張會梅 孫亞磊 王艷玲 鐘英杰 魏秀麗 付海寧 欒明娜 龐云露 蔣貽海 徐恩民
摘要:采用高效液相法對柴芍口服液指標性成分芍藥苷含量進行測定。色譜柱:ZorbaxSBC18(4.6mm×250mm,5μm);流動相:乙腈+0.05%磷酸溶液(14∶86);流速:1.0mL/min;柱溫:35℃;檢測波長:230nm。經(jīng)精密度、穩(wěn)定性、重復性、回收率等驗證,在該色譜條件下能夠達到對柴芍口服液的質(zhì)量控制。
關鍵詞:柴芍口服液;高效液相色譜;芍藥苷
中圖分類號:S815.4文獻標識號:A文章編號:1001-4942(2019)05-0144-04
本研究中的新中獸藥柴芍口服液由柴胡、白芍、枳實、甘草4味中藥組方,經(jīng)提取制備而成,具有透解郁熱、調(diào)和肝脾的功效,主治由霉菌毒素導致的雞肝損傷。柴胡的主要有效成分為五環(huán)三萜類柴胡皂苷a-f和揮發(fā)油,具有鎮(zhèn)靜、解熱鎮(zhèn)痛、抗炎和免疫調(diào)節(jié)等功能[1];白芍中含有豐富的單萜苷類化合物,以芍藥苷、芍藥內(nèi)酯苷、羥基芍藥苷和氧芍藥苷等為主,具有多途徑抑制自身免疫反應,以及抗炎、止痛、保肝等多種藥理作用[2];枳實主要含有黃酮類、生物堿類、揮發(fā)油類等成分,具有調(diào)節(jié)腸胃運動、調(diào)節(jié)子宮功能、升壓、強心、抗氧化、抗菌、鎮(zhèn)痛、抗血栓等藥理作用[3];甘草的活性成分是三萜皂苷和黃酮類化合物,具有抗?jié)?、抗炎、解痙、抗氧化、抗病毒、抗癌、抗抑郁、保肝、祛痰和增強記憶力等多種藥理活性。芍藥苷為柴芍口服液中的重要有效成分。參照文獻[4],本試驗采用高效液相色譜法對本品中芍藥苷含量進行檢測,并提供方法學研究資料。
1材料與方法
1.1藥品及對照品
柴芍口服液(批號:20180601),濰坊諾達藥業(yè)生產(chǎn)。
芍藥苷:中國食品藥品檢定研究院,純度96.4%,批號:110736-201438。
1.2儀器與試劑
Agilent1260高效液相色譜儀(G1311C四元泵,G1329B自動進樣儀,G1316A柱溫箱,G4212B二極管陣列檢測器,Agilent化學工作站);Agilent1200高效液相色譜儀(G1322A脫氣機,G1311A四元泵,G1329A自動進樣儀,G1315D二極管陣列檢測器,Agilent化學工作站)。
AS20500B型超聲波清洗儀:天津AutoScienceCo.Ltd.;DHG-9101.2S型電熱恒溫鼓風干燥箱:上海三發(fā)科學儀器公司;數(shù)顯恒溫水浴鍋DK-S2.4:上海三發(fā)科學儀器公司;BT125D型電子天平:賽多利斯科學儀器(北京)有限公司。
試劑:甲醇(色譜純):MercKKGaA;乙腈(色譜純):美國Tedia天地試劑公司;磷酸為國產(chǎn)分析純。
1.3方法
1.3.1色譜條件
色譜柱:ZorbaxSBC18(4.6mm×250mm,5μm);流動相:乙腈-0.05%磷酸溶液(14∶86);流速:1.0mL/min;柱溫:35℃;檢測波長:230nm;進樣量10μL。液相色譜梯度洗脫見表1。
1.3.2樣品及對照品溶液的制備
對照品溶液的制備:精密稱取芍藥苷對照品適量,加14%乙腈制成80μg/mL的溶液,即得。
供試品溶液的制備:精密量取本品1mL,置50mL量瓶中,用14%乙腈稀釋至刻度,搖勻,濾過,取續(xù)濾液,即得。
2結(jié)果與分析
2.1系統(tǒng)適應性試驗
取試驗藥品(批號:20180601),按供試品溶液制備方法制備供試品溶液,按建立的色譜條件進樣分析6次,記錄色譜圖。結(jié)果(表2):理論板數(shù)n>3000,芍藥苷與最鄰近峰的分離度R>1.5,試驗系統(tǒng)可靠有效。
2.2專屬性試驗
按照樣品的制備方法,制備缺失芍藥苷的陰性樣品,按供試品溶液制備方法制備陰性對照溶液,分別精密吸取陰性對照溶液與芍藥苷標準品溶液各10μL注入液相色譜儀,記錄色譜圖。結(jié)果:陰性樣品的圖譜中(圖1),在與供試品圖譜中芍藥苷(圖2)的色譜峰位置上(Rt=12.756)無干擾,說明本方法測定芍藥苷專屬性良好。
2.3線性關系考察
精密稱定20.24mg芍藥苷,置50mL量瓶中,加入14%乙腈溶液,溶解后稀釋定容至刻度,得含芍藥苷401.76μg/mL的對照品貯備液。精密量取對照品貯備液適量,用14%乙腈稀釋,得分別含芍藥苷16.07、40.18、80.35、160.70、200.88、401.76μg/mL的系列對照品溶液。
按建立的色譜條件進行分析,記錄色譜圖與峰面積,結(jié)果見表3。以芍藥苷峰面積為縱坐標,芍藥苷的濃度(μg/mL)為橫坐標,進行線性回歸,得芍藥苷標準曲線(n=6)(圖3)?;貧w方程:y=12.465x+21.147,R2=0.9997。表明芍藥苷含量在16.07~401.76μg/mL范圍內(nèi)線性關系良好。
2.4精密度試驗
按供試品溶液制備方法,制備批號20180601的供試品溶液。按建立的色譜條件重復進樣6次,記錄色譜圖,計算峰面積值,結(jié)果見表4。按芍藥苷峰面積計算RSD值等于0.87%(n=6),說明儀器的精密度良好。
2.5穩(wěn)定性試驗
取同一批號樣品(批號:20180601),按供試品溶液制備方法制備供試品溶液,按上述色譜條件分別于0、2、4、6、8、12h進樣分析,記錄色譜圖,計算峰面積值,結(jié)果見表5。按芍藥苷峰面積計算RSD等于0.37%(n=6),說明樣品溶液在12h內(nèi)穩(wěn)定。
2.6重復性試驗
取同一批號樣品(批號:20180601),按供試品溶液制備方法平行制備6份供試品溶液,按上述色譜條件進樣分析,記錄色譜圖,根據(jù)峰面積值計算芍藥苷含量,結(jié)果見表6。按芍藥苷含量計算RSD等于0.43%(n=6),說明方法重復性良好。
2.7回收率試驗
精密量取已知含量的同一批號樣品(批號:20180601)0.5mL共6份,分別置于50mL的容量瓶中,分別加入25mL芍藥苷對照品儲備溶液(90.89μg/mL),加入14%乙腈定容至刻度,按供試品溶液制備方法制備供試品,經(jīng)0.45μm微孔濾膜濾過后,吸取10μL進樣,記錄色譜圖,按外標法以峰面積計算。結(jié)果見表7:芍藥苷的平均回收率為101.81%,RSD為0.73%(n=6)。
2.8耐用性試驗
取同一批號樣品(批號:20180601),按供試品溶液制備方法制備供試品溶液,分別考察流動相比例變化(±2%)、柱溫變化(±5℃)、流速相對值變化(±20%)、同一類型不同廠牌色譜柱對樣品色譜行為的影響,記錄色譜圖。觀察芍藥苷峰和臨近峰的基線分離情況,并計算各條件下芍藥苷含量的相對標準偏差。結(jié)果見表8:在各條件下,芍藥苷峰與臨近峰達到基線分離。并且在流動相比例、柱溫有小的變動、換用同一類型不同廠牌色譜柱時,均不影響含量測定結(jié)果。
3結(jié)論
柴芍口服液是由四逆散經(jīng)過提取而制成的制劑。在含量測定部分,以柴芍口服液中的芍藥苷為指標成分,通過色譜條件的優(yōu)化,建立了理論塔板數(shù)高、分離度好的色譜條件。經(jīng)過精密度、穩(wěn)定性、重復性考察及加樣回收率試驗等方法學驗證,該方法具有較高的準確性和重現(xiàn)性,能夠達到對新中獸藥柴芍口服液中芍藥苷的含量檢測要求。
參考文獻:
[1]謝東浩,蔡寶昌,安益強,等.柴胡皂苷類化學成分及藥理作用研究進展[J].南京中醫(yī)藥大學學報,2007,23(1):63-65.
[2]高小榮,田庚元.白芍化學成分研究進展[J].中國新藥雜志,2006,15(6):416-418.
[3]張紅,孫明江,王凌.枳實的化學成分及藥理作用研究進展[J].中藥材,2009,32(11):1787-1790.
[4]國家藥典委員會.中華人民共和國藥典:一部[M].2015版.北京:中國醫(yī)藥科技出版社,267,786.