲基化位點(diǎn)主要包括H3K4、H3K9、H3K27和H3K36等;在心臟發(fā)育過程中甲基化修飾的主要作用是調(diào)控心臟核心轉(zhuǎn)錄因子的轉(zhuǎn)錄活性，開啟或沉默心臟發(fā)育相關(guān)下游基因的表達(dá)[8-11]。因此，本研究通過孕期酒精暴露小鼠來探討組蛋白甲基化修飾狀態(tài)，為進(jìn)一步明確酒精暴露致子代心臟發(fā)育異常的表觀遺傳機(jī)制提供參考資料。

材 料 和 方 法

1 實(shí)驗(yàn)動物及分組

選取健康雌性成熟SPF級、周齡為14周的昆明小鼠36只，體重25～30 g，購自于重慶醫(yī)科大學(xué)，動物許可證號：SYXK(渝)2012-0015。按雌∶雄=2∶1合籠，次晨以觀察到陰栓的雌鼠而將其胎鼠的胎齡(embryo, E)記為0.5 d(E0.5)。將孕鼠按照隨機(jī)數(shù)字表法隨機(jī)分為4組：正常組、空白對照組、酒精組和酒精+抑制劑組,每組6只孕鼠。參照文獻(xiàn)及本課題組前期研究[12-13]，于E0.5給予56%乙醇(5 mL·kg-1·d-1)灌胃，每日1次直至E14.5，同時給予組蛋白甲基轉(zhuǎn)移酶(histone methyltransferase，HMT)亞型G9a特異性抑制劑BRD4770 (1 mg·kg-1·d-1)灌胃，每日1次直至E14.5，空白對照組予等量生理鹽水灌胃。

2 小鼠心臟標(biāo)本制備

參照文獻(xiàn)及本課題組前期研究[12-13]，于酒精灌胃結(jié)束后選取E14.5和E16.5孕鼠,二氧化碳麻醉處死，剖開腹腔找到串珠樣子宮取出胚胎并收集E14.5和E16.5胎鼠心臟，同時選取新生0.5 d(postnatal day 0.5, PND0.5)小鼠，以上述方法處死小鼠并收集心臟放入-80 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

3 主要儀器及試劑

熒光定量PCR儀(Bio-Rad，CFX96);抗H3K9me3、Cx43、β-MHC和G9a-HMT單克隆抗體(Abcam)；TRIzol 總RNA提取試劑盒(BioTeke，北京百泰克生物技術(shù)有限公司)；熒光定量PCR試劑盒及逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(TaKaRa);SDS-PAGE試劑盒(上海碧云天生物科技有限公司);組蛋白甲基化酶試劑盒(GENMED)。

4 實(shí)驗(yàn)方法

4.1氣相色譜法檢測乙醇濃度 取5個10 mL容量瓶分別準(zhǔn)確量取10 mL不同濃度的乙醇標(biāo)準(zhǔn)溶液，再分別加入0.5 mL內(nèi)標(biāo)溶液，混勻。然后用該溶液繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。選擇好色譜條件進(jìn)樣，用試樣組分峰面積與內(nèi)標(biāo)峰面積的比值查標(biāo)準(zhǔn)曲線得出的值，乘以稀釋倍數(shù)即為樣品中乙醇含量。

4.2比色法檢測HMT活性 應(yīng)用核蛋白提取試劑盒提取小鼠心肌組織核蛋白，BCA法測定蛋白濃度，運(yùn)用組蛋白甲基轉(zhuǎn)移酶測定試劑盒檢測HMT活性，嚴(yán)格按照試劑盒說明操作。

4.3Western blot實(shí)驗(yàn) 提取小鼠心肌組織核蛋白，8%或12% SDS-PAGE凝膠分離核蛋白，PVDF膜半干轉(zhuǎn)膜后，5%脫脂牛奶封閉2 h后分別加入兔來源抗H3K9me3、Cx43和β-MHC單克隆抗體及H3和β-actin兔來源多克隆抗體(均以1∶1 000稀釋；中杉金橋生物技術(shù)有限公司)，4 ℃孵育過夜，TBST洗滌3次，每次15 min，然后加入HRP標(biāo)記山羊抗兔的Ⅱ抗(中杉金橋生物技術(shù)有限公司；1∶5 000)脫色搖床上孵育2 h，TBST洗滌3次，每次15 min，運(yùn)用Bio-Rad圖像分析儀進(jìn)行圖像掃描；采用Quantity One 4.4軟件進(jìn)行分析。

4.4RT-qPCR 針對Gata4、Cx43和β-MHC基因CDS核心編碼區(qū)設(shè)計特異性引物，引物用Primer Premier 5.0 軟件設(shè)計，由大連寶生物公司合成。分別將Gata4、Cx43和β-MHC基因產(chǎn)物進(jìn)行梯度稀釋，運(yùn)用Bio-Rad CFX96熒光定量PCR儀擴(kuò)增，做出標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到R2值和擴(kuò)增效率。Gata4的上游引物序列為5’-TGCCAACTGCCAGACTACCAC-3’，下游引物序列為5’-TCAGGTTCTTGGGCTTCCGT-3’；Cx43的上游引物序列為5’-TCCTTGGTGTCTCTCGCTCT-3’，下游引物序列為5’-CGCTGGCTTGCTTGTTGTA-3’；β-MHC的上游引物序列為5’-TGAGACGGATGCCATACAGA-3’,下游引物序列為5’-GCAGCCTGTGCTTGGTCTT-3’。反應(yīng)條件：預(yù)變性95 ℃ 30 s;變性95 ℃ 5 s，退火延伸55 ℃ 30 s，39個循環(huán)。選取β-actin作為內(nèi)參照。β-actin上游引物序列為：5’-CCTTTATCGGTATGGAGTCTGCG-3’，下游引物序列為5’-CCTGACATGACGTTGTTGGCA-3’。反應(yīng)條件：預(yù)變性95 ℃ 30 s;變性95 ℃ 5 s，退火延伸59 ℃ 30 s，39個循環(huán)。所得數(shù)據(jù)用Bio-Rad CFX96熒光定量PCR儀自帶基于faffl原理的相對定量數(shù)據(jù)分析軟件分析。

5 統(tǒng)計學(xué)處理

所有數(shù)據(jù)均用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示。應(yīng)用SPSS 18.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析。兩組間比較采用t檢驗(yàn)，多組間比較進(jìn)行單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié) 果

1 56%乙醇灌胃后不同時點(diǎn)孕鼠體內(nèi)乙醇含量

采用氣相色譜法檢測孕鼠靜脈血中不同時點(diǎn)的乙醇含量，結(jié)果顯示，隨著灌胃后時間的增加，孕鼠體內(nèi)乙醇含量逐漸增加，在灌胃后60 min血液乙醇含量達(dá)到高峰(1.25 g/L，該濃度已經(jīng)達(dá)到人類醉酒狀態(tài))，而在灌胃后120 min血液乙醇含量接近于零，見圖1。

Figure 1.Alcohol concentration in the blood at the different time points in the mice during pregnancy. Mean±SD.n=6.

圖1孕鼠血液中不同時點(diǎn)的乙醇含量

2 孕期酒精暴露對小鼠心肌組織中HMT活性的影響

應(yīng)用比色法檢測酒精暴露小鼠心肌組織中HMT活性，結(jié)果顯示,在E14.5、E16.5及PND0.5酒精暴露組小鼠心肌組織中HMT活性較生理鹽水對照組均顯著降低(P<0.05)，見圖2。

Figure 2.The activity of histone methyltransferase (HMT) in the heart of mice. Mean±SD.n=6.*P<0.05vsnormal saline group.

圖2小鼠心肌組織中組蛋白甲基轉(zhuǎn)移酶活性

3 孕期酒精暴露對心肌中G9a-HMT及組蛋白H3K9me3表達(dá)的影響

Western blot結(jié)果顯示,在E14.5、E16.5及PND0.5小鼠心肌組織中，酒精暴露組G9a-HMT的表達(dá)水平與生理鹽水對照組相比顯著降低(P<0.05)。酒精暴露組蛋白H3K9me3甲基化水平顯著低于生理鹽水對照組(P<0.05)，見圖3。

4 孕期酒精暴露對小鼠心臟發(fā)育相關(guān)基因表達(dá)的影響

RT-qPCR結(jié)果顯示，酒精暴露組心臟核心轉(zhuǎn)錄因子Gata4的轉(zhuǎn)錄活性及下游基因Cx43和β-MHC的轉(zhuǎn)錄和翻譯水平均顯著高于生理鹽水對照組(P<0.05)，見圖4。

5 G9a-HMT抑制劑對酒精暴露小鼠心肌組織中G9a和心臟發(fā)育基因的影響

組蛋白H3K9me3甲基化水平在酒精暴露組顯著降低，但在抑制劑干預(yù)組較酒精組降低更為顯著(P<0.05)；且心臟發(fā)育相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子Gata4及心臟發(fā)育下游基因Cx43和β-MHC在酒精暴露組顯著升高，與生理鹽水對照組相比差異顯著(P<0.05)，而抑制劑干預(yù)組較酒精組升高更為顯著(P<0.05)，見圖5。

討 論

先天性心臟病是兒童出生缺陷中常見的先天畸形之一。目前先天性心臟病治療手段較為匱乏，尤其是復(fù)雜型先天性心臟病預(yù)后極差。酒精濫用是當(dāng)前社會中較普遍的現(xiàn)象，孕期飲酒并不少見。研究證實(shí)[14-15]，酒精暴露可以導(dǎo)致嚴(yán)重心臟發(fā)育畸形，但具體機(jī)制仍不十分清楚。通過大樣本先天性心臟病患兒基因篩查證實(shí)有一部分患兒并沒有發(fā)現(xiàn)心臟發(fā)育相關(guān)基因的突變，因此我們推測這可能是由于基因的修飾狀態(tài)發(fā)生了改變。表觀遺傳學(xué)是介導(dǎo)遺傳和環(huán)境之間的橋梁，表觀遺傳學(xué)研究的內(nèi)容主要包括組蛋白甲基化、乙?；?、磷酸化，DNA甲基化及microRNA修飾等。組蛋白H3K9me3的甲基化修飾參與了心臟發(fā)育、心肌肥厚及心衰等病理生理過程[8,16]。本課題組及其它研究團(tuán)隊(duì)證實(shí)酒精介導(dǎo)的組蛋白乙?；揎検Ш鈪⑴c了孕期酒精暴露致子代心臟發(fā)育相關(guān)基因的異常表達(dá)，但給予組蛋白乙?；敢种苿┲荒懿糠帜孓D(zhuǎn)酒精所致的基因表達(dá)異常[17-18]。因此，我們推測其他的表觀遺傳調(diào)控機(jī)制也可能參與了該病理生理過程。動物在某些疾病上的表現(xiàn)與人類非常相似，且臨床試驗(yàn)前的動物實(shí)驗(yàn)是研發(fā)新藥的必經(jīng)過程，故本研究應(yīng)用酒精灌胃孕鼠來探討組蛋白甲基化修飾在酒精暴露致心臟發(fā)育相關(guān)基因表達(dá)異常中的作用及其機(jī)制，希望能為進(jìn)一步明確人類孕期飲酒致子代心臟發(fā)育畸形提供參考資料。

Figure 3.The expression of H3K9me3 and G9a-HMT in the heart of mice. N: normal group; Al: alcohol group; NS: normal saline group. Mean±SD.n=6.*P<0.05vsNS.

圖3小鼠心肌組織中組蛋白H3K9me3和組蛋白甲基轉(zhuǎn)移酶亞型G9a的表達(dá)水平

Figure 4.The expression of cardiomyogenesis genesGata4,Cx43 andβ-MHCat mRNA and protein levels in mice. A: the mRNA expression of Gata4; B: the mRNA expression of Cx43 and β-MHC; C and D: the protein expression of Cx43 and β-MHC, respectively. N: normal group; Al: alcohol group; NS: normal saline group. Mean±SD.n=6.*P<0.05vsNS.

圖4小鼠心臟發(fā)育相關(guān)基因Gata4、Cx43和β-MHC的mRNA及蛋白表達(dá)水平

Figure 5.The effects of G9a-HMT inhibitor BRD4770 on the expression of H3K9me3, Cx43 and β-MHC in myocardial tissues of mice treated with alcohol. A: the protein level of H3K9me3; B: the mRNA expression of Cx43 and β-MHC; C and D: the protein expression of Cx43 and β-MHC, respectively. N: normal group; Al: alcohol group; AB: alcohol+BRD4770 group; NS: normal saline group. Mean±SD.n=6.*P<0.05vsNS;#P<0.05vsAl.

圖5G9a-HMT抑制劑BRD4770對酒精暴露小鼠心肌組織中H3K9me3、Cx43和β-MHC表達(dá)的影響

心臟發(fā)育異常的基礎(chǔ)首先是心臟發(fā)育相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子及其下游基因表達(dá)異常，而心臟核心轉(zhuǎn)錄因子Gata4與孕期酒精暴露致心臟發(fā)育異常關(guān)系密切[13]。本研究結(jié)果表明，孕期酒精暴露可致組蛋白H3K9me3甲基化水平顯著降低，而心臟發(fā)育核心轉(zhuǎn)錄因子Gata4及心臟發(fā)育下游基因Cx43和β-MHC在mRNA及蛋白水平過表達(dá)，提示組蛋白甲基化修飾可能參與了酒精暴露所致心臟發(fā)育基因表達(dá)異常。組蛋白甲基化修飾受到組蛋白甲基轉(zhuǎn)移酶和組蛋白去甲基化酶雙重調(diào)控；大多數(shù)情況下組蛋白甲基轉(zhuǎn)移酶主要是導(dǎo)致組蛋白的甲基化,沉默基因的表達(dá)，而組蛋白去甲基化酶則是導(dǎo)致組蛋白去甲基化,開啟基因的表達(dá)。因此，我們應(yīng)用比色法檢測了組蛋白甲基轉(zhuǎn)移酶活性，結(jié)果顯示酒精暴露組該酶活性與對照組相比顯著降低，提示組蛋白甲基轉(zhuǎn)移酶在該過程中可能發(fā)揮了調(diào)控作用。但目前研究證實(shí)組蛋白甲基轉(zhuǎn)移酶包括多種亞型[19]。于是我們檢測了在心肌組織中表達(dá)且與心臟發(fā)育關(guān)系較為密切的一種亞型G9a，結(jié)果正如所預(yù)料的，該亞型的表達(dá)水平在酒精組也顯著低于對照組。因此，推測該酶是上述病理生理過程中的一個關(guān)鍵調(diào)控因子。為了進(jìn)一步證實(shí)該推測，孕期酒精暴露小鼠被給予G9a-HMT特異性抑制劑處理，結(jié)果表明心肌組織中組蛋白H3K9me3甲基化水平較酒精暴露組進(jìn)一步降低，且心臟發(fā)育核心轉(zhuǎn)錄因子Gata4及心臟發(fā)育下游基因Cx43和β-MHC表達(dá)水平在抑制劑處理組顯著高于酒精組。以上結(jié)果均進(jìn)一步證實(shí)了G9a-HMT在酒精暴露致心臟發(fā)育相關(guān)基因表達(dá)中的重要調(diào)控作用。但是，其他HMT亞型和組蛋白去甲基轉(zhuǎn)移酶是否參與該病理生理過程以及上游信號通路是什么仍不清楚，且其他亞型的組蛋白(如H4)及其他甲基化位點(diǎn)本研究仍未檢測，它們是否參與上述過程仍有待進(jìn)一步研究證實(shí)。