孫屹屹 楊麗華 李瑞儉 王景濤

1)鶴壁市人民醫(yī)院ICU，河南 鶴壁 458030 2)鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，河南 鄭州 450000

星形膠質(zhì)細(xì)胞是中樞神經(jīng)系統(tǒng)中體積最大的膠質(zhì)細(xì)胞，在哺乳動(dòng)物體內(nèi)的分布極為廣泛，傳統(tǒng)的觀點(diǎn)認(rèn)為其具有支持神經(jīng)元、形成血腦屏障、物質(zhì)運(yùn)輸?shù)茸饔?，近年?lái)的研究顯示，星形膠質(zhì)細(xì)胞還具有維持內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定、參與突觸形成、神經(jīng)分化等功能[1-4]。缺氧復(fù)氧條件下，星形膠質(zhì)細(xì)胞凋亡增多，進(jìn)而引起神經(jīng)功能損傷[5-6]。第10號(hào)染色體同源缺失性磷酸酶-張力蛋白(phosphatase and tensin homolog deleted on chromosome 10，PTEN)是一個(gè)具有雙磷酸酶活性的抑癌基因，其不僅參與細(xì)胞生長(zhǎng)、周期進(jìn)展等過(guò)程，還具有誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的作用[7]。研究顯示，PTEN參與缺氧復(fù)氧神經(jīng)損傷發(fā)生，在神經(jīng)元修復(fù)、過(guò)氧化氫誘導(dǎo)的脊髓星形膠質(zhì)細(xì)胞損傷中有重要作用[8-11]。本研究探討小干擾RNA下調(diào)PTEN表達(dá)對(duì)缺氧復(fù)氧星形膠質(zhì)細(xì)胞凋亡的影響，為進(jìn)一步研究缺氧復(fù)氧神經(jīng)損傷機(jī)制提供參考。

1 材料與方法

1．1材料清潔級(jí)出生2 d以內(nèi)的SD乳鼠，由鄭州大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供；PTEN抗體購(gòu)自美國(guó)Santa Cruz Biotechnology；細(xì)胞周期依賴性蛋白激酶4(cyclin-dependent kinase 4，Cdk4)抗體、p21抗體和細(xì)胞色素C(Cytochrome C)抗體購(gòu)自美國(guó)Abgent；SYBR Green Real time PCR試劑盒購(gòu)自上海索萊寶生物科技有限公司；引物由金斯瑞生物科技有限公司合成；RNA提取試劑盒購(gòu)自北京TIANGEN；胞質(zhì)蛋白提取試劑盒購(gòu)自江蘇凱基生物技術(shù)股份有限公司；乳酸脫氫酶(lactate dehydrogenase，LDH)含量測(cè)定試劑盒購(gòu)自武漢默沙克生物科技有限公司。

1．2星形膠質(zhì)細(xì)胞分離培養(yǎng)參照文獻(xiàn)[12]，無(wú)菌將出生2d以內(nèi)的SD乳鼠處死以后，用75%的酒精消毒，將頭部的皮膚和顱骨剪開(kāi)以后，取出大腦組織，放在D-Hanks液中，在顯微鏡下把大血管、海馬、腦膜等去除以后，取大腦皮質(zhì)，將皮質(zhì)組織剪碎成1 mm3的碎塊，置于15 mL的離心管中，800 g離心2 min，取沉淀，加入等體積的0.25%的胰酶，消化5 min，加入含有血清的培養(yǎng)液，200目濾網(wǎng)過(guò)濾以后，1 200 g離心10 min，添加新鮮的含有10%胎牛血清的培養(yǎng)液。細(xì)胞接種到0.01%多聚賴氨酸包被后的細(xì)胞培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)，接種密度為5×105個(gè)/mL，培養(yǎng)2 d以后換液，細(xì)胞長(zhǎng)滿瓶底以后，以220 rpm，37 ℃振蕩培養(yǎng)18 h，將小膠質(zhì)細(xì)胞等雜細(xì)胞去除，更換細(xì)胞培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)，經(jīng)FITC標(biāo)記的GFAP、DAPI染色鑒定為星形膠質(zhì)細(xì)胞，純度超過(guò)97%。

1．3缺氧復(fù)氧模型構(gòu)建取星形膠質(zhì)細(xì)胞，進(jìn)行缺氧復(fù)氧模型構(gòu)建，參照文獻(xiàn)[13]，步驟為：星形膠質(zhì)細(xì)胞用PBS洗滌2次以后，更換成缺氧液，在94.8%N2、5% CO2、0.2% O2、37 ℃的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)6 h，再更換成10%胎牛血清的DMEM置于37 ℃，5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)12 h。缺氧液配制方法為：取6.80 g Nacl、0.36 g Na2HPO4、12H2O、0.4g Kcl、0.20g MgSO4、7H2O、0.39g CaCl2、6H2O、5.69g HEPES、2.20 g NaHCO3溶解至800 mL去離子水中，pH為7.4，定容1 000 mL，用0.22 μm微孔過(guò)濾，保存在4 ℃。

1．4PTENsiRNA慢病毒感染及細(xì)胞分組取星形膠質(zhì)細(xì)胞接種到12孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，細(xì)胞密度為40%左右時(shí)，進(jìn)行慢病毒感染，在細(xì)胞中添加適量的慢病毒顆粒，調(diào)整慢病毒感染復(fù)數(shù)為20，同時(shí)在細(xì)胞中加入10 mg/L的Polybrene繼續(xù)孵育24 h后，更換新鮮的細(xì)胞培養(yǎng)液，72 h后觀察GFP表達(dá)情況，感染效率高于85%。將感染攜帶PTEN siRNA的慢病毒載體的細(xì)胞經(jīng)缺氧復(fù)氧處理后記為si-PTEN+H/R，將感染陰性對(duì)照慢病毒載體的細(xì)胞經(jīng)缺氧復(fù)氧處理后記為si-NC+H/R。把沒(méi)有感染慢病毒的細(xì)胞經(jīng)缺氧復(fù)氧處理后記為H/R，把正常培養(yǎng)的細(xì)胞記為Control。用Real time PCR和Western blot檢測(cè)H/R、si-PTEN+H/R、si-NC+H/R細(xì)胞中PTEN的表達(dá)水平，確定PTEN siRNA 沉默效果。

1．5RealtimePCR測(cè)定PTENmRNA表達(dá)H/R、si-PTEN+H/R、si-NC+H/R細(xì)胞依照RNA提取試劑盒提取RNA，RNA溶解在適量的DEPC水中，保存至-80℃。逆轉(zhuǎn)錄體系為：總RNA 2 μg、 dNTP 1 μL、隨機(jī)引物2 μL加水共12 μL，置于65 ℃反應(yīng)5 min，在冰上冷卻，繼續(xù)添加Reaction Buffer 4 μL、1 μL DTT，放在37 ℃反應(yīng)2 min后，添加1 μL的M-MLV逆轉(zhuǎn)錄酶，混合均勻以后，25℃反應(yīng)10min，37℃反應(yīng) 50min，70℃反應(yīng) 15min，合成的cDNA保存在-20℃。Real time PCR步驟同Real time PCR試劑盒，每個(gè)反應(yīng)設(shè)置3個(gè)復(fù)孔，共40次循環(huán)，內(nèi)參為β-actin，檢測(cè)反應(yīng)的CT值，按照2-△△Ct方法計(jì)算待測(cè)PTEN水平。引物序列如下：PTEN F-5’-CATTATGACACCGCCAAA-3’，R-5’-AACCGGGCTACATTATTT-3’。β-actin F-5’-GTGGGGCGCCCCAGGCACCA-3’，R-5’-CTCCTTAATGTCAGCACGATTTC-3’。

1．6Westernblot測(cè)定PTEN蛋白表達(dá)H/R、si-PTEN+H/R、si-NC+H/R細(xì)胞中加入細(xì)胞裂解液(約106個(gè)細(xì)胞中加入100 μL)，超聲儀破碎細(xì)胞后，4℃高速離心，用BCA法對(duì)蛋白上清定量以后，進(jìn)行SDS-PAGE蛋白電泳。常規(guī)方法配制5%的濃縮膠和10%的分離膠，每孔上樣30μg，濃縮膠中90V電壓電泳，分離膠中120V電壓電泳，電泳時(shí)間為3h。用半干法將凝膠上的蛋白在4℃轉(zhuǎn)移到PVDF膜上，轉(zhuǎn)膜持續(xù)50min，電流用80mA。取出PVDF膜，進(jìn)行免疫熒光染色，PTEN抗體稀釋倍數(shù)為1：100，β-actin內(nèi)參抗體稀釋倍數(shù)為1：600，二抗稀釋倍數(shù)為1：3000。最后用Odyssy掃描圖像，用Image J軟件定量，結(jié)果按照PTEN和內(nèi)參光密度值比值表示。

1．7MTT測(cè)定細(xì)胞增殖活力無(wú)菌取星形膠質(zhì)細(xì)胞，種植到96孔板，細(xì)胞接種密度為3×105個(gè)/mL，每孔100 μL。按照Control、H/R、si-PTEN+H/R、si-NC+H/R處理后，在每孔中添加MTT染液，孵育4h后，每個(gè)孔中加入150 μL的DMSO，低速振蕩10min后，結(jié)晶物完全溶解，測(cè)定570nm的OD值，用空白調(diào)零孔調(diào)零以后，計(jì)算細(xì)胞存活率。存活率=(H/R或si-PTEN+H/R或si-NC+H/R細(xì)胞OD÷Control細(xì)胞OD)×100%

1．8二硝基苯肼比色法檢測(cè)LDH漏出率Control、H/R、si-PTEN+H/R、si-NC+H/R按照上述方法處理以后，用PBS將細(xì)胞洗滌3次，添加1%的Triton X-100在室溫中將細(xì)胞裂解后，用LDH檢測(cè)試劑盒檢測(cè)裂解液和培養(yǎng)液中LDH含量(二硝基苯肼比色法)。LDH漏出率=100%×培養(yǎng)液中LDH水平÷(培養(yǎng)液中LDH水平+細(xì)胞裂解液中LDH水平)

1．9流式細(xì)胞術(shù)測(cè)定周期H/R、si-PTEN+H/R、si-NC+H/R細(xì)胞用0.25%的胰酶消化以后，加入冰預(yù)冷的70%的乙醇溶液，在-20℃過(guò)夜。1 000 g離心10 min后，把乙醇吸除，添加PI染液，終濃度為50 μg/mL，4℃避光反應(yīng)30 min，流式細(xì)胞儀檢測(cè)周期分布水平。

1．10流式細(xì)胞術(shù)測(cè)定凋亡Control、H/R、si-PTEN+H/R、si-NC+H/R按照上述方法處理以后，用0.25%的胰酶消化，用PBS將細(xì)胞懸浮，細(xì)胞濃度調(diào)整到106個(gè)/mL，1 000 g離心5 min以后，加入冰預(yù)冷的PBS將細(xì)胞懸浮3次，用200 μL的結(jié)合緩沖液重懸細(xì)胞，添加10 μL的Annexin V-FITC孵育15min后，加入5 μL的PI和300 μL的Binding Buffer，200目篩網(wǎng)過(guò)濾以后，用流式細(xì)胞儀檢測(cè)凋亡。

1．11Westernblot測(cè)定細(xì)胞中Cdk4、p21和CytochromeC蛋白水平收集H/R、si-PTEN+H/R、si-NC+H/R細(xì)胞，用Western blot方法測(cè)定細(xì)胞中周期蛋白Cdk4、p21表達(dá)水平和細(xì)胞胞質(zhì)中Cytochrome C蛋白水平，步驟同1.6，胞質(zhì)蛋白提取同胞質(zhì)蛋白提取試劑盒。

1．12JC-1法測(cè)定線粒體膜電位收集H/R、si-PTEN+H/R、si-NC+H/R細(xì)胞，把上清液吸除以后，在細(xì)胞中分別加入0.5 mL的JC-1工作液，放在培養(yǎng)箱中反應(yīng)20min。將上清液吸除以后，再加入JC-1染液緩沖液，混合后，激光共聚焦顯微鏡下觀察熒光強(qiáng)度。用紅色熒光/綠色熒光的比值表示線粒體膜電位。

2 結(jié)果

2．1攜帶PTENsiRNA的慢病毒載體感染后缺氧復(fù)氧星形膠質(zhì)細(xì)胞PTEN沉默效果si-PTEN+H/R細(xì)胞中的PTEN mRNA和蛋白水平均顯著低于H/R和si-NC+H/R(P<0.05)。攜帶PTEN siRNA的慢病毒載體能夠成功下調(diào)缺氧復(fù)氧星形膠質(zhì)細(xì)胞中PTEN的表達(dá)。見(jiàn)圖1、表1。

2．2敲低PTEN表達(dá)對(duì)缺氧復(fù)氧星形膠質(zhì)細(xì)胞存活率和LDH漏出率影響與Control比較，H/R細(xì)胞存活率降低，LDH漏出率升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。si-PTEN+H/R細(xì)胞存活率升高，LDH漏出率降低，與H/R和si-NC+H/R比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。敲低PTEN能夠提高缺氧復(fù)氧星形膠質(zhì)細(xì)胞活力，減少細(xì)胞損傷。見(jiàn)表2。

2．3敲低PTEN表達(dá)對(duì)缺氧復(fù)氧星形膠質(zhì)細(xì)胞周期分布及Cdk4、p21蛋白水平影響與Control比較，H/R細(xì)胞G1期比例升高，p21蛋白水平升高，Cdk4蛋白水平降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。si-PTEN+H/R細(xì)胞G1期比例降低，p21蛋白水平降低，Cdk4蛋白水平升高，與H/R和si-NC+H/R比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。敲低PTEN能夠減弱缺氧復(fù)氧星對(duì)形膠質(zhì)細(xì)胞周期阻滯作用。見(jiàn)圖2、表3。

2．4敲低PTEN表達(dá)對(duì)缺氧復(fù)氧星形膠質(zhì)細(xì)胞凋亡影響與Control比較，H/R細(xì)胞凋亡率升高(P<0.05)。si-PTEN+H/R細(xì)胞凋亡率低于H/R和si-NC+H/R(P<0.05)。敲低PTEN能夠減少缺氧復(fù)氧星形膠質(zhì)細(xì)胞凋亡。見(jiàn)圖3、表4。

2．5敲低PTEN表達(dá)對(duì)缺氧復(fù)氧星形膠質(zhì)細(xì)胞線粒體膜電位和胞質(zhì)中CytochromeC水平影響與Control比較，H/R細(xì)胞線粒體膜電位降低，胞質(zhì)中Cytochrome C蛋白水平升高(P<0.05)。與H/R和si-NC+H/R比較，si-PTEN+H/R細(xì)胞線粒體膜電位升高，胞質(zhì)中Cytochrome C蛋白水平降低(P<0.05)。敲低PTEN能夠減少缺氧復(fù)氧星對(duì)形膠質(zhì)細(xì)胞線粒體膜電位及胞質(zhì)中Cytochrome C蛋白水平影響。見(jiàn)圖4、表5。

圖1 Western blot檢測(cè)攜帶PTEN siRNA的慢病毒載體對(duì)缺氧復(fù)氧條件下星形膠質(zhì)細(xì)胞中PTEN蛋白水平影響Figure 1 Western blot analysis the effect of lentiviral vector carrying PTEN siRNA on PTEN protein levels in astrocytes under hypoxia-reoxygenation conditions

表1 攜帶PTEN siRNA的慢病毒載體感染對(duì)缺氧復(fù)氧條件下星形膠質(zhì)細(xì)胞中PTEN表達(dá)水平比較

注：與si-NC+H/R和H/R比較，*P<0.05

注：與Control比較，&P<0.05；與si-NC+H/R和H/R比較，*P<0.05

圖2 Western blot檢測(cè)敲低PTEN對(duì)缺氧復(fù)氧條件下星形膠質(zhì)細(xì)胞中周期相關(guān)蛋白Cdk4、p21表達(dá)影響Figure 2 Western blot analysis the effect of knockdown of PTEN on the expression of Cdk4 and p21 in astrocytes under hypoxia-reoxygenation

圖3 流式細(xì)胞術(shù)測(cè)定敲低PTEN對(duì)缺氧復(fù)氧條件下星形膠質(zhì)細(xì)胞凋亡影響Figure 3 Flow cytometry analysis the effect of knockdown of PTEN on astrocyte apoptosis under hypoxia-reoxygenation

表3 敲低PTEN對(duì)缺氧復(fù)氧條件下星形膠質(zhì)細(xì)胞周期分布及Cdk4、p21蛋白水平影響

組別G1(%)S(%)G2/M(%)p21Cdk4Control60.14±5.1727.45±2.2412.41±1.050.26±0.020.68±0.06H/R78.26±4.23&14.85±1.18&6.89±0.78&0.85±0.09&0.41±0.03&siNC+H/R79.14±5.3215.69±1.545.17±1.110.87±0.070.40±0.05siPTEN+H/R68.76±2.56*22.86±2.64*8.39±1.47*0.36±0.05*0.51±0.02*F值12.10927.57922.45877.40927.351P值0.0020.0000.0000.0000.000

注：與Control比較，&P<0.05；與si-NC+H/R和H/R比較，*P<0.05

表4 敲低PTEN對(duì)缺氧復(fù)氧條件下星形膠質(zhì)細(xì)胞凋亡率影響

注：與Control比較，&P<0.05；與si-NC+H/R和H/R比較，*P<0.05

表5 敲低PTEN對(duì)缺氧復(fù)氧條件下星形膠質(zhì)細(xì)胞線粒體膜電位及線粒體中Cytochrome C蛋白水平影響

注：與Control比較，&P<0.05；與si-NC+H/R和H/R比較，*P<0.05

圖4 Western blot檢測(cè)敲低PTEN對(duì)缺氧復(fù)氧條件下星形膠質(zhì)細(xì)胞胞質(zhì)中Cytochrome C蛋白水平影響Figure 4 Western blot analysis the effect of knockdown of PTEN on the cytoplasmic Cytochrome C protein in astrocytes under hypoxia-reoxygenation

3 討論

腦卒中的發(fā)病機(jī)制與興奮性氨基酸毒性、炎癥損傷、酸中毒、細(xì)胞凋亡等有關(guān)，卒中發(fā)生以后，缺血半暗帶神經(jīng)細(xì)胞凋亡是細(xì)胞急劇減少的主要原因，減少細(xì)胞凋亡可以減輕腦組織損傷[14-18]。星形膠質(zhì)細(xì)胞是一種中樞神經(jīng)系統(tǒng)細(xì)胞，在腦缺血發(fā)生后會(huì)過(guò)度凋亡，導(dǎo)致組織神經(jīng)功能受損[19-21]。本實(shí)驗(yàn)的結(jié)果表明，缺氧復(fù)氧處理后的星形膠質(zhì)細(xì)胞活力降低，細(xì)胞中LDH漏出率升高，細(xì)胞凋亡率升高，細(xì)胞G1期比例增多，說(shuō)明成功構(gòu)建了缺氧復(fù)氧星形膠質(zhì)細(xì)胞損傷模型。

PTEN的蛋白質(zhì)晶體分析結(jié)果顯示，其氨基端含有一個(gè)磷酸酶區(qū)域，其與蛋白質(zhì)絲氨酸/蘇氨酸磷酸酶及酪氨酸磷酸酶催化中心同源性極高，具有雙特異性磷酸酶活性，在PTEN的N端含有一個(gè)175個(gè)氨基酸組成的序列，該序列同輔助蛋白及張力蛋白具有較高的同源性，PTEN蛋白還含有一個(gè)C2結(jié)構(gòu)域，能夠與磷脂膜結(jié)合，參與細(xì)胞運(yùn)動(dòng)、調(diào)控蛋白質(zhì)磷酸化等過(guò)程[22-25]。PTEN具有調(diào)控細(xì)胞生長(zhǎng)、周期及凋亡等作用，在心肌組織、腦組織、腎組織等各種組織中均有表達(dá)[26-29]。最近的研究表明，PTEN具有調(diào)控神經(jīng)系統(tǒng)細(xì)胞生長(zhǎng)作用，參與神經(jīng)元損傷修復(fù)，對(duì)于星形膠質(zhì)細(xì)胞損傷也具有重要作用[30]。有研究顯示，PTEN表達(dá)下調(diào)可以減輕過(guò)氧化氫誘導(dǎo)的星形膠質(zhì)細(xì)胞損傷，PTEN表達(dá)下調(diào)可以減輕神經(jīng)損傷[31]。本實(shí)驗(yàn)的結(jié)果顯示，下調(diào)PTEN表達(dá)可以提高缺氧復(fù)氧星形膠質(zhì)細(xì)胞活力，減少細(xì)胞LDH漏出率，降低細(xì)胞凋亡率，減少細(xì)胞G1期比例，下調(diào)PTEN具有減輕缺氧復(fù)氧星形膠質(zhì)細(xì)胞損傷的作用。

細(xì)胞周期、細(xì)胞凋亡與細(xì)胞生長(zhǎng)密切相關(guān)，其受到細(xì)胞內(nèi)多種基因的嚴(yán)格調(diào)控，是一個(gè)十分復(fù)雜的過(guò)程。細(xì)胞周期進(jìn)展中G1期向S期轉(zhuǎn)變是細(xì)胞周期的檢查點(diǎn)，受到Cdk4、p21等的調(diào)控作用，Cdk4具有促進(jìn)細(xì)胞從G1期向S期進(jìn)展的作用，p21具有抑制細(xì)胞從G1期向S期進(jìn)展作用[32-36]。線粒體凋亡途徑是細(xì)胞凋亡發(fā)生的經(jīng)典途徑，其中線粒體中的Cytochrome C釋放至胞質(zhì)中是關(guān)鍵，當(dāng)細(xì)胞受到凋亡等信號(hào)刺激以后，細(xì)胞線粒體膜電位下降，導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)的Cytochrome C進(jìn)入胞質(zhì)中與細(xì)胞凋亡相關(guān)因子結(jié)合，促進(jìn)細(xì)胞凋亡發(fā)生。PTEN參與調(diào)控細(xì)胞周期和細(xì)胞凋亡發(fā)生[37-40]。本實(shí)驗(yàn)的結(jié)果顯示，敲低PTEN后的星形膠質(zhì)細(xì)胞中Cdk4蛋白水平升高，p21蛋白水平降低，胞質(zhì)中Cytochrome C蛋白水平降低，線粒體膜電位升高，提示敲低PTEN可能通過(guò)調(diào)控周期蛋白及線粒體途徑降低缺氧復(fù)氧對(duì)星形膠質(zhì)細(xì)胞周期阻滯和凋亡誘導(dǎo)作用。

PTEN參與缺氧復(fù)氧星形膠質(zhì)細(xì)胞凋亡發(fā)生，敲低其表達(dá)可以減少缺氧復(fù)氧星形膠質(zhì)細(xì)胞凋亡，減少缺氧復(fù)氧誘導(dǎo)的星形膠質(zhì)細(xì)胞周期阻滯，敲低PTEN表達(dá)具有保護(hù)缺氧復(fù)氧星形膠質(zhì)細(xì)胞作用，這對(duì)于以后研究缺氧復(fù)氧神經(jīng)損傷具有重要意義。