周愛珍 鮑珍貝 程斌 朱曉琪

中圖分類號 R283 文獻標志碼 A 文章編號 1001-0408（2019）03-0381-06

DOI 10.6039/j.issn.1001-0408.2019.03.20

摘 要 目的：建立同時測定溫郁金中莪術(shù)二酮、莪術(shù)醇、牻牛兒酮、呋喃二烯、β-欖香烯含量的方法，并優(yōu)化其產(chǎn)地加工方法。方法：采用高效液相色譜（HPLC）法。色譜柱為ODS SP C18，流動相為乙腈-0.05 %磷酸溶液（梯度洗脫），流速為1.0 mL/min，檢測波長為214 nm，柱溫為30 ℃，進樣量為10 μL。將新鮮溫郁金藥材經(jīng)蒸/煮（10、20、30、40 min）、烘干（溫度分別為50、60、70 ℃）后制備18批樣品藥材并測定各批藥材中5種成分的含量；以灰色關(guān)聯(lián)分析法得到的相對關(guān)聯(lián)度（ri）為評價指標，優(yōu)選溫郁金藥材的最優(yōu)產(chǎn)地加工方法。結(jié)果：莪術(shù)二酮、莪術(shù)醇、牻牛兒酮、呋喃二烯、β-欖香烯的檢測質(zhì)量濃度線性范圍分別為25.56～409.0、2.05～32.8、6.36～102.0、9.14～146.0、8.62～138.0 μg/mL（r均≥0.999 2），精密度、穩(wěn)定性、重復性試驗的RSD均<2.0%（n=6）；定量限分別為0.34、0.62、0.11、0.14、1.20 μg/mL，檢測限分別為0.10、0.19、0.03、0.04、0.42 μg/mL；平均加樣回收率分別為101.3%、98.7%、99.0%、99.6%、96.4%（RSD均<2.8%，n=6）；灰色關(guān)聯(lián)分析結(jié)果顯示，煮10 min-50 ℃烘干的加工方法的ri最大，對溫郁金藥材中莪術(shù)二酮、莪術(shù)醇、牻牛兒酮、呋喃二烯、β-欖香烯含量影響最小。結(jié)論：HPLC法可用于溫郁金藥材中5種成分的含量測定，本次優(yōu)化結(jié)果可為溫郁金藥材產(chǎn)地加工方法的選擇提供參考。

關(guān)鍵詞 溫郁金；含量測定；產(chǎn)地加工；高效液相色譜法；灰色關(guān)聯(lián)度分析法

ABSTRACT OBJECTIVE： To establish the method for simultaneous determination of curdione， curcumenol， germacrone， furanodiene and β-elemene in Curcuma wenyujin， and to optimize its processing method in production place. METHODS： HPLC method was adopted. The determination was performed on ODS SP C18 column with mobile phase consisted of acetonitrile-0.05% phosphoric acid solution （gradient elution） at the flow rate of 1.0 mL/min. The detection wavelength was set at 214 nm， and column temperature was 30 ℃. The sample size was 10 μL. 18 batches of sample medicinal materials were prepared by steaming-drying （10， 20， 30， 40 min）， or cooking-drying （drying temperature 50， 60， 70 ℃）， and then the contents of 5 components were determined. Relative relational degree （ri） obtained by grey relational analysis method as indexes was used to optimize the processing methods of C. wenyujin in production place using. RESULTS： The linear range of curdione， curcumenol， germacrone， furanodiene and β-elemene were 25.56-409.0， 2.05-32.8， 6.36-102.0， 9.14-146.0， 8.62-138.0 μg/mL （r≥0.999 2）， respectively. RSDs of precision， stability and reproducibility tests were all lower than 2.0% （n=6）. Quantitative limits were 0.34， 0.62， 0.11， 0.14 and 1.20 μg/mL， and detection limits were 0.10， 0.19， 0.03， 0.04 and 0.42 μg/mL， respectively. The average recoveries were 101.3%， 98.7%， 99.0%， 99.6%， 96.4%， respectively （RSD<2.8%， n=6）. The results of grey relational analysis showed that the relative relational degree （ri） from the processing technology of “boil for 10 min-drying at 50 ℃” was greatest， which had relatively small comprehensive effect on the contents of curdione， curcumenol， germacrone， furanodiene and β-elemene respectively. CONCLUSIONS： Established HPLC method can be used for content determination of 5 components in C. wenyujin. The results of optimization can provide reference for the selection of processing method of C. wenyujin in production place.

KEYWORDS Curcuma wenyujin； Content determination； Processing in production place； HPLC； Grey relational analysis method

溫郁金為姜科植物溫郁金（Curcuma wenyujin Y. H. Chen et C. Ling）的干燥塊根，其性寒，味辛、苦，歸肝、心、肺經(jīng)，是一味具有活血止痛、行氣解郁、清心涼血、利膽退黃功效的臨床常用中藥，主治胸腹刺痛、胸痹心痛、經(jīng)閉痛經(jīng)、乳房脹痛、黃疸尿赤等[1]?，F(xiàn)代研究表明，溫郁金藥材所含的主要活性成分以倍半萜類化合物為主[2]，具有抗腫瘤、抗血栓、抗炎等多種藥理活性，如莪術(shù)二酮、莪術(shù)醇、牻牛兒酮（吉馬酮）、呋喃二烯、β-欖香烯等均具有較強的抑制腫瘤細胞生長和誘導腫瘤細胞凋亡的作用[3-5]；莪術(shù)二酮、莪術(shù)醇、β-欖香烯等具有抗血栓、改善血液循環(huán)等作用[6-8]；莪術(shù)二酮、莪術(shù)醇、牻牛兒酮等具有顯著的抗炎鎮(zhèn)痛作用[9-11]。鑒于溫郁金顯著的藥理活性，其開發(fā)和應(yīng)用愈來愈受到廣泛關(guān)注[2]。

道地藥材的加工方法是形成中藥材道地性的關(guān)鍵因素之一，直接關(guān)系到道地藥材的質(zhì)量，尤其是現(xiàn)階段道地藥材規(guī)?；?、產(chǎn)業(yè)化的迅速發(fā)展，落后的加工水平已經(jīng)成為制約其發(fā)展的瓶頸[12]。溫郁金作為傳統(tǒng)的“浙八味”藥材，主產(chǎn)地在浙江溫州，已有近900年的栽培歷史[13]。關(guān)于郁金藥材的加工和質(zhì)量標準，2015年版《中國藥典》（一部）（以下簡稱“藥典”）規(guī)定的加工方法為冬季莖葉枯萎后采挖，除去泥沙和細根，蒸或煮至透心，然后干燥即得；質(zhì)量標準中僅規(guī)定了性狀鑒別、顯微和色譜鑒別、水分和總灰分測定檢查項[1]，缺乏含量測定等關(guān)鍵性的質(zhì)控項目。本課題組通過對瑞安、樂清等溫郁金藥材產(chǎn)地的調(diào)研發(fā)現(xiàn)，各地的加工方法主要是采用清水煮后曬干法（清水煮后，挑選較大者折斷，用指甲掐其內(nèi)心，如無響聲或粉質(zhì)稍微熟透，撈出、曬干即得）。無論是藥典收載的加工方法，還是傳統(tǒng)的產(chǎn)地加工方法都缺乏具體、可控的技術(shù)參數(shù)，農(nóng)戶操作隨意性大，操作過程和成品質(zhì)量僅憑農(nóng)戶主觀經(jīng)驗判斷，其產(chǎn)地加工工藝亟待規(guī)范化和產(chǎn)業(yè)化。

由于溫郁金的采收季節(jié)在冬季，氣溫相對較低，對于富含淀粉（30%～40%）的新鮮溫郁金藥材而言，若不經(jīng)過蒸或煮的加工處理，則很難曬干，極易出現(xiàn)腐爛變質(zhì)的現(xiàn)象，傳統(tǒng)方法加熱處理后易于干燥和保存，適合產(chǎn)地實際情況。本文在前期調(diào)研和預(yù)試驗的基礎(chǔ)上，參考相關(guān)研究[2-11]中藥理作用顯著且含量相對較高的莪術(shù)二酮、莪術(shù)醇、牻牛兒酮、呋喃二烯、β-欖香烯5種成分為評價指標，采用高效液相色譜（HPLC）法建立溫郁金藥材中5種活性成分的含量測定方法，并結(jié)合灰色關(guān)聯(lián)分析法對溫郁金藥材的產(chǎn)地加工方法進行綜合評價，為規(guī)范道地藥材溫郁金的產(chǎn)地加工和品質(zhì)評價提供試驗依據(jù)。

1 材料

1.1 儀器

DGU-20A系列HPLC系統(tǒng)（日本島津有限公司）；XS105電子分析天平（瑞士Mettler Toledo公司）；BS124 S電子天平（德國賽多利斯科學儀器有限公司）；SB-5200D超聲波清洗機（寧波新芝生物科技股份有限公司）；YF-150B粉碎機（浙江瑞安市永歷制藥機械有限公司）；CT-C熱風循環(huán)烘箱（江蘇江陰江拓機械設(shè)備有限公司）；ZGY-500可傾式蒸煮鍋（臺州春江制藥機械有限公司）；DSH-50快速水分測定儀（上海越平科學儀器有限公司）。

1.2 藥品與試劑

莪術(shù)二酮（批號：111800-201302，純度：99.8%）、莪術(shù)醇（批號：100185-201007，純度：99.9%）、牻牛兒酮（批號：111665-201605，純度：99.8%）、呋喃二烯（批號：111824-201102，純度：99.4%）、β-欖香烯（批號：100268- 201402，純度：99.4%）對照品均購自中國食品藥品檢定研究院；甲醇、乙腈為色譜純，其余試劑為分析純；溫郁金新鮮藥材于2018年1月采集，產(chǎn)地為浙江省溫州市陶山鎮(zhèn)，經(jīng)浙江醫(yī)藥高等?？茖W校楊雄志教授鑒定為姜科植物溫郁金的塊根。

2 方法與結(jié)果

2.1 溫郁金藥材的不同加工方法

本課題組結(jié)合前期預(yù)試驗，分別稱取新鮮溫郁金藥材500 g，于蒸煮鍋內(nèi)加入10倍量冷水，以沸騰時開始計時，按表1中的不同加工方法對溫郁金樣品進行處理，采用熱風循環(huán)加熱烘干至含水量為12%左右（藥典規(guī)定不超過15%[1]）取出，放冷，密封包裝，置于陰涼干燥處保存，備用。

2.2 莪術(shù)二酮、莪術(shù)醇、牻牛兒酮、呋喃二烯、β-欖香烯的含量測定

2.2.1 色譜條件 色譜柱為ODS SP C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動相為乙腈（A）-0.05%磷酸溶液（B），梯度洗脫（0～20 min，50%→60%A；20～25 min，60%→65%A；25～30 min，65%→80%A；30～38min，80%A；38～40 min，80%→90%A；40～50 min，90%A）；流速為1.0 mL/min；檢測波長為214 nm；柱溫為30 ℃；進樣量為10 μL。

2.2.2 溶液的制備 （1）混合對照品溶液的制備。分別取莪術(shù)二酮、莪術(shù)醇、牻牛兒酮、呋喃二烯、β-欖香烯對照品適量，置于棕色量瓶中，用甲醇溶解并定容至刻度，得莪術(shù)二酮、莪術(shù)醇、牻牛兒酮、呋喃二烯、β-欖香烯質(zhì)量濃度分別為0.852、1.025、0.848、0.914、1.724 mg/mL的單一對照品貯備液。分別精密吸取上述貯備液適量置于5 mL棕色量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，得莪術(shù)二酮、莪術(shù)醇、牻牛兒酮、呋喃二烯、β-欖香烯的質(zhì)量濃度分別為0.102、0.041、0.025、0.036、0.344 mg/mL的混合對照品溶液。（2）供試品溶液的制備。取S7溫郁金藥材粉末1.0 g，精密加入甲醇20 mL，密塞，稱質(zhì)量，超聲（功率：200 W，頻率：50 kHz）處理40 min，放冷；擦干外壁，密塞，再稱質(zhì)量，用甲醇補足減失的質(zhì)量，搖勻，過0.45 μm濾膜，取續(xù)濾液即得。

2.2.3 系統(tǒng)適用性考察 精密吸取“2.2.2”項下混合對照品溶液、供試品溶液各10 μL，按“2.2.1”項下色譜條件進樣測定，記錄色譜圖。結(jié)果表明，各檢測成分之間分離度均大于1.5，理論板數(shù)以莪術(shù)二酮峰計不小于20 000。2種溶液的高效液相色譜圖見圖1。

2.2.4 線性關(guān)系考察 精密吸取“2.2.2”項下莪術(shù)二酮、莪術(shù)醇、牻牛兒酮、呋喃二烯、β-欖香烯單一對照品貯備液各2.4、0.16、0.6、0.8、0.4 mL，置于5 mL棕色量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻；采用2倍稀釋法稀釋獲得5個質(zhì)量濃度的系列對照品溶液后，按“2.2.1”項下色譜條件進樣測定，以對照品的質(zhì)量濃度為橫坐標（x）、峰面積為縱坐標（y）進行線性回歸。結(jié)果，莪術(shù)二酮、莪術(shù)醇、牻牛兒酮、呋喃二烯、β-欖香烯的檢測質(zhì)量濃度線性范圍分別為25.56～409.0、2.050～32.80、6.360～102.0、9.145～ 146.0、8.620～138.0 μg/mL（r均≥0.999 2，n=5），5種成分線性關(guān)系考察結(jié)果見表2。

2.2.5 檢測限及定量限考察 精密吸取“2.2.2”項下的單一對照品貯備液適量，逐級稀釋后，按“2.2.1”項下色譜條件進樣測定，在信噪比（S/N）為3時計算檢測限，S/N為10時計算定量限，結(jié)果見表2。

2.2.6 精密度試驗 精密吸取“2.2.2”項下的混合對照品溶液10 μL，按“2.2.1”項下色譜條件連續(xù)進樣6次，記錄色譜圖。結(jié)果，莪術(shù)二酮、莪術(shù)醇、牻牛兒酮、呋喃二烯、β-欖香烯峰面積的RSD分別為0.12%、0.18%、0.12%、0.09%、0.69%（n=6），表明儀器精密度良好。

2.2.7 穩(wěn)定性試驗 精密吸取“2.2.2”項下的供試品溶液10 μL，按“2.2.1”項下色譜條件，分別于0、2、4、8、12、24 h進樣測定，記錄色譜圖。結(jié)果，莪術(shù)二酮、莪術(shù)醇、牻牛兒酮、呋喃二烯、β-欖香烯峰面積的RSD分別為0.88%、1.70%、0.49%、0.54%、1.90%（n=6），表明樣品在24 h內(nèi)具有較好的穩(wěn)定性。

2.2.8 重復性試驗 取S7樣品，按照“2.2.2”項下供試品溶液的制備方法，平行制備6份供試品溶液，按“2.2.1”項下色譜條件進樣測定，記錄色譜圖，計算含量。結(jié)果，莪術(shù)二酮、莪術(shù)醇、牻牛兒酮、呋喃二烯、β-欖香烯含量的RSD分別為1.6%、1.9%、1.5%、1.1%、1.4%（n=6），表明方法的重復性良好。

2.2.9 加樣回收率試驗 取已知含量的S7樣品0.5 g，分別加入等量的對照品，按照“2.2.2”項下供試品溶液的制備方法平行制備6份，按“2.2.1”項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積并計算各成分的加樣回收率及其RSD。結(jié)果顯示，莪術(shù)二酮、莪術(shù)醇、牻牛兒酮、呋喃二烯、β-欖香烯平均加樣回收率分別為101.3%、98.7%、99.0%、99.6%、96.4%，RSD分別為2.6%、1.7%、2.7%、2.3%、1.3%（n=6），詳見表3。

2.3 樣品測定結(jié)果及分析

分別取溫郁金不同方法加工的藥材（S1～S18）粉末1.0 g，按“2.2.2”項下供試品溶液制備方法平行制備3份，按“2.2.1”項下色譜條件進樣測定，計算溫郁金不同方法加工藥材中5種成分的含量，結(jié)果見表4。

根據(jù)表4中的結(jié)果，以各樣品所含莪術(shù)二酮、莪術(shù)醇、牻牛兒酮、呋喃二烯和β-欖香烯的含量為縱坐標，溫郁金不同加工方法（煮-烘干、蒸-烘干）為橫坐標繪制關(guān)聯(lián)圖，結(jié)果見圖2。

由表4及圖2可知，采用煮-烘干工藝加工溫郁金藥材時，煮10 min-50 ℃烘干工藝制得的樣品（S1）中莪術(shù)二酮、牻牛兒酮、呋喃二烯和β-欖香烯的含量最高，煮20 min-50 ℃烘干工藝制得的樣品（S4）中莪術(shù)醇含量最高；采用蒸-烘干工藝加工溫郁金藥材時，蒸20 min-50 ℃烘干工藝制得樣品（S10）中莪術(shù)醇、牻牛兒酮、呋喃二烯和β-欖香烯的含量最高，蒸20 min-60 ℃烘干工藝制得的樣品（S11）中莪術(shù)二酮的含量最高。煮-烘干、蒸-烘干工藝的比較結(jié)果可知，煮10 min-50 ℃烘干工藝制得的樣品（S1）中莪術(shù)二酮、牻牛兒酮的含量最高，煮20 min-50 ℃烘干工藝制得的樣品（S4）中莪術(shù)醇含量最高，而蒸20 min-50 ℃烘干工藝制得樣品（S10）中呋喃二烯、β-欖香烯的含量最高。

2.4 溫郁金藥材不同加工方法與活性成分含量灰色關(guān)聯(lián)分析

基于“2.3”項下結(jié)果可知，僅憑1～2個指標成分含量高低難以客觀地優(yōu)選出溫郁金藥材的最佳加工方法，因此，筆者采用灰色關(guān)聯(lián)分析法[14]，應(yīng)用DPS 7.5統(tǒng)計軟件對溫郁金藥材不同加工方法與莪術(shù)二酮、莪術(shù)醇、牻牛兒酮、呋喃二烯和β-欖香烯等活性成分的含量等進行灰色關(guān)聯(lián)分析，以綜合評價不同加工方法對上述成分含量的影響，從而優(yōu)選出最佳的溫郁金藥材加工方法。

2.4.1 參考序列的選擇 根據(jù)灰色關(guān)聯(lián)理論[14]，筆者將溫郁金藥材的活性成分作為一個灰色系統(tǒng)，不同的活性成分為子系統(tǒng)，每個活性成分的含量為一個灰元（元素），進行關(guān)聯(lián)分析計算。設(shè)有樣品數(shù)n個，每個樣品的評價指標有m項，即組成評價單元序列{Xik}，（i=1，2，3……，n；k=1，2，3……，m；本研究中溫郁金藥材樣品數(shù) n=18，活性成分數(shù)m=5）。設(shè)最優(yōu)參考序列為{Xsk}，由n個樣品對應(yīng)指標的最大值組成；最差參考序列為{Xtk}，由n個樣品對應(yīng)指標的最小值組成（k=1，2，3……m）。

2.4.2 原始數(shù)據(jù)的格式化處理 由于各含量指標間獨立性的問題[15]，本文采用均值化變換，將原始數(shù)據(jù)按公式①Yik=Xik/Xk（Yik為規(guī)格化處理后的數(shù)據(jù)，Xik為原始數(shù)據(jù)，Xk為n個樣品第k個指標的均值）進行格式化處理，結(jié)果見表 5。