黃山雨，梁立濱，李俊平，王 倩，趙青青，周陳陳，趙玉輝，王廣文，李奇兵，孔凡迪，李呈軍，陳化蘭，姜 麗

(中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院哈爾濱獸醫(yī)研究所獸醫(yī)生物技術(shù)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，黑龍江 哈爾濱 150069)

禽流感病毒(Avian influenza virus，AIV)屬于正黏病毒科，流感病毒屬。AIV 基因組由8 個(gè)分節(jié)段的單股負(fù)鏈 RNA 組成，分別是 PB1、PB2、PA、HA、NP、NA、M 和NS。其中NS1 由最小的片段NS 編碼，是AIV 重要的非結(jié)構(gòu)蛋白。NS1 的主要作用是抑制干擾素產(chǎn)生，抑制宿主基因的表達(dá)。目前已經(jīng)報(bào)道的與NS1 相互作用的蛋白有 PKR[1]、RIG-I[2]、 CPSF30[3]、 TRIM25[4]和 IKK[5]等，且大多均是宿主體內(nèi)與抗病毒功能相關(guān)的蛋白。同時(shí)NS1具有雙鏈RNA 結(jié)合結(jié)構(gòu)域，可以阻止雙鏈RNA 對(duì)模式識(shí)別受體RIG-I 的激活[6]。宿主因子停泊蛋白6(Docking protein 6，DOK6)屬于DOK 家族發(fā)現(xiàn)較晚的蛋白，目前對(duì)其分子功能知之甚少，尚無(wú)DOK6與流感病毒相互作用的報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)免疫共沉淀結(jié)合質(zhì)譜分析的方式篩選出能夠與NS1 蛋白相互作用的DOK6 蛋白，旨在揭示NS1 蛋白與DOK6 蛋白的相互作用，為深入研究流感病毒在宿主體內(nèi)的復(fù)制機(jī)制提供參考數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞系、質(zhì)粒和病毒 HEK293T 細(xì)胞、A549細(xì)胞由本實(shí)驗(yàn)室保存、pCAGGS 真核表達(dá)載體由Yoshihiro Kawaoka 教授惠贈(zèng)；pCAGGS-V5、pCAGGSFlag 真核表達(dá)載體由本實(shí)驗(yàn)室基于pCAGGS 改造構(gòu)建，雙分子熒光互補(bǔ)(BiFC)真核表達(dá)載體pCAGGSVN、pCAGGS-VC 由中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院哈爾濱獸醫(yī)研究所華榮虹副研究員惠贈(zèng)[7](由pCAGGS 載體改造，分別插有熒光分子Venus 的N 端和C 端，分割點(diǎn)為Venus分子第173位氨基酸)，pCAGGS-Flag-NS1、pCAGGS-V5-NS1 和pHH21-WSN-NS1 由本實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建，流感病毒A/WSN/1933(H1N1)由本實(shí)驗(yàn)室保存。

1.2 抗體及主要試劑 鼠抗Flag 單克隆抗體(MAb)、兔抗Flag 多克隆抗體、兔抗V5 多克隆抗體、Anti-Flag M2 親和瓊脂糖珠購(gòu)自Sigma 公司；兔抗 NS1 多克隆抗體購(gòu)自 Genetex 公司，鼠抗β-actin MAb 購(gòu)自 Santa Cruz 公司。Dylight 800 標(biāo)記的山羊抗鼠IgG (H+L)、DyLight 800 標(biāo)記的山羊抗兔IgG (H+L)購(gòu)自KPL 公司；Alexa Fluor 488 結(jié)合的山羊抗兔 IgG、Alexa Fluor 633 結(jié)合的山羊抗兔IgG、Alexa Fluor 488 結(jié)合的山羊抗鼠 IgG、Alexa Fluor 633 結(jié)合的山羊抗鼠 IgG、Hoechst 33342 均購(gòu)自Thermo Fisher Scientific 公司；RNA 提取試劑盒、質(zhì)粒中提試劑盒、膠回收試劑盒均購(gòu)自Qiagen 公司；質(zhì)粒小提試劑盒、DNA 純化試劑盒均購(gòu)自Axygen 公司；DMEM 培養(yǎng)基、Opti-MEM 培養(yǎng)基、F-12K 培養(yǎng)基、轉(zhuǎn)染試劑Lipofectamine LTX 均購(gòu)自Invitrogen 公司；胎牛血清(FBS)購(gòu)自Biological Industries公司；TransIT-X2 Transfection Reagent購(gòu)自Mirus公司；Q5 高保真PCR 酶，各種限制性內(nèi)切酶均購(gòu)自NEB公司；DL5000 DNA Marker、同源重組酶均購(gòu)自Vazyme公司；細(xì)胞裂解液NP40、蛋白酶抑制劑(PMSF)均購(gòu)自碧云天生物公司。

1.3 重組質(zhì)粒的構(gòu)建與鑒定 根據(jù)DOK6 參考序列(gene ID：220164)、A/WSN/1933(H1N1)流感病毒NS1蛋白參考序列(LC333189.1)設(shè)計(jì)引物。提取A549 細(xì)胞RNA，反轉(zhuǎn)錄獲得cDNA，以其為模板，采用引物DOK6-F-pCAGGS/DOK6-R-pCAGGS，擴(kuò)增DOK6 基因片段。將 pCAGGS-Flag 與 pCAGGS-V5經(jīng)KpnⅠ和XhoⅠ雙酶切后，與上述擴(kuò)增的DOK6基因片段同源重組構(gòu)建pCAGGS-Flag-DOK6 與pCAGGS-V5-DOK6 真核表達(dá)質(zhì)粒。利用構(gòu)建的pCAGGS-Flag-DOK6 質(zhì)粒為模板，采用引物DOK6-F-BiFC/DOK6-R-BiFC 擴(kuò)增DOK6 基因全長(zhǎng)片段，采用引物 DOK6-F-BiFC/DOK6-R339-BiFC PCR 擴(kuò)增DOK6 的 Pleckstrin 同源結(jié)構(gòu)域(Pleckstrin homology domain，PH) (aa1 ～aa113)基因片段，采用引物DOK6-F391-BiFC/DOK6-R714-BiFC PCR 擴(kuò)增 DOK6的PTB 結(jié)構(gòu)域(aa131～aa238)基因片段，采用引物DOK6-F-BiFC/DOK6-R714-BiFC PCR擴(kuò)增DOK6結(jié)構(gòu)域 PH+PTB (aa1～aa238)基因片段，采用引物DOK6-F391-BiFC/DOK6-R-BiFC PCR擴(kuò)增DOK6結(jié)構(gòu)域 PTB+C-Terminal (aa131 ～aa331)基因片段(圖1)。將以上擴(kuò)增片段，與經(jīng)SacⅠ/XhoⅠ酶切的pCAGGS-VN 與pCAGGS-VC 載體同源重組，分別構(gòu)建重組質(zhì)粒：pCAGGS-DOK6-VN、pCAGGS-DOK6-VC、pCAGGS-PH-VC、pCAGGS-PTB-VC、pCAGGS-(PH+PTB)-VC、pCAGGS-(PTB+C-Ter)-VC。以 pHH21-WSN-NS1 質(zhì)粒為模板，采用引物NS1-F-BiFC/NS1-R-BiFC PCR 擴(kuò)增NS1 全長(zhǎng)基因片段，按照上述方法構(gòu)建重組質(zhì)粒pCAGGS-NS1-VN、pCAGGSNS1-VC。所有重組質(zhì)粒均利用pCAGGS 上下游通用引物PCR 鑒定，并通過(guò)測(cè)序進(jìn)一步鑒定。上述引物具體信息見表1。

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1.4 DOK6 與NS1 相互作用的免疫共沉淀(Co-IP)試驗(yàn) 采用 Lipofectamine LTX 將 pCAGGS-Flag-NS1+pCAGGS-V5-DOK6 共轉(zhuǎn)染至6 孔板中密度為80 %的293T 細(xì)胞，同時(shí)分別轉(zhuǎn)染pCAGGS-Flag-NS1+pCAGGS 和 pCAGGS-V5-DOK6+pCAGGS 作 為對(duì)照，每種質(zhì)粒各1 g。轉(zhuǎn)染48 h 后，按200 μL/孔加入NP40 (含PMSF)，裂解細(xì)胞30 min，離心，收集上清全細(xì)胞裂解液(Whole cell lysates，WCL)，取20 μL 作為對(duì)照 ，剩余的樣品加入20 μL Anti-Flag M2 親和瓊脂糖珠過(guò)夜結(jié)合。結(jié)合后瓊脂糖珠經(jīng)預(yù)冷PBS 洗滌5 次，最后加30 μL 2×蛋白上樣緩沖液重懸，煮沸變性5min，作為Co-IP 樣品。WCL樣品和Co-IP 樣品經(jīng)SDS-PAGE 電泳，轉(zhuǎn)印至NC膜，分別用兔抗V5 多克隆抗體(1∶1 000)和兔抗Flag多克隆抗體(1∶1 000)作為一抗，用DyLight 800 標(biāo)記的山羊抗兔 IgG (H+L) (1 ∶10 000)作為二抗， 經(jīng)western blot 檢測(cè)轉(zhuǎn)染蛋白表達(dá)與免疫共沉淀結(jié)果。

1.5 DOK6 與NS1 相互作用的的激光共聚焦試驗(yàn)將A549 細(xì)胞傳代至激光共聚焦培養(yǎng)皿中，并于次日利用Mirus TransIT-X2，共轉(zhuǎn)染pCAGGS-V5-NS1+pCAGGS-Flag-DOK6 至A549 細(xì)胞，同時(shí)分別轉(zhuǎn)染質(zhì)粒 pCAGGS-V5-NS1+pCAGGS 和 pCAGGS-Flag-DOK6+pCAGGS 作為對(duì)照，每種質(zhì)粒各1 g。36 h后，使用4 %多聚甲醛常溫固定細(xì)胞30 min 或4 ℃過(guò)夜，PBS 洗滌，0.1%Triton X-100 常溫通透15 min，PBS 洗滌，最后使用5 %脫脂乳封閉1 h。以鼠抗Flag MAb (1∶200)和兔抗 V5 多克隆抗體(1∶200)為一抗，Alexa Fluor 488 結(jié)合的山羊抗兔 IgG (1∶500)和Alexa Fluor 633 結(jié)合的山羊抗鼠 IgG (1∶500)為二抗，DAPI 染核后經(jīng)激光共聚焦顯微鏡觀察DOK6 蛋白與NS1 蛋白的亞細(xì)胞定位情況。

1.6 DOK6 與NS1 相互作用的雙分子熒光互補(bǔ)試驗(yàn)(BiFC) 待96 孔板中的293T 細(xì)胞密度接近70 %時(shí)，分別共轉(zhuǎn)染pCAGGS-DOK6-VN+pCAGGS-NS1-VC 與 pCAGGS-DOK6-VC+pCAGGS-NS1-VN，每種質(zhì)粒各轉(zhuǎn)染100 ng，同時(shí)共轉(zhuǎn)染pCAGGS-NA-VC+pCAGGS-DOK6-VN 作為陰性對(duì)照， 共轉(zhuǎn)染pCAGGS-SPCS1-VN+pCAGGS-JEV-NS2B-VC[7]作為陽(yáng)性對(duì)照。36 h 后，棄培養(yǎng)液，加入4 %多聚甲醛4 ℃過(guò)夜固定。第2 d 棄固定液，加入 100 μL Hoechst 33342，常溫核染4 h 后，將96 孔板移至高內(nèi)涵細(xì)胞篩選系統(tǒng)進(jìn)行熒光信號(hào)的檢測(cè)。為了確認(rèn)NS1 與DOK6 相互作用精確的結(jié)構(gòu)域，用同樣的方法將pCAGGS-PH-VC、pCAGGS-PTB-VC、pCAGGS-(PH+PTB)-VC、 pCAGGS- (PTB+C-Ter)-VC分別與pCAGGS-NS1-VN共轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞，共轉(zhuǎn)染pCAGGS-SPCS1-VN+pCAGGS-JEV-NS2B-VC[7]作為陽(yáng)性對(duì)照。使用高內(nèi)涵細(xì)胞篩選系統(tǒng)進(jìn)行熒光信號(hào)的檢測(cè)。

2 結(jié) 果

2.1 重組質(zhì)粒的鑒定結(jié)果 利用pCAGGS 載體上下游通用引物對(duì)所構(gòu)建的載體pCAGGS-Flag-DOK6、pCAGGS-V5-DOK6、pCAGGS-DOK6-VN、pCAGGSDOK6-VC、 pCAGGS-NS1-VN、 pCAGGS-NS1-VC、pCAGGS-PH-VC、 pCAGGS-PTB-VC、 pCAGGS-(PH+PTB)-VC、pCAGGS-(PTB+C-Ter)-VC 分別經(jīng)PCR鑒定，結(jié)果顯示，插入基因序列大小均與預(yù)期一致，從左到右分別為1 053 bp、1 071 bp、1 545 bp、1 224 bp、1 239 bp、918 bp、567 bp、552 bp、942 bp、831 bp (圖2)，進(jìn)一步通過(guò)測(cè)序鑒定各基因序列完全正確。表明正確構(gòu)建以上各表達(dá)載體。

2.2 DOK6 與 NS1 相互作用的 Co-IP 驗(yàn)證結(jié)果將 pCAGGS-V5-DOK6+pCAGGS-Flag-NS1共轉(zhuǎn)染HEK293T 細(xì)胞，同時(shí)以pCAGGS-V5-DOK6+pCAGGS和 pCAGGS-Flag-NS1+pCAGGS 為陰性對(duì)照，利用Co-IP 檢測(cè)DOK6 蛋白與NS1 蛋白的互作。結(jié)果顯示，WCL 中，在 26 ku (NS1 蛋白)和 38 ku (DOK6)處有特異性條帶。利用抗Flag 瓊脂糖珠沉淀NS1 蛋白后用兔抗Flag 多克隆抗體和兔抗V5 多克隆抗體檢測(cè)NS1 蛋白與DOK6 蛋白結(jié)合情況，發(fā)現(xiàn)NS1 蛋白均能夠被良好沉淀下來(lái)，26 ku (NS1)處有條帶檢出，而且在沉淀NS1 蛋白的同時(shí)，DOK6 蛋白同時(shí)也被沉淀下來(lái)，38 ku (DOK6)處有條帶檢出，而單獨(dú)轉(zhuǎn)染pCAGGS-V5-DOK6+pCAGGS，由于體系無(wú)NS1 蛋白表達(dá)，DOK6 并沒有被沉淀下來(lái)，38 ku 處無(wú)特異性條帶； 單獨(dú)轉(zhuǎn)染pCAGGS-Flag-NS1+pCAGGS 也無(wú)該 38 ku 特異性條帶(圖3)。表明DOK6 蛋白與NS1 蛋白存在特異的相互作用。

2.3 NS1 與DOK6 細(xì)胞內(nèi)共定位的驗(yàn)證結(jié)果 將pCAGGS-V5-NS1+pCAGGS-Flag-DOK6 共轉(zhuǎn)染 A549細(xì)胞，利用激光共聚焦顯微鏡觀察該兩個(gè)蛋白在細(xì)胞中的共定位。結(jié)果顯示，表達(dá)的NS1 蛋白廣泛分布于整個(gè)細(xì)胞中，表達(dá)的DOK6 蛋白主要定位于細(xì)胞質(zhì)中，DOK6 蛋白與NS1 蛋白在細(xì)胞質(zhì)中存在共定位(圖4)。表明NS1 蛋白與DOK6 蛋白主要在細(xì)胞質(zhì)中發(fā)生相互作用。

2.4 NS1 與DOK6 相互作用的BiFC 驗(yàn)證 分別將pCAGGS-DOK6-VN+pCAGGS-NS1-VC 與 pCAGGSDOK6-VC+pCAGGS-NS1-VN 共轉(zhuǎn)染至293T 細(xì)胞后，采用高內(nèi)涵細(xì)胞篩選系統(tǒng)分析熒光強(qiáng)度，藍(lán)色熒光為細(xì)胞核所發(fā)出，金黃色熒光為存在相互作用的兩個(gè)分子將Venus 分子的VN 和VC 片段拉近并重新組合后發(fā)出，結(jié)果顯示DOK6 蛋白與NS1 蛋白共轉(zhuǎn)染均能檢測(cè)到較強(qiáng)金黃色熒光(圖5)，與陽(yáng)性對(duì)照亮度接近，而陰性對(duì)照未發(fā)出金黃色熒光。表明NS1 蛋白與DOK6 蛋白發(fā)生了相互結(jié)合，即通過(guò)BiFC 試驗(yàn)證實(shí)了NS1 蛋白與DOK6 蛋白存在相互作用。

為了進(jìn)一步確定DOK6 蛋白與NS1 蛋白互作的結(jié)構(gòu)域，將 pCAGGS-DOK6-VC 及含DOK6 不同區(qū)段質(zhì)粒pCAGGS-PH-VC、pCAGGS-PTB-VC、pCAGGS-(PH+PTB)-VC、 pCAGGS- (PTB+C-Ter)-VC 分 別 與pCAGGS-NS1-VN 共轉(zhuǎn)染293T 細(xì)胞，觀察熒光信號(hào)，結(jié)果可見NS1 蛋白與DOK6 蛋白的PTB 結(jié)構(gòu)域(aa131～aa238)結(jié)合發(fā)出的熒光強(qiáng)度明顯高于其與其它區(qū)段結(jié)合發(fā)出的熒光強(qiáng)度(圖6)。表明NS1 蛋白與DOK6 蛋白的PTB 結(jié)構(gòu)域存在明顯的相互作用。另外，結(jié)果還顯示，當(dāng)PH 結(jié)構(gòu)域與PTB 結(jié)構(gòu)域相連時(shí)，NS1 蛋白與PTB 結(jié)構(gòu)域的相互作用就會(huì)大為削弱，提示PH 結(jié)構(gòu)域可能在PTB 結(jié)構(gòu)域活性調(diào)節(jié)上起作用。

3 討 論

本實(shí)驗(yàn)室前期工作通過(guò)以NS1 蛋白作為誘餌蛋白，利用免疫沉淀結(jié)合質(zhì)譜分析技術(shù)篩選到與其互作的宿主因子DOK6。本實(shí)驗(yàn)將pCAGGS-V5-NS1 和pCAGGS-Flag-DOK6 轉(zhuǎn)染293T 細(xì)胞，通過(guò)免疫共沉淀實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證了NS1 蛋白與DOK6 蛋白存在相互作用，利用激光共聚焦實(shí)驗(yàn)分析轉(zhuǎn)染后蛋白的表達(dá)及定位表明這兩個(gè)蛋白在細(xì)胞質(zhì)中存在明顯共定位，通過(guò)BiFC 進(jìn)一步證明了DOK6 蛋白的PTB 結(jié)構(gòu)域與NS1 蛋白存在相互作用。實(shí)驗(yàn)結(jié)果為進(jìn)一步研究DOK6 蛋白與NS1 蛋白相互作用機(jī)制奠定了基礎(chǔ)，完善了病毒NS1 蛋白與宿主蛋白相互作用的網(wǎng)絡(luò)。

DOK6 屬于 DOK 家族成員，目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)DOK1、DOK2、DOK3、DOK4、DOK5、DOK6 和DOK7 共7 個(gè)成員，它們均有N 端PH 結(jié)構(gòu)域、中間PTB 結(jié)構(gòu)域和一個(gè)多元化的C 端結(jié)構(gòu)域。目前對(duì)DOK6 的研究很少，已知DOK6 能夠參與RET 通路促進(jìn)早期胚胎神經(jīng)細(xì)胞的發(fā)育[8]，還有學(xué)者證明了DOK6 蛋白能夠與TrK 受體成員中TrkC 發(fā)生相互作用，相互作用區(qū)域?yàn)镈OK6 蛋白的PTB 結(jié)構(gòu)域，該相互作用依賴?yán)野彼崃姿峄痆9]。最近有研究表明DOK6 的下調(diào)會(huì)導(dǎo)致多種信號(hào)因子(包括多種MAPK通路的分子)的表達(dá)量減少[10]。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)免疫共沉淀、激光共聚焦、BiFC，發(fā)現(xiàn)了NS1 與DOK6 分子的PTB 結(jié)構(gòu)域存在明顯的互作，結(jié)果還顯示DOK6蛋白的PH 結(jié)構(gòu)域?qū)OK6 蛋白與NS1 的相互作用具有削弱作用，可能原因是DOK6 蛋白在未激活狀態(tài)下，其PH 結(jié)構(gòu)域?qū)TB 結(jié)構(gòu)域有遮掩作用，需要其它因子的激活使PH 結(jié)構(gòu)域發(fā)生構(gòu)象變化，PTB 結(jié)構(gòu)域才能得以暴露并與NS1 發(fā)生相互作用。DOK6 作為一個(gè)接頭蛋白，其PTB 結(jié)構(gòu)域發(fā)生酪氨酸磷酸化后能夠結(jié)合一些信號(hào)分子，研究表明PTB結(jié)構(gòu)域的酪氨酸磷酸化對(duì)信號(hào)的轉(zhuǎn)導(dǎo)非常關(guān)鍵[9]，那么NS1 結(jié)合在該部位是否會(huì)阻礙這些下游信號(hào)的傳遞，還有待探究。雖然報(bào)道表明DOK6 可能參與MAPK 通路的激活[10]，但這個(gè)過(guò)程是否與PTB 結(jié)構(gòu)域有關(guān)，目前尚無(wú)相關(guān)報(bào)道。有關(guān)DOK6 與NS1 相互作用的分子作用機(jī)制有待深入的研究。