劉博偉，王 偉，孫鎖鋒，蘭 玲，袁 媛，靳鈺煒，張 昊，韓雙印，李修嶺，李 健

1.河南省人民醫(yī)院 鄭州大學(xué)人民醫(yī)院 河南大學(xué)人民醫(yī)院消化科，河南 鄭州 450003； 2.上海長(zhǎng)海醫(yī)院消化科； 3.河南省人民醫(yī)院病理科

乙型肝炎病毒(hepatits B virus, HBV)感染可導(dǎo)致慢性乙型肝炎(chronic hepatitis B, CHB)，進(jìn)而導(dǎo)致肝功能衰竭、肝硬化和肝細(xì)胞癌，嚴(yán)重危害人類健康。目前HBV治療主要依靠干擾素和核苷類藥物，存在有效率低、耐藥率高和停藥后復(fù)發(fā)等缺點(diǎn)，HBsAg血清學(xué)轉(zhuǎn)換更難以實(shí)現(xiàn)，使HBV治療舉步維艱。HBV引起CHB的發(fā)病機(jī)制，既有病毒的始動(dòng)作用，又有機(jī)體固有免疫和適應(yīng)性免疫功能不足，其中機(jī)體足夠的免疫系統(tǒng)功能是徹底清除病毒，最終達(dá)到臨床治愈的決定性因素。從理論上講，適應(yīng)性免疫應(yīng)答過(guò)程中任何環(huán)節(jié)障礙均可造成免疫耐受[1]。因此，通過(guò)免疫策略，突破機(jī)體免疫耐受，重新激活免疫系統(tǒng)，徹底清除肝細(xì)胞內(nèi)HBV cccDNA對(duì)治愈CHB具有重要意義，為當(dāng)前HBV感染治療的一個(gè)新策略[2-4]。

1 材料與方法

1.1 主要試劑與儀器熒光實(shí)時(shí)定量PCR(quantitative real-time PCR，qRT-PCR)引物由上海生工生物工程股份有限公司合成。淋巴細(xì)胞分離液購(gòu)自美國(guó)Sigma公司，Trizol購(gòu)自Invitrogen公司，SYBR Green PCR定量試劑盒購(gòu)自Roche公司。G10，一種小分子人源STING激動(dòng)劑，購(gòu)自Aobious公司。

1.2 細(xì)胞THP1細(xì)胞由中國(guó)科學(xué)院干細(xì)胞庫(kù)提供，用質(zhì)量濃度為100 g/L胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基(Gibco)常規(guī)培養(yǎng)。HepAD38由美國(guó)Baruch S.Blumberg Institute Jinhong Chang教授饋贈(zèng)。HepAD38細(xì)胞來(lái)源于HepG2細(xì)胞,其HBV表達(dá)受四環(huán)素調(diào)控。HepAD38細(xì)胞用質(zhì)量濃度為100 g/L胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基(Gibco)，400 μg/ml的G418和1 μg/ml的四環(huán)素進(jìn)行常規(guī)培養(yǎng)。采用Ficoll-Hypaque密度梯度離心法從健康志愿者全血分離PBMCs，用質(zhì)量濃度為100 g/L胎牛血清和谷氨酰胺的RPMI-1640培養(yǎng)基(Corning)常規(guī)培養(yǎng)。所有健康志愿者抽血前均簽署知情同意書。

1.3 PBMCs的分離提取利用Ficoll-Hypaque密度梯度離心法，取20 ml新鮮采集的肝素鈉抗凝全血離心去除血漿后，用PBS稀釋1倍，加至15 ml淋巴細(xì)胞分離液上層，400×g離心30 min，收集離心管中云霧狀白膜層(即單核細(xì)胞和淋巴細(xì)胞富集層)，PBS洗滌2遍，得到PBMCs，供下游實(shí)驗(yàn)使用。

1.4 qRT-PCR檢測(cè)PBMCs和THP1細(xì)胞IFN-β、TNF-α、IL-28A、IL-29 mRNA表達(dá)按照RNA提取試劑盒操作說(shuō)明，采用柱提法逐步提取RNA。引物序列見表1，以β-actin作為內(nèi)參， PCR反應(yīng)體系按說(shuō)明書配好后，瞬時(shí)離心，要注意避光，立即使用Roche Light Cycle 480 Ⅱ儀進(jìn)行檢測(cè)。反應(yīng)條件為：95 ℃變性10 s，60 ℃退火20 s，40個(gè)循環(huán)。最后進(jìn)行溶解曲線分析的1個(gè)循環(huán)：95 ℃ 15 s；60 ℃ 30 s；95 ℃ 15 s。每個(gè)樣本3個(gè)復(fù)孔，觀察溶解曲線可以分析引物特異性，根據(jù)各反應(yīng)孔的Ct值，計(jì)算平均Ct值，采用2-△△Ct計(jì)算方法，并用β-actin為內(nèi)參照，計(jì)算每孔待測(cè)基因的相對(duì)表達(dá)量。

1.5 HBV DNA檢測(cè)采用酚-氯仿核酸提純法，每份樣本加入0.3 ml的Trizol裂解液，用移液槍吹打混勻10～20 s，在冰上靜置5 min。將細(xì)胞裂解物轉(zhuǎn)移至離心管，300×g，4 ℃，離心5 min以去除細(xì)胞碎片。取每管0.2 ml上清至新的離心管，加入0.1 ml蛋白酶K消化液，45 ℃，溫浴1 h。每管加入0.3 ml氯仿，輕輕吹打混勻，300×g，4 ℃，離心15 min。棄上清液，置入高壓過(guò)的1.5 ml離心管中，加入0.3 ml異丙醇顛倒混勻10次，300×g，離心10 min，棄上清液。用0.5 ml預(yù)冷的70%乙醇洗滌2次，吸凈上清，70 ℃溫浴5～10 min，加50 μl的蒸餾水溶解。HBV DNA由qRT-PCR檢測(cè)，引物序列見表1，以β-actin作為內(nèi)參，PCR反應(yīng)體系按說(shuō)明書配好后，瞬時(shí)離心，立即使用Roche Light Cycle 480 Ⅱ儀進(jìn)行檢測(cè)反應(yīng)條件同1.4。

表1 qRT-PCR檢測(cè)引物序列Tab 1 Primer sequence detected by qRT-RCR

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法采用SPSS 10.0統(tǒng)計(jì)軟件包進(jìn)行分析。計(jì)量資料進(jìn)行單因素方差分析，兩組間比較采用t檢驗(yàn)，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 G10誘導(dǎo)PBMCs 細(xì)胞IFN-β、TNF-α、IL-28A、IL-29 mRNA表達(dá)G10處理6 h后收集細(xì)胞，進(jìn)行qRT-PCR檢測(cè)。結(jié)果顯示，G10處理的PBMCs細(xì)胞IFN-β、TNF-α、IL-28A、IL-29 mRNA表達(dá)水平顯著高于對(duì)照組(P<0.05)，以誘導(dǎo)IFN-β表達(dá)作用最強(qiáng)，可上調(diào)達(dá)678倍，并呈劑量依賴性(見圖1)。這提示G10能誘導(dǎo)PBMCs表達(dá)以IFN-β為主的細(xì)胞因子。

2.2 G10誘導(dǎo)THP1細(xì)胞IFN-β mRNA表達(dá)G10處理6 h后收集細(xì)胞，進(jìn)行qRT-PCR檢測(cè)。結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，G10顯著上調(diào)THP1 細(xì)胞表達(dá)IFN-β mRNA(P<0.05)，在G10 50 μmol/L達(dá)峰值(見圖2)。提示G10能誘導(dǎo)THP1 細(xì)胞高表達(dá)IFN-β細(xì)胞因子。

2.3 評(píng)價(jià)G10誘導(dǎo)的抗HBV作用的細(xì)胞培養(yǎng)體系的建立我們首先用G10處理THP1細(xì)胞，然后用含1/2 THP1上清液與不含四環(huán)素細(xì)胞培養(yǎng)基常規(guī)培養(yǎng)HepAD38 72 h(間接作用)，觀察G10在HepAD38的抗HBV作用。并用G10直接作用于HepAD38(直接作用)作為對(duì)照(見圖3)。

注：與對(duì)照組比較，*P<0.05。

注： 與對(duì)照組比較，*P<0.05。

圖3 細(xì)胞處理示意圖Fig 3 Schematic representation of treatment strategy

2.4 G10間接作用抑制HepAD38 HBV DNA表達(dá)間接處理72 h后收集HepAD38細(xì)胞，進(jìn)行qRT-PCR檢測(cè)。結(jié)果顯示：與對(duì)照組相比，G10明顯抑制HepAD38細(xì)胞HBV DNA，最高抑制率可達(dá)14.8%。而G10直接刺激HepAD38細(xì)胞卻無(wú)類似效應(yīng)(見圖4)。提示G10可通過(guò)誘導(dǎo)THP1激活固有免疫反應(yīng)發(fā)揮抗HBV作用。

注：與對(duì)照組比較，*P<0.05。

3 討論

通過(guò)增強(qiáng)或恢復(fù)機(jī)體抗HBV免疫功能以控制和清除HBV感染的免疫治療，是當(dāng)前抗HBV治療的一個(gè)新策略[2，5]。此外，發(fā)現(xiàn)CHB患者接受HBV自愈者的骨髓移植后得到治愈，直接證實(shí)了免疫治療的有效性[6]。那么如何突破機(jī)體免疫耐受，重新激活免疫系統(tǒng)？宿主細(xì)胞通過(guò)模式識(shí)別受體(PRRs)識(shí)別并抵御病原體入侵的方式，讓人們更清晰地理解了細(xì)胞中調(diào)節(jié)固有免疫抵抗病原微生物在分子水平上的機(jī)制，可能為免疫治療提供了一種新策略。病原體入侵機(jī)體后通過(guò)多種途徑引起IFN-Ⅰ產(chǎn)生，病原體表面的病原相關(guān)分子模式(PAMPs)能被TLRs、維甲酸誘導(dǎo)基因1樣受體(RLRs)等PRRs識(shí)別介導(dǎo)抗感染固有免疫應(yīng)答，并調(diào)節(jié)適應(yīng)性免疫應(yīng)答[7]。

STING作為一種能識(shí)別細(xì)胞質(zhì)DNA的信號(hào)傳導(dǎo)分子和識(shí)別細(xì)菌第二信使的PRRs[8]，在病原體(病毒、細(xì)菌、寄生蟲等)感染時(shí)識(shí)別胞質(zhì)DNA、誘導(dǎo)IFN-Ⅰ、激發(fā)人體固有免疫，發(fā)揮免疫防御作用，在抵御病原微生物入侵、抗腫瘤免疫效應(yīng)中發(fā)揮重要作用[9-11]。STING作為抗HBV免疫治療的新靶點(diǎn)逐漸進(jìn)入人們的視野，其抗HBV作用日益受到人們的關(guān)注。可激活人源STING小分子化合物目前僅有G10和DSDP[12-13]，前者能夠激活STING-TBK1-IRF3通路、誘導(dǎo)IFN-Ⅰ表達(dá)，發(fā)揮抗病毒作用。后者是我們通過(guò)高通量藥物篩選體系從16 000個(gè)化合物中篩選出的人源STING激動(dòng)劑。前期的研究發(fā)現(xiàn)，DSDP能激活PBMCs和人成纖維細(xì)胞的STING-TBK1-IRF3通路，誘導(dǎo)IFN-Ⅰ的表達(dá)。DSDP在黃熱病病毒(yellow fever virus，YFV)、登革熱病毒(Dengue virus, DENV)及塞卡病毒(Zika virus，ZIKV)的抗病毒作用已被證實(shí)[12]。

我們的前期研究還發(fā)現(xiàn)，STING激動(dòng)劑cGAMP能誘導(dǎo)肝細(xì)胞產(chǎn)生包括IFN-β在內(nèi)大量的細(xì)胞因子，抑制感染HBV肝細(xì)胞HBV cccDNA轉(zhuǎn)錄，降低HBsAg表達(dá)[14]。但cGAMP激活STING通路需要破膜劑才能使藥物通過(guò)細(xì)胞膜，臨床應(yīng)用受限。本研究擬觀察人源STING激動(dòng)劑G10誘導(dǎo)人源細(xì)胞IFN-Ⅰ表達(dá)情況，并初步觀察其抗HBV作用，為STING激動(dòng)劑抗HBV治療提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)和理論依據(jù)。

由于肝細(xì)胞缺乏或低水平表達(dá)STING，直接用STING激動(dòng)劑處理肝細(xì)胞難以有效激活STING信號(hào)通路誘導(dǎo)IFN-Ⅰ、激發(fā)人體固有免疫，發(fā)揮抗HBV作用。而免疫細(xì)胞如巨噬細(xì)胞和抗原遞呈細(xì)胞(dendritic cells，DC)高表達(dá)STING可有效誘導(dǎo)IFN-Ⅰ、激發(fā)人體固有免疫。而肝臟微環(huán)境存在大量非實(shí)質(zhì)細(xì)胞如Kupffer細(xì)胞和DC高表達(dá)STING，推測(cè)G10有可能通過(guò)激活肝臟的免疫細(xì)胞，而后者釋放大量以IFN-Ⅰ為主細(xì)胞因子，發(fā)揮抗HBV作用。因此，我們用G10處理的THP1細(xì)胞上清液處理HepAD38細(xì)胞，建立間接抗HBV反應(yīng)體系，觀察G10在HepAD38的抗HBV作用。正如我們預(yù)期，我們的研究提示，G10能夠誘導(dǎo)PBMCs和THP1高表達(dá)以IFN-β為主的細(xì)胞因子。這提示G10能誘導(dǎo)人免疫細(xì)胞分泌IFN-β為主的細(xì)胞因子。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，與對(duì)照組相比，用G10處理后的THP1細(xì)胞上清液明顯抑制HepAD38細(xì)胞HBV DNA，最高抑制率可達(dá)14.8%。而G10直接刺激HepAD38細(xì)胞卻無(wú)類似效應(yīng)。提示G10可通過(guò)誘導(dǎo)THP1激活固有免疫反應(yīng)發(fā)揮抗HBV作用。我們的研究與以往研究一致[14-15]，證實(shí)了激活 STING能夠誘導(dǎo)固有免疫反應(yīng)而發(fā)揮抗HBV作用。

我們的研究進(jìn)一步證實(shí)了激活STING通路能夠誘導(dǎo)細(xì)胞因子表達(dá)發(fā)揮抗HBV作用，同時(shí)也證實(shí)開發(fā)人源小分子STING激動(dòng)劑作為治療CHB的免疫治療是可行的，為STING激動(dòng)劑抗HBV治療提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)和理論依據(jù)。本研究為靶向STING抗HBV免疫治療提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)和理論依據(jù)，為乙肝治療探索新方法。當(dāng)然，G10的抗HBV作用還需要在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中進(jìn)一步驗(yàn)證。