劉思陽，馬巧麗

糖尿病周圍神經(jīng)病變(DPN)是絕大多數(shù)糖尿病患者最常出現(xiàn)的慢性并發(fā)癥[1]，其發(fā)病機制非常復雜，且尚未完全闡明，目前缺乏有效的治療方法[2]。枸杞多糖(LBP)是從我國傳統(tǒng)中藥枸杞子中提取的最重要的有效成分。研究證實，LBP可通過抗氧化應激、清除病變小鼠體內(nèi)過量自由基保護DPN[3- 4]。雪旺細胞是周圍神經(jīng)系統(tǒng)主要的神經(jīng)膠質(zhì)細胞，在周圍神經(jīng)的增殖、功能及再生中起重要作用[5]。但LBP對體外培養(yǎng)的高糖誘導下的雪旺細胞的保護作用報道較少，其最佳劑量未見深入研究。本實驗對LBP的有效劑量進行了相關分析，為今后的研究提供數(shù)據(jù)支持。

1 資料與方法

1.1 一般資料：LBP(寧夏回族自治區(qū)農(nóng)林科學研究院，批號：018006，批間差異為3%)；杜氏改良Eagle低糖培養(yǎng)基(DMEM)(美國HyClone 公司，批號：M3024-10X1L，批間差異為3%)；胎牛血清(FBS)(美國Gibico 公司，批號：VS500T，批間差異為5%)；甘露醇(美國Siama公司，批號：B20422，批間差異為1.5%)；葡萄糖粉末(上海廣銳生物科技有限公司，批號：016047，批間差異為3%)；四甲基偶氮唑鹽(MTT)檢測試劑盒(南京凱基生物技術有限公司，批號：A0389，批間差異為1.5%)；RSC96細胞(大鼠永生化雪旺細胞株，上海中喬新舟生物科技有限公司，批號：A1044，批間差異為5%)；ST-360酶標儀(美國Bio-tek公司)。

1.2 細胞培養(yǎng)與分組

1.2.1 RSC96細胞復蘇及培養(yǎng)：將RSC96 細胞從液氮罐中取出，快速放入37 ℃水浴鍋解凍約1 min，將細胞懸浮液(1 mL)吸入15 mL離心管內(nèi)并加入 1 mL DMEM 完全培養(yǎng)基；混勻后1 000 r/min 離心5 min，棄上清液，加入 5 mL含10%FBS、1%雙抗、5.5 mmol/L葡萄糖的完全DMEM培養(yǎng)基；置于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。顯微鏡下觀察復蘇的 RSC96細胞生長狀態(tài)，當細胞生長狀態(tài)良好且鋪滿100 mm細胞培養(yǎng)皿的90%時進行細胞傳代。1～2 d換液1次，2～3 d傳代。取對數(shù)生長期RSC96細胞進行后續(xù)實驗。

1.2.2 實驗分組：高糖誘導細胞凋亡實驗，根據(jù)培養(yǎng)基中葡萄糖濃度分為以下4組：12.5 mmol/L組(含葡萄糖 12.5 mmol/L、10% FBS、1%雙抗的DMEM培養(yǎng)基)，25、50、100 mmol/L共3組(含葡萄糖100 mmol/L、10% FBS、1%雙抗的DMEM培養(yǎng)基)。將RSC96細胞以2 000個/孔的密度接種于96孔板，每組設6個復孔，培養(yǎng)48 h后檢測細胞活力。LBP干預實驗：根據(jù)上述實驗的結果及LBP的干預劑量分為以下7組：正常對照組(含葡萄糖25 mmol/L)、高糖組(含葡萄糖100 mmol/L)、LBP不同劑量組(含糖100 mmol/L+LBP 100、200、400、800 μg/mL)、甘露醇高滲對照組(甘露醇75 mmol/L +葡萄糖25 mmol/L)。將RSC96 細胞以2000個/孔的密度接種于96孔板，每組設6個復孔，培養(yǎng)48 h后檢測細胞增殖。

1.2.3 四唑鹽比色法(MTT)檢測細胞增殖：細胞在96孔板中培養(yǎng)48 h后統(tǒng)一吸出培養(yǎng)液，用PBS 100 μl清洗后，所有孔統(tǒng)一加入25 mmol/L葡萄糖的完全培養(yǎng)基100 μl；然后每孔加入50 μl MTT，放入37 ℃溫箱孵育4 h后吸出上清液；每孔加入150 μl二甲基亞砜(DMSO)，室溫下放在搖床上震蕩混勻10 min，放置于ST-360酶標儀上，在570 nm波長處測定各孔的吸光度值(Optical Density，OD)。具體操作參照試劑盒說明書進行。

2 結果

2.1 不同濃度葡萄糖對RSC96細胞活力的影響：與12.5 mmol/L組比較，25 mmol/L組RSC96細胞活力顯著升高(P<0.05)，之后隨著培養(yǎng)基葡萄糖濃度的升高，RSC96細胞活力逐漸下降。與25 mmol/L組比較，50 mmol/L組RSC96細胞活力顯著下降(P<0.05)，100 mmol/L組RSC96細胞活力顯著下降(P<0.05)。與50 mmol/L組比較，100 mmol/L組RSC96細胞活力顯著下降(P<0.05)，見圖1(目錄后)。

2.2 不同劑量LBP對高糖誘導的RSC96細胞增殖的影響：上述實驗證實培養(yǎng)基葡萄糖濃度為25 mmol/L時RSC96細胞活力最強，故把葡萄糖濃度25 mmol/L設為正常對照組。培養(yǎng)基葡萄糖濃度為100 mmol/L時RSC96細胞顯著下降，故把葡萄糖濃度100 mmol/L設為高糖組。與正常對照組比較，高糖組RSC96細胞增殖能力顯著下降(P<0.05)，甘露醇組差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。與高糖組比較，予LBP處理后，細胞增殖能力逐漸增強，高糖+LBP 200 μg/mL組明顯增強(P<0.05)，高糖+LBP 400 μg/mL組顯著增強(P<0.05)，高糖+LBP 800 μg/mL組明顯增強(P<0.05)。高糖+LBP 400 μg/mL組RSC96細胞增殖能力最強，與高糖+LBP 400 μg/mL組比較，高糖+LBP 200 μg/mL組、高糖+LBP 800 μg/mL組比較差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，見圖2(目錄后)。

3 討論

雪旺細胞是周圍神經(jīng)系統(tǒng)的髓鞘形成細胞，對周圍神經(jīng)的功能維護和神經(jīng)再生至關重要。研究LBP對高糖誘導雪旺細胞增殖的影響，對防治DPN也具有重要意義。本實驗結果顯示，25 mmol/L組RSC96細胞活力最強，100 mmol/L組RSC96細胞活力下降最為顯著，這提示了葡萄糖濃度為25 mmol/L時可能使RSC96細胞增殖效果最佳，而后隨著葡萄糖濃度的增加，增殖能力逐漸下降。分析原因，考慮可能是因為一定濃度的葡萄糖濃度可為雪旺細胞的增殖及生長提供必需的營養(yǎng)物質(zhì)，而當葡萄糖濃度過高時，由于細胞內(nèi)外的滲透壓平衡被打破，細胞外的濃度過高，致使部分RSC96細胞存在脫水現(xiàn)象，不利于其增殖生長，過高的濃度甚至會導致細胞凋亡。事實上，Mahmoudzadeh等人也報道證實，雪旺細胞極易受到高血糖的損害[6]，高血糖誘導雪旺細胞損傷可能導致局部神經(jīng)傳導減少，軸突萎縮，影響受損軸突再生[7]。雪旺細胞的損傷是引起糖尿病周圍神經(jīng)病變(DPN)的機制之一，之前的研究報道DPN患者的雪旺細胞出現(xiàn)了凋亡[8]。高血糖產(chǎn)生的一些化合物，如甲基乙二醛和晚期糖基化終末產(chǎn)物造成雪旺細胞凋亡，導致了DPN的發(fā)生[9]。同時高血糖又加重神經(jīng)纖維組織的氧化應激反應，使成熟的雪旺細胞發(fā)生脫髓鞘病變，在導致DPN的過程中起關鍵作用。研究證實，雪旺細胞能夠為軸突遷移提供生物活性物質(zhì)，釋放調(diào)節(jié)軸突生長的因子[10]。此外，雪旺細胞激活損傷部位的巨噬細胞，釋放細胞因子，分泌神經(jīng)營養(yǎng)因子，指導合成再生，完成髓磷脂吞噬[11]。特別是在神經(jīng)受損后，雪旺細胞通過幾種生長因子和激素的表達對軸突提供營養(yǎng)支持[12]，包括神經(jīng)生長因子(NGF)，腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子(BDNF)和神經(jīng)膠質(zhì)細胞源性神經(jīng)營養(yǎng)因子(GDNF)。這些神經(jīng)營養(yǎng)因子的分泌對促進軸突生長和防止神經(jīng)元啟動程序性細胞死亡非常重要[13]。除了生長因子，雪旺細胞可促進軸突表面細胞黏附分子生長和基板組裝，這是一個髓鞘形成的先決條件，雪旺細胞形成髓鞘保證了神經(jīng)元動作電位跳躍式的快速傳導。

本文在后續(xù)實驗中為了探索不同劑量的LBP促進高糖誘導RSC96細胞增殖的最佳劑量，結果發(fā)現(xiàn)，400 μg/mL LBP促進高糖誘導的RSC96細胞增殖效果最佳。這一結果也為今后進行體內(nèi)實驗及在 DPN 動物模型上進行藥物劑量篩選提供了數(shù)據(jù)支持。提示了應用濃度為400 μg/mL LBP能夠有效地促進高糖誘導的RSC96細胞發(fā)生增殖，幫助DPN模型大鼠控制有關癥狀，同時也說明應用一定濃度水平的LBP可能有助于改善DPN模型的血糖水平。分析原因，主要可能與LBP的降糖作用及可保護神經(jīng)軸突及髓鞘的有關超微結構有關。LBP作為我國重要中藥材枸杞中的主要有效成分，其活性較高，能夠較好地降低血糖和血脂，并能改善機體內(nèi)的胰島素抵抗狀態(tài)。有報道指出，LBP能夠強化機體中抗氧化劑的有關活性，減少氧化物形成，提升機體的抗氧化功能，同時還能減少自由基針對胰島細胞產(chǎn)生的損害，促進胰島功能逐漸恢復，明顯地促使胰島素不斷分泌，最終逐步降低機體的血糖水平[14]。DPN的主要病理改變包括神經(jīng)軸突的損壞，以及神經(jīng)纖維產(chǎn)生的間斷型髓鞘脫失等。LBP能夠有效上調(diào)髓鞘有關蛋白如P0的表達，降低了病變神經(jīng)的軸突及SCs細胞損傷，最終對髓鞘的主要形態(tài)結構產(chǎn)生了較好的保護效果[15]。

綜上所述，LBP4 00 μg/mL對高糖誘導的RSC96細胞增殖作用最佳，能夠較好地促進雪旺細胞增殖，對DPN的防治具有重要的意義。