閆珊珊，劉光芒，王建萍，林 燕，白世平，張克英，吳彩梅

（四川農業(yè)大學動物營養(yǎng)研究所/四川省、農業(yè)農村部動物抗病營養(yǎng)與飼料重點實驗室，成都 611130）

玉米蛋白粉是玉米的副產物，作為家禽蛋白飼料，2014 年以來，每年消費量維持在220 萬t。玉米在生長、加工、儲運過程中，品質易受霉菌毒素影響，其中嘔吐毒素（Deoxynivalenol，DON）污染嚴重。DON 是禾谷鐮刀菌（Fusarium graminearum）的次生代謝產物，DON 及其衍生物15 乙酰基脫氧雪腐鐮孢菌烯醇（15-acetyldeoxynivaleno，15AC-DON）、3乙酰基脫氧雪腐鐮孢菌烯醇（3-acetyldeoxynivaleno，3AC-DON）、脫氧雪腐鐮孢菌烯醇-3-葡萄糖苷（Deoxynivalenol-3-glucoside，DON-3-G）可致動物嘔吐、腹瀉、生產性能降低[1-2]。禾谷鐮刀菌生長過程中會消耗玉米蛋白粉營養(yǎng)素，降低其品質，因霉變和霉菌毒素污染導致每年約有25%的玉米及其副產物不能用于畜禽養(yǎng)殖，因此，在飼料資源短缺的前提下，開展本研究為防控玉米蛋白粉在缺氧存儲條件下DON 污染及霉變玉米蛋白粉的利用提供理論依據。DON 產生菌主要為禾谷鐮刀菌，研究發(fā)現(xiàn)菌株的來源、培養(yǎng)基種類、水分、溫度、培養(yǎng)時間以及通氧量是影響禾谷鐮刀菌產DON 的主要因素。武愛波[3]從小麥中分離出4 株中國代表性和7 株歐洲代表性產DON 的禾谷鐮刀菌株，通過HPLC 定量分析表明歐洲菌株DON 產量高于中國菌株。陸鳴等[4]研究發(fā)現(xiàn)，禾谷鐮刀菌接種至小麥培養(yǎng)基，溫度25 ℃，培養(yǎng)時間30 d 時DON 產生量最大，最大值為536 μg/g；B.Birzel 等[5]研究發(fā)現(xiàn)，禾谷鐮刀菌接種至小麥培養(yǎng)基，水分20%，溫度20 ℃，培養(yǎng)時間12 w時DON 產生量最大，最大值為810 μg/kg；姜云晶等[6]研究發(fā)現(xiàn)，禾谷鐮刀菌接種至玉米培養(yǎng)基，水分30%，溫度25 ℃，培養(yǎng)時間25 d 時DON 產生量最大，最大值為 56.65 mk/kg；M.L.Ramirez 等[7]研究發(fā)現(xiàn)，禾谷鐮刀菌接種至小麥培養(yǎng)基，水分活度0.98 aw，溫度25 ℃，培養(yǎng)時間42 d 時DON 產生量最大，最大值為135 462 ng/g。有學者研究豆粕霉變對其品質的影響，發(fā)現(xiàn)隨著霉變程度加深，粗脂肪、粗纖維和淀粉含量有所下降，粗蛋白質含量無顯著變化[8-10]。玉米蛋白粉受霉菌污染后的品質變化規(guī)律、DON 的毒素積累規(guī)律尚不明確，玉米蛋白粉品質變化的關鍵影響因素初始水分和霉菌的量對其品質變化和毒素積累規(guī)律的影響尚不清楚。玉米蛋白粉存儲過程中缺氧條件為主要存儲條件，因此，本研究主要考察缺氧存儲條件下，初始水分和禾谷鐮刀菌接種量對玉米蛋白粉品質和DON、15AC-DOC 變化的影響，明確玉米蛋白粉品質變化規(guī)律和DON、15AC-DOC的積累規(guī)律。

1 材料和方法

1.1 試驗材料

1.1.1 材料

DON 產毒菌株：禾谷鐮刀菌（Fusarium graminearum）14-62-1，由四川農業(yè)大學植物病理學教研室提供；玉米蛋白粉：購自漯河天嘉生化有限公司。

1.1.2 試劑

DON 標準對照品、15AC-DON 標準對照品（上海源葉公司），甲醇、乙腈（色譜純，美國Sigma 公司），試驗用水為純水系統(tǒng)（美國Milipore 公司）制備的18.2 MΩ·cm 超純水。濃硫酸、硫酸銅、無水硫酸鈉、硼酸、乙醚、氫氧化鈉、高氯酸、氫氧化鉀、鹽酸和無水乙醇等均為分析純（成都科龍公司）。

1.1.3 儀器

液相色譜-串聯(lián)質譜儀（Agilent 1200-6430 Triple Quad，美國 Agilent 公司），高效液相色譜儀（HPLC-e2695，美國Waters 公司），超高效液相色譜儀（UPLC H-Class，美國 Waters 公司），恒溫恒濕培養(yǎng)箱（3913，美國Thermo 公司），氨基酸自動分析儀（日立L8900型，日本日立公司），半自動凱氏定氮儀（K-360 型，瑞士BUCHI 公司），全自動纖維測定儀（A2000220，美國Ankom 公司），紫外分光光度計（UV-300 型，美國Thermo 公司）。

1.2 試驗方法

1.2.1 試驗設計

采用二因子3×4 水平設計，GB 13078-2017[11]規(guī)定飼料中霉菌總數(shù)限量標準為4×104個/g，因此接種量設計水平圍繞霉菌限量標準分別設置為1×103、1×104和 1×105個/g，NY/T 685-2003[12]規(guī)定玉米蛋白粉儲藏期間水分含量為≤12%，因有報道[13-14]玉米蛋白粉在儲存期間水分含量可達到12%、15%、18%、20%和30%，因此本試驗水分設計水平分別為13%、16%、20%和22%，由此研究玉米蛋白粉在存儲期間相對低水分含量（13%、16%）和高水分含量（20%、22%）時，接種不同量的禾谷鐮刀菌后，玉米蛋白粉的品質變化和DON 的積累規(guī)律。具體方案見表1。

1.2.2 樣品處理

將確定為產毒菌的禾谷鐮刀菌14-62-1 接種于PDA 平板復壯培養(yǎng)5～7 d，將菌絲接種于綠豆湯液體培養(yǎng)基（綠豆20 g，蒸餾水中煮沸10 min，紗布過濾，加蒸餾水定容至1 L）中，產生分生孢子后，將分生孢子的濃度調制成1×106個/mL 的孢子懸液，并逐級稀釋成濃度為 1×105、1×104個/mL 的孢子懸液，待用。將原始水分為5.97%的玉米蛋白粉采用強度10 kGy 的60Co-γ 射線輻照滅菌，加水制成水分含量分別為13%、16%、20%、22%的樣品，加水方法參照蔡靜平等[15]研究，根據已測定的玉米蛋白粉樣品原始水分含量，計算所需加水量。理論加水量=M（C1-C0）/（100-C1）。其中，M：樣品的重量（g），C0：樣品的原始水分（%），C1：樣品所需要的水分（%）。通過無菌自封袋分裝模擬玉米蛋白粉的缺氧存儲條件，每袋40 g，密封，混勻。

各樣品分別接種 1×104、1×105和 1×106個/mL濃度懸液各4 mL（此體積已納入水分含量計算），使樣品的霉菌數(shù)分別為 1×103～1×105個/g，每個處理組設置樣品20 袋。

1.2.3 指標測定方法

將不同處理組樣品放置于溫度為（25±2）℃，濕度為75%±5%的恒溫恒濕培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，培養(yǎng)期間每天定時混勻樣品，分別在培養(yǎng)的第 0、5、10、15、20、30 和60 天的每天上午9:00 采樣，采樣在厭氧培養(yǎng)箱中進行，從20 袋樣品中各取5 g 混勻，立即進行霉菌總數(shù)測定，其余樣品放置于-80 ℃保存，用于營養(yǎng)素、品質評價指標及DON 含量測定，其中DON和15AC-DON 采用HPLC-MS/MS 確證，確證方法采用液質聯(lián)用法[16]，指標測定方法見表2。

表1 試驗設計表Table 1 Experiment design table

表2 指標及測定方法Table 2 Indexes and determination methods

1.3 統(tǒng)計分析

采用SAS 9.4 軟件中PROC MIXED 程序進行數(shù)據分析，模型為：Yijkl=μ+αi+βj+γk+(αβγ)ijk+tl+εijkl。式中：Yijkl為因變量，μ 為變量的總體平均值，αi為接種量水平（i=1×103，1×104，1×105個/g），βj為水分水平（j=13%，16%，20%，22%），γk為培養(yǎng)時間（k=0，5，10，15，20，30，60 d），(αβγ)ijk為影響因素之間的交互作用，tl為玉米蛋白粉中各樣品指標的重復測量，εijkl為隨機誤差。方差分析顯著者，用Turkey 法進行多重比較，P＜0.05 作為顯著性水平檢驗標準，結果用平均值表示。

2 結果與分析

2.1 接種禾谷鐮刀菌后玉米蛋白粉品質變化規(guī)律

2.1.1 粗蛋白質含量的變化規(guī)律

玉米蛋白粉各處理組培養(yǎng)期間粗蛋白質、氨基酸含量變化見表3～表5。培養(yǎng)期間禾谷鐮刀菌接種量、初始水分是粗蛋白質含量變化的主要影響因素，對氨基酸含量變化無影響，二者對粗蛋白質含量變化互作效應顯著（P＜0.05），對氨基酸含量變化互作效應不顯著（P＞0.05）。13%和16%水分含量組粗蛋白質無顯著變化（P＞0.05），20%和22%水分含量組粗蛋白質隨著培養(yǎng)時間的延長呈線性增加（P＜0.01）。必需氨基酸中Leu、Ile 和Trp 含量分別平均為10.71%、2.21%和 0.30%。Phe、Lys、Met、Arg、His、Val 和 Thr含量隨著培養(yǎng)時間的延長均呈二次曲線變化（P＜0.01）。非必需氨基酸中Cys、Pro 和Asp 含量分別平均為0.70%、5.62%和 3.86%。Ala、Gly、Glu、Ser 和 Tyr 含量隨著培養(yǎng)時間的延長均呈二次曲線變化（P＜0.01）。

2.1.2 粗脂肪、淀粉、粗纖維含量的變化規(guī)律

玉米蛋白粉各處理組培養(yǎng)期間粗脂肪、淀粉、粗纖維含量變化見表6。培養(yǎng)期間初始水分是粗脂肪、淀粉、粗纖維含量變化的主要影響因素，禾谷鐮刀菌接種量對其無顯著影響（P＞0.05），二者互作效應不顯著（P＞0.05）。不同水分含量組粗脂肪、淀粉、粗纖維含量隨著培養(yǎng)時間的延長呈線性降低（P＜0.01）。

2.1.3 其他品質評價指標變化規(guī)律

玉米蛋白粉各處理組培養(yǎng)期間蛋白質溶解度、酸價、能量和霉菌總數(shù)變化見表7 和表8。培養(yǎng)期間初始水分和禾谷鐮刀菌接種量是霉菌總數(shù)變化的主要影響因素，但禾谷鐮刀菌接種量對蛋白質溶解度、酸價、能量變化無顯著影響（P＞0.05），二者對霉菌總數(shù)變化存在互作效應，對蛋白質溶解度、酸價、能量變化互作效應不顯著（P＞0.05）。不同水分含量組酸價隨著培養(yǎng)時間的延長呈線性上升（P＜0.01），蛋白質溶解度、能量隨著培養(yǎng)時間的延長呈線性降低（P＜0.01）。禾谷鐮刀菌接種量 1×103～1×105個/g 的 13%和16%水分含量組霉菌總數(shù)無顯著變化（P＞0.05），20%和22%水分含量組霉菌總數(shù)隨著培養(yǎng)時間的延長呈二次曲線變化（P＜0.01）。

表3 禾谷鐮刀菌接種量和水分對玉米蛋白粉中粗蛋白質變化的影響Table 3 Effect of inoculation and moisture of Fusarium graminearum on CP in CGM（% DM）

表4 禾谷鐮刀菌接種量和水分對玉米蛋白粉中必需氨基酸變化的影響Table 4 Effect of inoculation and moisture of Fusarium graminearum on essential amino acid in CGM (DM)

表5 禾谷鐮刀菌接種量和水分對玉米蛋白粉中非必需氨基酸變化的影響Table 5 Effect of inoculation and moisture of Fusarium graminearum on non-essential amino acid in CGM (DM)

表6 禾谷鐮刀菌接種量和水分對玉米蛋白粉中粗脂肪、淀粉、粗纖維變化的影響Table 6 Effect of inoculation and moisture of Fusarium graminearum on EE、Starch、CF in CGM (DM)

表7 禾谷鐮刀菌接種量和水分對玉米蛋白粉中品質評價指標變化的影響Table 7 Effect of inoculation and moisture of Fusarium graminearum on quality evaluation index in CGM (DM)

表8 禾谷鐮刀菌接種量和水分對玉米蛋白粉中霉菌總數(shù)變化的影響Table 8 Effect of inoculation and moisture of Fusarium graminearum on total mold in CGM(cfu·g-1 FM)

2.2 DON和15AC-DON積累規(guī)律

缺氧存儲條件下，玉米蛋白粉隨著培養(yǎng)時間的延長 DON 和15AC-DON 有檢出，UPLC 測定圖譜如圖1a，DON 標準品保留時間為4.685 min，樣品保留時間為4.694 min，樣品保留時間與標準對照品相比，誤差為0.02%，在允許偏差±2.5%范圍內。HPLC測定圖譜如圖1b，15AC-DON 標準品保留時間為8.048 min，樣品保留時間為8.007 min。樣品保留時間與標準對照品相比，誤差為0.5%，在允許偏差±2.5%范圍內。HPLC-MS/MS 確證圖譜如圖2 所示，DON 和15AC-DON 標準品保留時間分別為2.345 和2.335 min，樣品保留時間分別為2.456 和2.456 min，樣品保留時間與標準對照品相比，誤差均為0.5%，在允許偏差±0.5%范圍內。測定結果如表9 所示。結果表明，玉米蛋白粉中 DON 在試驗第 5、15、30、60 d 有檢出，15AC-DON 在試驗第 5、30、60 d 有檢出。隨著培養(yǎng)時間的延長，玉米蛋白粉接種禾谷鐮刀菌后未見紅色分泌物并且DON 和15AC-DON 未出現(xiàn)積累規(guī)律。

2.3 玉米蛋白粉霉變程度與品質變化之間的關系

圖1 玉米蛋白粉中DON 和15AC-DON 的色譜圖Figure 1 Chromatogram of deoxynivalenol in CGM cultivate

霉變程度與玉米蛋白粉品質變化之間有何聯(lián)系？是否為霉變程度越嚴重，其品質越差？為了證實該問題，將玉米蛋白粉霉變前期（0～20 d），霉變中期（20～30 d），霉變后期（30～60 d）3 個時期的霉菌總數(shù)與品質評價指標進行相關性分析，結果表明，霉變前期玉米蛋白粉中霉菌總數(shù)與粗蛋白質（r=0.674，P＜0.001），酸價（r=0.834，P＜0.001）呈正相關，與氨基酸（r=-0.820，P＜0.001），粗脂肪（r=-0.520，P＜0.001），淀粉（r=-515，P＜0.001），粗纖維（r=-0.511，P＜0.001），蛋白質溶解度（r=-525，P＜0.001）呈負相關；霉變中期玉米蛋白粉中霉菌總數(shù)與粗蛋白質（r=0.911，P＜0.001），酸價（r=0.867，P＜0.001）呈正相關，與氨基酸（r=-0.820，P＜0.001），粗脂肪（r=-0.611，P＜0.001），淀粉（r=-621，P＜0.001），粗纖維（r=-0.634，P＜0.001），蛋白質溶解度（r=-949，P＜0.001）呈負相關；霉變后期玉米蛋白粉中霉菌總數(shù)與粗蛋白質（r=0.945，P＜0.001），酸價（r=0.969，P＜0.001）呈正相關，與氨基酸（r=-0.911，P＜0.001），粗脂肪（r=-0.522，P＜0.001），淀粉（r=-535，P＜0.001），粗纖維（r=-0.517，P＜0.001），蛋白質溶解度（r=-916，P＜0.001）呈負相關。因此，玉米蛋白粉接種禾谷鐮刀菌后，霉變程度與品質變化呈負相關。

圖2 玉米蛋白粉中DON 和15AC-DON 的質譜圖Figure 2 MRM chromatogram of deoxynivalenol in CGM cultivate

表9 玉米蛋白粉中DON 和15AC-DON 測定結果Table 9 Determination results of DON and 15AC-DON in CGM (mg·kg-1 DM)

3 討論

3.1 初始水分和禾谷鐮刀菌接種量對玉米蛋白粉品質變化規(guī)律的影響

禾谷鐮刀菌在生長過程中需要C 源（碳水化合物）和N 源等營養(yǎng)物質的供給為自身生長提供能量[27]。玉米蛋白粉營養(yǎng)素中淀粉（15%）、粗脂肪（7%）和粗纖維（2%）可為禾谷鐮刀菌提供C 源，粗蛋白（65%）、氨基酸（65%）可為禾谷鐮刀菌提供N 源。本研究發(fā)現(xiàn)，缺氧存儲條件下，13%、16%、20%和22%初始水分含量組為禾谷鐮刀菌提供N 源的粗蛋白質、氨基酸和非蛋白氮絕對消耗率分別為2%、1.4%和0.6%，24%、19%和5%；而為禾谷鐮刀菌提供C 源的淀粉、粗纖維和粗脂肪絕對消耗率分別為16%、8%和18%，85%、52%和41%；說明玉米蛋白粉中粗蛋白質、氨基酸和非蛋白氮為禾谷鐮刀菌生長提供N 源，淀粉、粗纖維和粗脂肪為其提供C 源。禾谷鐮刀菌在13%～22%的初始水分下，對C、N 源的利用規(guī)律一致，蛋白氮為其提供主要N 源，其次為非蛋白氮，淀粉為其提供主要C 源，其次為粗纖維、最后為粗脂肪，有所不同的是，禾谷鐮刀菌在20%和22%的初始水分條件下，對C、N 源的絕對消耗率比在13%和16%的初始水分條件下高。C.Reed 等[28]將玉米分別放置于溫度25 ℃，水分15%、16.5%和18%的缺氧條件下儲藏，并接種典型霉菌以模擬玉米在培養(yǎng)箱中存放6～8 個月后可能出現(xiàn)的霉菌接種量，研究發(fā)現(xiàn)，玉米中初始水分含量越高，霉變越易發(fā)生，玉米中脂肪、淀粉含量降低越快，與本研究結果一致。陳喜斌等[9]研究了豆粕自然霉變對其營養(yǎng)價值的影響，王之盛等[10]研究了儲藏對配合飼料蛋白質營養(yǎng)價值的影響，結果表明，高水分含量組，粗蛋白質含量無顯著變化與本研究結果不一致，原因可能是試驗所用霉菌種類不同，本試驗所用霉菌為禾谷鐮刀菌，其為需氧菌，在有氧條件下更易生長，禾谷鐮刀菌生長代謝時，可將玉米蛋白粉中的蛋白質、碳水化合物等主要營養(yǎng)物質分解成小分子物質供其生長繁殖，同時又可不斷地分泌出代謝產物，并也可能利用無機氮源合成微生物菌體蛋白從而使粗蛋白含量升高[29]。本試驗發(fā)現(xiàn)蛋白氮即氨基酸的絕對消化率，13%和16%的初始水分組為1.4%，20%和22%的初始水分組為19%，為禾谷鐮刀菌提供了N 源。而氨基酸中Phe、Met、Lys、Arg、His、Val、Ala、Gly 和 Ser 含量總體呈下降趨勢，陳喜斌等[9]和王之盛等[10]研究發(fā)現(xiàn)，必需氨基酸中Met、Lys，非必需氨基酸中Ala 含量下降程度最大，與本研究結果一致，說明以上氨基酸作為蛋白氮為禾谷鐮刀菌提供了N 源。Glu 和Tyr 含量總體呈上升趨勢，說明禾谷鐮刀菌生長時不消耗以上兩種氨基酸，同時產生的微生物菌體蛋白中可能包含此兩種氨基酸。而 Leu、Ile、Thr、Cys、Trp 和 Pro 的含量，在整個培養(yǎng)過程中無變化，說明禾谷鐮刀菌生長時未利用以上氨基酸，也未產生相應代謝物。

3.2 缺氧條件下DON和15AC-DON的積累規(guī)律

本試驗在接種產DON 毒素的禾谷鐮刀菌后，未發(fā)現(xiàn)明顯的毒素積累規(guī)律，僅部分試驗組檢出DON和15AC-DON。有文獻[30]報道，禾谷鐮刀菌在產DON時會伴隨紅色分泌物的產生，而缺氧存儲條件下，玉米蛋白粉培養(yǎng)60 d 期間未見紅色分泌物。分析原因可能有3 種，第一個可能原因為禾谷鐮刀菌是需氧菌，而本試驗是模擬玉米蛋白粉缺氧存儲條件，初始氧氣很快耗盡導致菌種無法在適宜條件下生長或生長速度減慢，60 d 的培養(yǎng)期還沒有達到分泌紅色分泌物的期限，從而影響禾谷鐮刀菌的產毒。E.Alvarez等[31]將濕態(tài)玉米酒精糟分別放置于溫度16 ℃的缺氧條件下存儲60 d 和有氧條件下存儲20 d，發(fā)現(xiàn)，在缺氧條件下，玉米酒精糟儲存10 d 后表面變質但并未檢測出霉菌毒素，但在有氧存儲過程中檢測出了DON，說明禾谷鐮刀菌在有氧條件下易產毒。第二個可能原因為本試驗為了排除干擾因素在試驗前進行了物理滅菌，沒有霉菌與禾谷鐮刀菌競爭性生長，有文獻[32]報道，霉菌間的競爭性生長促進毒素的產生，A.Velluti 等[33]研究，在溫度為 15、25 ℃，水分活度為0.98、0.95 和0.93 aw 條件下，接種產伏馬毒素的擬輪生鐮孢菌，層出鐮孢菌和產DON 的禾谷鐮刀菌，研究菌株之間相互作用對真菌毒素形成的影響，結果發(fā)現(xiàn)，三者之間相互作用對禾谷鐮刀菌產玉米赤霉烯酮毒素沒有顯著影響，但在水分活度為0.98 aw 時，擬輪生鐮孢菌，層出鐮孢菌可顯著促進禾谷鐮刀菌產DON。而玉米蛋白粉實際存儲時是多菌共同存在的，其他霉菌如黃色鐮刀菌、串珠鐮刀菌、雪腐鐮刀菌也可產生DON 或者15AC-DON。第三個原因可能為禾谷鐮刀菌在極端變化的條件下如溫度驟降或驟增或者其他外部條件刺激，會增加產毒量。R.R.M.Paterson 等[34]研究發(fā)現(xiàn)，氣溫突然下降時，DON 的含量會顯著升高。A.K.Audenaert 等[35]研究發(fā)現(xiàn)，低濃度的H2O2能夠刺激禾谷鐮刀菌中DON 的生物合成。而本試驗培養(yǎng)條件恒定，沒有溫度或者其他外部條件刺激，從而造成DON 和15ACDON 積累未出現(xiàn)預期。玉米及其副產物實際存儲條件存在缺氧和有氧條件，因此，為探明玉米蛋白粉中毒素與品質變化的關系，應進一步開展有氧、多菌共生和動態(tài)培養(yǎng)的試驗。

4 結論

缺氧存儲條件下，初始水分是玉米蛋白粉品質變化的主要影響因素，禾谷鐮刀菌接種量不是主要影響因素，玉米蛋白粉品質隨水分含量增高和培養(yǎng)時間延長逐漸降低。缺氧存儲條件下，DON 和15ACDON 在培養(yǎng)的60 d 內，部分培養(yǎng)階段有檢出。