楊博帆，史婧卓，李晶，潘玉蓬，肖寧，余彥耿，張付，王慧君，李冬日

（1.南方醫(yī)科大學法醫(yī)學院，廣東 廣州 510515；2.廣東省公安廳 公安部法醫(yī)病理學重點實驗室，廣東廣州 510050）

據(jù)2006年6月22日《環(huán)球時報》報道，中國每年有60萬人死于過勞，居世界首位，過勞死已經(jīng)成為我國重大社會問題[1]。但目前國內(nèi)對于過勞死的研究大多局限在社會學及法學領(lǐng)域，在病理學及病理生理學機制方面的研究較少，在法醫(yī)病理學診斷方面的研究更為欠缺[2]。根據(jù)傳統(tǒng)的過勞死概念，過勞可使?jié)撛诘募膊〖毙詯夯蝗凰劳觯舅酪蜻€是潛在的自身疾病，屬于猝死范疇[3-4]。然而，本課題組在法醫(yī)病理學鑒定實踐中遇到多例無明顯自身疾病且與長時間超負荷勞動密切相關(guān)的急死案例，符合日本《關(guān)于腦血管疾病與虛血性心臟疾病（負傷引起的除外）的認定標準》的評判標準[5-6]，考慮過勞本身可能對心血管系統(tǒng)產(chǎn)生不良影響。

心臟的縫隙連接通道是心肌細胞間一種特殊的連接通道，縫隙連接通道的基本結(jié)構(gòu)單位是連接子，相鄰細胞通過各自的連接子對接形成一個完整的連接通道，每個連接子由6個跨膜蛋白分子即縫隙連接蛋白環(huán)形排列圍成[7]。縫隙連接通道的重要作用是介導(dǎo)細胞間通訊，主要表現(xiàn)為代謝偶聯(lián)和電偶聯(lián)，完成心肌細胞間的化學遞質(zhì)或電信號傳遞，是維持心肌細胞電生理的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)，因此縫隙連接蛋白在維持心臟節(jié)律方面發(fā)揮著重要作用[8-9]。心臟內(nèi)的縫隙連接蛋白主要有連接蛋白（connexin，Cx）40、Cx43和Cx45等。Cx40主要分布于心房和近端傳導(dǎo)系統(tǒng)；Cx43主要存在于工作的心肌細胞內(nèi)；Cx45分布于整個傳導(dǎo)系統(tǒng)，是竇房結(jié)和房室結(jié)縫隙連接通道的主要蛋白[7]。近年來許多研究結(jié)果[10-19]均表明，Cx43和Cx45的含量與心臟功能相關(guān)，Cx43和Cx45的異常表達可能引起心臟功能的改變。

為探究過勞應(yīng)激是否對心臟功能產(chǎn)生直接影響，本研究建立大鼠過勞應(yīng)激模型，通過檢測左心室心肌細胞中Cx43和Cx45的表達情況，研究過勞應(yīng)激對心臟功能的影響。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

健康SD大鼠9只，初始體質(zhì)量300～400g，雌雄不限，由南方醫(yī)科大學實驗動物中心提供。飼料由該實驗動物中心提供，每只大鼠分籠飼養(yǎng)，每天投放足量鼠糧和純凈飲用水，大鼠自由飲食。飼養(yǎng)環(huán)境為室溫25℃、濕度50%，通風流暢，無噪音。光照/黑暗周期為16h/8h，06：00開燈，22：00關(guān)燈。本研究經(jīng)南方醫(yī)科大學實驗動物福利和倫理管理委員會批準。

1.2 方法

1.2.1 動物分組

將9只大鼠隨機分為對照組、過勞1月組和過勞2月組，每組3只。

1.2.2 大鼠過勞模型的建立

過勞組進行強制游泳實驗[20]。將過勞組所有大鼠每天同一時間放入水桶中游泳1h（16：00～17：00），水溫20～25℃，水深60cm，水桶直徑40cm。過勞1月組每只大鼠強制游泳實驗持續(xù)1個月（30d），過勞2月組每只大鼠強制游泳實驗持續(xù)2個月（60d）。每只實驗大鼠游泳所用的水桶均相互獨立。判斷勞累的標準是在游泳過程中觀察到大鼠的鼻尖被水淹沒超過10s且連續(xù)發(fā)生3次及以上[20]。游泳結(jié)束后將大鼠放回籠中，自由活動及飲食。對照組正常飼養(yǎng)，不予強制游泳。

1.2.3 取材

建模結(jié)束后，每只大鼠進行稱重。采用2%戊巴比妥鈉溶液按30 mg/kg劑量腹腔注射麻醉大鼠。麻醉成功后打開胸腔，暴露心臟，剪開右心耳，從心尖處刺入針頭用生理鹽水進行灌注。采用輸液滴注方式進行，灌注至大鼠體內(nèi)血液基本排出，血液排空的判定標準為大鼠肺部呈白色或眼球透明[21-22]。灌注完成后取下大鼠的心臟并稱重。計算心臟質(zhì)量與體質(zhì)量的比值，即心體比（‰）。切取心臟左心室心尖部，置于-80℃保存?zhèn)溆?，其余部分置于多聚甲醛溶液中固定?/p>

1.2.4 心肌細胞Cx43和Cx45的提取和檢測

將-80℃保存的左心室心尖部組織取出，液氮冷凍后轉(zhuǎn)移到研磨器中。按1 mL裂解液原液加20 μL蛋白酶抑制劑配制裂解液。按1 mg組織加10 μL裂解液的比例在研磨器中加入裂解液，研磨。研磨后將混合液置入微量離心管中，4℃下以14000×g離心10min。取上清液，按上清液與上樣緩沖液以4∶1的比例加入上樣緩沖液。振蕩，以2 200×g離心15 s，100℃水浴10min，取上清液于-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

采用Western印跡法對Cx43和Cx45的表達情況進行觀察。上膠（濃縮膠）濃度為5%，下膠（分離膠）濃度為10%。上膠100 V固定電壓電泳0.5 h，下膠120 V固定電壓電泳2 h。200 mA固定電流2.5 h轉(zhuǎn)膜。采用含有聚山梨酯的三羥甲基氨基甲烷緩沖鹽-吐溫20（tris buffered saline with tween-20，TBST）配置1∶20脫脂奶粉溶液，用于封閉聚偏二氟乙烯（polyvinylidene difluoride，PVDF）膜。一抗（Cx43抗體、Cx45抗體和GAPDH抗體，1∶1 000，美國ABclonal公司）4℃孵育12 h。TBST洗滌條帶3次，每次5 min。二抗（山羊抗兔IgG抗體，1∶10 000，美國ABclonal公司）室溫孵育1 h。TBST洗滌條帶3次，每次5 min。曝光。用ImageJ軟件（美國National Institute of Mental Health公司）對曝光條帶結(jié)果進行灰度值分析。

1.2.5 組織病理學染色方法

取出多聚甲醛溶液固定的心臟，切取左心室壁，沖洗多聚甲醛固定液，乙醇脫水，石蠟包埋。將石蠟組織塊以2 μm厚度連續(xù)切片并置于載玻片上，37℃培養(yǎng)箱過夜，然后65℃保持2h，石蠟切片用水脫蠟。

蘇木精-伊紅（hematoxylin-eosin，HE）染色：將切片置于蘇木精溶液中數(shù)分鐘，酸水及氨水分色各數(shù)秒，流水沖洗1 h后入蒸餾水數(shù)秒，70%～90%乙醇溶液由低到高濃度依次脫水各10 min，再入乙醇伊紅染色液染色2～3min，無水乙醇脫水，經(jīng)二甲苯使切片透明。

Masson染色：Masson染色是用來顯示組織中纖維的一種染色方法，在鏡下觀察心肌纖維呈紅色，間質(zhì)纖維呈藍色。將切片放入Regaud氏蘇木精染液中5～10 min，流水充分沖洗后蒸餾水沖洗，Masson麗春紅酸性復(fù)紅液復(fù)染5～10 min，2%冰醋酸水溶液浸洗片刻，1%磷鉬酸水溶液分化3～5 min，再直接苯胺藍液染5min，0.2%冰醋酸水溶液浸洗片刻，無水乙醇脫水，經(jīng)二甲苯使切片透明。最后，切片用中性橡膠包裹覆蓋。

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析

運用SPSS 20.0軟件（美國IBM公司），采用t檢驗分別將各過勞組與對照組大鼠的心體比（‰）進行統(tǒng)計學分析。同時，根據(jù)灰度值分析結(jié)果，將同一樣本Cx43和Cx45的灰度值分別與其內(nèi)參蛋白甘油醛-3-磷酸脫氫酶（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH）的灰度值相比，根據(jù)該比值同樣采用t檢驗對Cx43和Cx45的表達情況進行統(tǒng)計學分析。對兩個過勞組大鼠間按相同分析方法對以上數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計學分析。檢驗水準α=0.05。

2 結(jié) 果

2.1 心體比結(jié)果

3組大鼠的心體比結(jié)果（表1）表明，與對照組相比，2個過勞組大鼠心體比增加，差異具有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。過勞1月組大鼠的心體比與過勞2月組大鼠的心體比之間差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。

表1 3組大鼠的心體比結(jié)果 （n=3，±s，‰）

表1 3組大鼠的心體比結(jié)果 （n=3，±s，‰）

注：1）與對照組比較，P＜0.05。

組別對照過勞1月過勞2月大鼠心體比3.16±0.15 3.67±0.141）3.73±0.101）

2.2 Cx43和Cx45的表達

用Western印跡法對各組大鼠左心室心尖心肌細胞Cx43和Cx45的表達情況進行分析，結(jié)果見圖1和表2。結(jié)果表明：與對照組相比，過勞組Cx43表達減少、Cx45表達增加，差異均具有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；過勞2月組的Cx43表達減少與Cx45表達增加，與過勞1月組相比，差異均具有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。

圖1 3組大鼠心肌細胞內(nèi)Cx43和Cx45的表達情況

表2 3組大鼠心肌細胞內(nèi)Cx43和Cx45的表達情況（n=3，±s）

表2 3組大鼠心肌細胞內(nèi)Cx43和Cx45的表達情況（n=3，±s）

注：1）與對照組比較，P＜0.05；2）與相鄰上組比較，P＜0.05。

組別對照過勞1月過勞2月Cx43 0.62±0.11 0.40±0.041）0.31±0.061）2）Cx45 0.45±0.14 0.74±0.121）0.92±0.081）2）

2.3 組織病理學染色結(jié)果

2.3.1 HE染色結(jié)果

對照組與過勞組大鼠左心室壁組織的HE染色結(jié)果見圖2。對照組心肌細胞排列整齊，部分小血管周圍檢見少量纖維組織。與對照組相比，過勞組的心肌細胞排列較紊亂，心肌肥大，嗜酸性增強，部分心肌纖維斷裂，提示可能出現(xiàn)心肌細胞受損和間質(zhì)纖維增生。

2.3.2 Masson染色結(jié)果

對照組與過勞組大鼠左心室壁組織的Masson染色結(jié)果見圖3。對照組部分小血管周圍檢見少量纖維組織。與對照組相比，過勞組心肌間質(zhì)纖維明顯增生（圖3）。

圖2 對照組與過勞組大鼠左心室壁組織的HE染色結(jié)果（×100）

圖3 對照組與過勞組大鼠左心室壁組織的Masson染色結(jié)果（×100）

3 討 論

“過勞死”（Karoshi，death from overwork）一詞起源于日本，最早出現(xiàn)于二十世紀六七十年代日本經(jīng)濟繁榮時期[23]。日本圣德大學教授上畑鐵之丞首先提出過勞死的概念，他在《過勞死》一書中提出，過勞死不完全是醫(yī)學或統(tǒng)計學上的概念，而是工作積累所致，是以過重勞累為誘因，使高血壓和動脈硬化等疾病惡化，引起心腦血管疾病急性發(fā)作，最后造成永久不能工作甚至死亡的狀態(tài)，屬于社會醫(yī)學范疇[24]。目前，日本厚生勞動省對過勞死的定義為：由于超負荷勞動，原有的高血壓、動脈硬化等自身疾病進一步惡化，誘發(fā)心腦血管疾病發(fā)作而導(dǎo)致死亡的狀態(tài)[25]。根據(jù)上述概念，患有高血壓、冠心病等自身疾病是先決條件，而過度勞累只是誘發(fā)因素。日本厚生勞動省在《勞動法》的基礎(chǔ)上，于2001年頒布了《關(guān)于腦血管疾病與虛血性心臟疾?。ㄘ搨鸬某猓┑恼J定標準》，并于2015年進一步對其進行了補充和修改。該項規(guī)定也體現(xiàn)了過勞對心腦血管疾病的誘發(fā)或加重作用。然而越來越多的研究結(jié)果[26-30]顯示，過勞本身可能就是引起人體各種疾病的直接原因，如高血壓、冠心病、糖尿病、高脂血癥、抑郁癥等，過勞死的年輕化趨勢也是一個佐證[2]，而我們在法醫(yī)病理學實踐中也遇到了一些沒有明顯基礎(chǔ)疾病但與過勞密切相關(guān)的急死案例[5-6]，其共同特點是心臟肥大和心肌間質(zhì)纖維化。

根據(jù)本研究結(jié)果，過勞大鼠的心體比明顯大于對照組，提示過勞應(yīng)激可能會使心臟質(zhì)量增加。而心臟質(zhì)量的增加可能與心肌肥大或纖維結(jié)締組織增生有關(guān)[31]，根據(jù)HE染色和Masson染色結(jié)果，與對照組相比，過勞組大鼠心肌肥大、心肌細胞嗜酸性增強，心肌間質(zhì)纖維明顯增生，提示過勞應(yīng)激使心肌損傷、心肌間質(zhì)纖維化，如果過勞應(yīng)激進一步蓄積，不排除最終導(dǎo)致心力衰竭或心律失常而死亡的可能[32]。過勞大鼠與對照組大鼠左心室壁心肌細胞Cx43和Cx45的Western印跡法結(jié)果顯示，過勞可使大鼠左心室心尖部心肌細胞內(nèi)Cx43表達降低、Cx45表達升高，且過勞時間越長，Cx43表達降低或Cx45表達升高越明顯。近年來許多研究均證實，縫隙連接通道數(shù)目的減少或分布紊亂，將導(dǎo)致心臟的傳導(dǎo)異常，從而導(dǎo)致心律失常。Cx43的缺乏會更容易發(fā)生室性心律失常[10]，Cx43表達的降低與梗死后室性心律失常和心力衰竭的發(fā)病機制有關(guān)[11-12]，在持續(xù)性心房顫動的心肌細胞中Cx43的表達水平顯著下降[13]。與Cx43不同的是，Cx45在工作心肌細胞中表達相對較低的水平[14]，但有研究結(jié)果[16-17]表明，Cx45在心力衰竭時表達會增加，并且Cx45表達的增加會提高患心律失常的可能性。因為Cx45可以和Cx43形成異源通道，Cx45與Cx43比值的增加可能減小縫隙連接的大小，也可能誘導(dǎo)病理狀態(tài)下的心律失常[15，18-19]，即當心肌細胞內(nèi)Cx43表達降低和Cx45表達升高時，將可能出現(xiàn)心律失常。本研究中Western印跡法結(jié)果提示，隨著過勞應(yīng)激時間的延長，發(fā)生心律失常的風險也將升高，可能也是心肌受損、心肌間質(zhì)發(fā)生纖維化及心臟質(zhì)量增加的原因。

本研究初步證實了過勞應(yīng)激可對心臟功能產(chǎn)生直接的影響，長期過勞應(yīng)激的蓄積可能是導(dǎo)致死亡的根本原因。