沈鏈鏈，楊 健，鐘義紅，徐 彬，王玉邦

(1.江蘇省醫(yī)藥農(nóng)藥獸藥安全性評(píng)價(jià)與研究中心，江蘇 南京 211166；2.南京醫(yī)科大學(xué)第二附屬醫(yī)院泌尿外科)

肺纖維化是不斷進(jìn)展的疾病，由早期的炎癥發(fā)展成為肺部的瘢痕，其特征是細(xì)胞外基質(zhì)的異常過度沉積，最終發(fā)展成為喪失肺功能的纖維化組織[1]。肺纖維化的發(fā)病率較高，尤其是采礦工人以及暴露于石棉和金屬粉末的職業(yè)人員。目前治療肺纖維化的藥物主要有皮質(zhì)類固醇激素和細(xì)胞毒性因子等。這些藥物不僅存在一定的毒副作用，而且對(duì)于疾病而言，并沒有可測(cè)量到的實(shí)質(zhì)性的改善[2]。對(duì)于新藥物而言，降低其毒作用非常關(guān)鍵。水飛薊素是從水飛薊種子中提取的一種混合物，包含水飛薊賓、異水飛薊賓、水飛薊寧、水飛薊汀等。水飛薊素具有很多生化和藥理學(xué)功能，包括抗氧化功能，穩(wěn)定肝細(xì)胞膜的功能，促進(jìn)重建的功能[3]，水飛薊素能減緩肝纖維化過程，提高存活率[4]。有研究顯示水飛薊素對(duì)膽道纖維化也可能有效[5]。但水飛薊素對(duì)肺部疾病的療效仍不確切。由于不同臟器的纖維化過程的機(jī)制有許多共性，而水飛薊素對(duì)肝纖維化有確切療效，因此我們推測(cè)其對(duì)肺纖維化也可能有一定的干預(yù)作用。因此，該研究運(yùn)用小鼠模型，研究水飛薊素對(duì)二氧化硅(SiO2)所致肺纖維化的抑制作用。本實(shí)驗(yàn)另設(shè)置了藥物漢防己甲素組，用于明確水飛薊素對(duì)肺纖維化的療效，漢防己甲素是一種生物堿，在臨床上用于治療矽肺已有很多年[6]。

1 材料和方法

1.1試劑 SiO2和水飛薊素(Sigma公司)；漢防己甲素(浙江康恩貝生物制藥有限公司)；兔抗平滑肌肌動(dòng)蛋白-α(smooth muscle actin，α-SMA)(Proteintech Group，Inc)；兔抗轉(zhuǎn)化生長因子-β1(transforming growth factor-β，TGF-β1)(Bioworld Technology)。

1.2實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及劑量 雄性C57BL/6J 小鼠20～23 g購自揚(yáng)州大學(xué)比較醫(yī)學(xué)中心。所有動(dòng)物在實(shí)驗(yàn)前檢疫3 d；動(dòng)物飼養(yǎng)于IVC動(dòng)物房，溫度為(24±3)°C，濕度為(55±6)%，光照為12 h(明)：12 h(暗)交替；食物和水自由攝取。動(dòng)物被隨機(jī)分為6組，每組10只。本實(shí)驗(yàn)用氣管灌注SiO2形成肺纖維化模型：小鼠經(jīng)水合氯醛麻醉后切開頸部皮膚，分離肌肉，暴露氣管，注射器吸取50 μL SiO2懸液(50 mg/mL，用生理鹽水重懸)灌注于氣管，灌注完成后，縫合傷口。水飛薊素用蒸餾水配置，劑量設(shè)置為200 mg/kg[7-8]以及100 mg/kg。各組小鼠的處理如下表所示，所有動(dòng)物在第0 d、第 4 d稱重，之后一周一次稱重。見表1。

表1 氣管灌注及灌胃日程

1.3肺系數(shù) 灌胃28 d結(jié)束后，小鼠隔夜禁食，第2 d用頸椎脫臼法處死，分離肺，用生理鹽水將其洗凈后用濾紙吸干水分，稱重；肺系數(shù)按照如下公式計(jì)算：肺系數(shù)=(肺濕重/小鼠體重)×100 %；左肺葉切下后保存于福爾馬林溶液。

1.4病理組織分析 經(jīng)固定、脫水、包埋后切成4 μm切片；經(jīng)HE染色后，纖維化的嚴(yán)重程度用一種改良的半定量的方法進(jìn)行評(píng)分[9]；Masson染色觀察膠原沉積，Masson染色后，肌肉染成紅色而膠原染成藍(lán)色，切片用Pannoramic Scan切片掃描系統(tǒng)掃描成像。

1.5免疫組化 石蠟切片經(jīng)二甲苯脫蠟，梯度酒精水化，根據(jù)MaxVision公司(邁鑫,中國)的MaxVision TM plus Poly HRP IHC Kit試劑盒步驟操作。主要步驟如下：微波抗原修復(fù)，3 % H2O210 min用于去除內(nèi)源性過氧化物酶；切片經(jīng)PBS清洗，孵育α-SMA 或者 TGF-β1抗體(1∶500)4 ℃過夜；經(jīng)PBS洗，室溫孵育MaxVisionTM試劑15 min；加0.02 % DAB顯色；自來水沖洗；蘇木素復(fù)染；PBS沖洗返藍(lán)。切片用Pannoramic Scan切片掃描系統(tǒng)掃描成像。

2 結(jié)果

2.1小鼠體重 水飛薊素低劑量組的第4 d、第11 d、第25 d的體重與空白對(duì)照組(或生理鹽水組)相比，體重降低且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，但最終體重與對(duì)照組或生理鹽水組比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.075，0.072)。見表2。

2.2水飛薊素灌胃對(duì)肺濕重和肺系數(shù)的影響 模型組較生理鹽水組，小鼠肺濕重、肺系數(shù)升高(P肺濕重=0.000，P肺系數(shù)=0.000)；漢防己甲素逆轉(zhuǎn)了上述指標(biāo)升高的趨勢(shì)，基本接近對(duì)照組水平；高劑量水飛薊素組灌胃28 d后較模型組也有效地抑制了肺濕重和肺系數(shù)升高(P肺濕重=0.020，P肺系數(shù)=0.019)，提示高劑量水飛薊素可能對(duì)肺纖維化有抑制作用。低劑量水飛薊素與模型組相比，兩項(xiàng)指標(biāo)均無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P=0.931，0.626)。見圖1。

表2 各組小鼠體重(g)

注：“*”表示各組與空白對(duì)照組比較P<0.05，“#”表示各組與生理鹽水組比較P<0.05

圖1

注：(A)肺濕重，(B)肺系數(shù)；“*”表示各處理組與生理鹽水組比較P<0.05，“#”表示各處理組與SiO2組比較P<0.05；(Sil-L：水飛薊素 100 mg/kg劑量組， Sil-H：水飛薊素 200 mg/kg劑量組，Tet：漢防己甲素組)。

2.3水飛薊素灌胃后的病理改變 圖2A-F所示，對(duì)照組的小鼠的肺組織有完整、清晰的肺泡結(jié)構(gòu)以及正常的間隙，未觀察到炎細(xì)胞。與對(duì)照組相比，灌注生理鹽水的小鼠幾乎沒有病理組織學(xué)改變，而灌注SiO2的小鼠出現(xiàn)了矽結(jié)節(jié)，肺泡結(jié)構(gòu)改變。漢防己甲素灌胃使絕大部分肺泡結(jié)構(gòu)恢復(fù)。低劑量水飛薊素有一定的效果，但并不明顯，而高劑量的水飛薊素顯著減輕了由SiO2所致的病理組織學(xué)的改變。如圖2G所示，兩劑量水平的水飛薊素灌胃后肺纖維化評(píng)分低于模型組的評(píng)分(P低劑量=0.006，P高劑量=0.000)。僅從纖維化評(píng)分來看，高劑量水飛薊素甚至與漢防己甲素效果相當(dāng)。見圖2。

圖2 HE染色及纖維化評(píng)分

注：(A)對(duì)照組，(B)生理鹽水組，(C)SiO2組，(D)水飛薊素100 mg/kg劑量組，(E)水飛薊素200 mg/kg劑量組，(F)漢防己甲素組，標(biāo)尺=200 μm；(G)纖維化評(píng)分?！?”表示各處理組與生理鹽水組比較P<0.05，“#”表示各處理組與SiO2組比較P<0.05；(Sil-L：水飛薊素 100 mg/kg劑量組， Sil-H：水飛薊素 200 mg/kg劑量組，Tet：漢防己甲素組)。

2.4水飛薊素對(duì)膠原沉積的影響 對(duì)照組以及生理鹽水組并無膠原沉積，而模型組有明顯的膠原沉積(藍(lán)色為膠原纖維)。灌胃漢防己甲素后，膠原沉積明顯減少，而灌胃兩種劑量水平的水飛薊素后膠原沉積也有所減少，尤其是高劑量組。見圖3。

2.5水飛薊素對(duì)α-SMA和TGF-β1表達(dá)的影響 對(duì)照組和生理鹽水組幾乎沒有a-SMA和 TGF-β1的表達(dá)。而模型組的小鼠a-SMA和 TGF-β1的表達(dá)都顯著上升。而200 mg/kg的水飛薊素以及漢防己甲素組能減少其表達(dá)。見圖4、圖5。

3 討論

小鼠經(jīng)SiO2氣管灌注后肺濕重和肺指數(shù)顯著升高，而高劑量的水飛薊素灌胃能降低這兩項(xiàng)指標(biāo)，提示高劑量的水飛薊素可能對(duì)SiO2所致的肺纖維化有較好的效果。

SiO2氣管灌注后引起了一系列病理組織學(xué)改變，Ashcroft評(píng)分結(jié)果也顯著高于對(duì)照組。膠原沉積是肺纖維化過程中的重要的致病過程之一。本研究結(jié)果顯示SiO2氣管灌注后膠原明顯增多。而水飛薊素灌胃后減少了病理組織學(xué)改變，降低了纖維化評(píng)分，減少了膠原沉積，而且高劑量的水飛薊素與低劑量的水飛薊素相比，其作用更加顯著。這也更加證實(shí)了水飛薊素的抗纖維化效果。

圖3 Masson染色

注：(A)對(duì)照組，(B)生理鹽水組，(C) SiO2組，(D)水飛薊素100 mg/kg劑量組，(E)水飛薊素200 mg/kg劑量組，(F)漢防己甲素組。標(biāo)尺=100 μm。

圖4 α-SMA免疫組化

注：(A)對(duì)照組，(B)生理鹽水組，(C)SiO2組，(D)水飛薊素100 mg/kg劑量組，(E)水飛薊素200 mg/kg劑量組，(F)漢防己甲素組。標(biāo)尺=100 μm。

在肺纖維化的過程中，來源于上皮細(xì)胞的肌成纖維細(xì)胞是最重要的致病相關(guān)的細(xì)胞[10]。肌成纖維細(xì)胞有很強(qiáng)的合成膠原的能力，其特征就是ɑ-SMA的表達(dá)。運(yùn)用免疫組化技術(shù)發(fā)現(xiàn)水飛薊素灌胃能降低ɑ-SMA的表達(dá)水平，這也證實(shí)了水飛薊素可能有抑制肺纖維化的作用。

圖5 TGF-β1免疫組化

注：(A)對(duì)照組，(B)生理鹽水組，(C)SiO2組，(D)水飛薊素100 mg/kg劑量組，(E)水飛薊素200 mg/kg劑量組，(F)漢防己甲素組。標(biāo)尺=100 μm。

TGF-β1能夠誘導(dǎo)完全分化的上皮細(xì)胞經(jīng)歷間質(zhì)細(xì)胞的轉(zhuǎn)化后，再生成成纖維細(xì)胞和肌成纖維細(xì)胞，并且保護(hù)肌成纖維細(xì)胞不凋亡[10]。TGF-β1可以看作纖維化過程的重要開關(guān)[11]，因此抑制它能有效地抑制纖維化的進(jìn)程[12]。該研究證實(shí)灌胃水飛薊素能有效地減少TGF-β1的表達(dá)，這也證實(shí)水飛薊素可能對(duì)SiO2所致的纖維化過程有抑制作用。

雖然水飛薊素的抗纖維化效果沒有漢防己甲素強(qiáng)，但是相對(duì)于漢防己甲素來說，其副作用較少，因此相對(duì)比較安全[3]。這一點(diǎn)很重要，因?yàn)榛谒w薊素的抗纖維化作用而且副作用較小，可能被作為一種預(yù)防或治療肺纖維化的保健品開發(fā)。