翟穎妍 ，崔傳斌，張家韜，安 航，尚學(xué)勤，安德榮*

（1.西北農(nóng)林科技大學(xué)植物保護(hù)學(xué)院旱區(qū)作物逆境生物學(xué)國家重點實驗室，陜西楊凌 712100；2.陜西省煙草公司煙草科學(xué)研究所，西安 710002）

煙草炭疽?。–olletotrichum nicotianae Averna）作為半知菌真菌，是煙草重要病害之一[1]。調(diào)查發(fā)現(xiàn)[2]煙草炭疽病發(fā)病嚴(yán)重時會毀掉整片煙田，給農(nóng)戶帶來嚴(yán)重?fù)p失，同時阻礙相關(guān)產(chǎn)業(yè)健康生產(chǎn)。煙草炭疽病在煙草全生育期均可發(fā)病，苗期發(fā)病最重，主要危害葉片、莖稈，葉部發(fā)病最重，且在多雨潮濕年份蔓延速度快。目前農(nóng)業(yè)生產(chǎn)上對煙草炭疽病的防治主要依靠化學(xué)藥劑，如多菌靈、炭疽福美等[3]。

在越來越提倡減肥減藥、綠色農(nóng)藥的今天，生物防治是植物病害防治的發(fā)展趨勢和研究熱點。芽孢桿菌作為一種根際促生細(xì)菌（PGPR）[4]，擁有適應(yīng)能力強及穩(wěn)定性強、在占領(lǐng)空間及生存競爭方面占絕對優(yōu)勢，同時具有對人畜低毒且綠色環(huán)保的優(yōu)點，受到微生物制劑研究工作者的重視。甲基營養(yǎng)型芽孢桿菌（Bacillus methylotrophicus）最早從水稻根際土壤中分離得到[5]。近來國內(nèi)外已有甲基營養(yǎng)型芽孢桿菌防治葡萄灰霉病、香蕉枯萎病、煙草赤星病、黃瓜炭疽病、玉米莖腐病和人參銹腐病等[6-11]的報道。另外，還有報道稱甲基營養(yǎng)型對番茄及草莓[12-13]具有促生作用。

高效菌株的篩選是微生物制劑的研究及應(yīng)用基礎(chǔ)，為順應(yīng)新型微生物農(nóng)藥綠色投入品的研發(fā)趨勢，本研究從秦嶺太白山森林土壤樣本中經(jīng)分離純化、定向篩選、對抑菌能力強的菌株進(jìn)行鑒定，然后進(jìn)行溫室盆栽實驗，旨在尋找具有應(yīng)用價值的菌株，并為煙草炭疽病生防提供依據(jù)，豐富有益微生物資源庫。

1 材料和方法

1.1 試驗材料

培養(yǎng)基：馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基（PDA）：去皮馬鈴薯200 g 煮沸濾液、葡萄糖20 g、瓊脂20 g，加蒸餾水定容至1000 mL，自然pH 值，121 ℃高溫高壓滅菌30 min。

LB（luria-bertani）液體培養(yǎng)基：胰蛋白胨 10 g，酵母粉 5 g，NaCl 10g，自然 pH，加蒸餾水定容至1000 mL。121 ℃高溫高壓滅菌30 min。

LB（luria-bertani）固體培養(yǎng)基：胰蛋白胨 10 g，酵母粉 5 g，NaCl 10 g，瓊脂 18 g，自然 pH，加蒸餾水定容至1000 mL。121 ℃高溫高壓滅菌30 min。

供試病原菌：棉花枯萎病菌（Fusarium oxysporium）、煙草赤星病菌（Alternaria alternata）、馬鈴薯早疫病菌（Alternaria solani.Sorauer）、玉米大斑病菌（Exserohilum turcicum）、小麥根腐病菌（Bipolaris sorokiniana）。均由西北農(nóng)林科技大學(xué)植物保護(hù)學(xué)院資源微生物實驗室保存。

供試煙草：K326 煙草，由陜西漢中市公司煙草試驗站提供。

供試藥劑：50%多菌靈可濕性粉劑，河南金光農(nóng)業(yè)科技有限公司。80%炭疽福美可濕性粉劑，石家莊市綠豐化工有限公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 拮抗菌的分離

使用土壤取樣器從秦嶺太白山森林中采集土樣，取5～10 cm 深度的土壤。稱量10 g 土壤樣品加入30 mL 無菌水，于28 ℃下振蕩培養(yǎng)30 min。混勻取1 mL 樣品溶于9 mL 無菌水中得到10-1稀釋液，依次得到 10-2、10-3、10-4、10-5稀釋液。用移液槍吸取100 L 溶液均勻涂布在LB 平板上，倒置于30 ℃下培養(yǎng)2～4 d，觀察菌落形態(tài)，選擇不同的獨立單菌落，經(jīng)過平板劃線進(jìn)行純化培養(yǎng)，將得到的純化菌落斜面培養(yǎng)，保存在4 ℃冰箱。

1.2.2 拮抗菌的篩選

拮抗菌的初篩：將4 ℃保存的煙草炭疽病病原接種于PDA 培養(yǎng)基上活化，用滅過菌的打孔器（5 mm）打菌餅，再用滅過菌的挑針接煙草炭疽病菌餅于PDA 平板正中央，采用十字交叉法接2 L 純化分離的細(xì)菌菌液于等距的四端[14]。只接煙草炭疽病菌的PDA 平板作為對照，28 ℃下培養(yǎng)，觀察并記錄菌落直徑，并計算抑制率。

拮抗菌的復(fù)篩：將拮抗表現(xiàn)較強的候選菌株，在液體LB 培養(yǎng)基內(nèi)220 r/min 振蕩培養(yǎng)48 h，然后經(jīng)12 000 r/min 離心3 min，將上清液經(jīng)0.22 m 針筒式微孔濾膜過濾器過濾得到無菌濾液，使用生長速率法[15]取 10 mL 濾液加入 90 mL 溫的 PDA 培養(yǎng)基中混勻，倒板，在中央接種靶標(biāo)菌株，10 mL 的LB液體培養(yǎng)基與90 mL 溫的PDA 處理液作為對照，觀察。記錄菌落直徑，計算抑制率，篩選得到最好的一株進(jìn)行后續(xù)試驗。

抑制率/%=（對照菌落直徑-處理菌落直徑）/對照菌落直徑×100%

拮抗菌株的廣譜活性測定：棉花枯萎病菌（Fusarium oxysporium）、煙草赤星病菌（Alternaria alternata）、馬鈴薯早疫?。ˋlternaria solani.Sorauer）、玉米大斑病菌（Exserohilum turcicum）、小麥根腐病菌（Bipolaris sorokiniana）5 株植物病原菌采用十字交叉法進(jìn)行對峙實驗，方法同上。

1.2.3 拮抗細(xì)菌ZYY-4 的鑒定

對篩選得到的斜面保存的拮抗細(xì)菌用無菌水進(jìn)行梯度稀釋，用移液槍吸取150 L 溶液接至LB平板。用滅過菌的涂布器均勻涂抹，于28 ℃下培養(yǎng)2～3 d，觀察菌落形態(tài)。使用《伯杰氏細(xì)菌手冊》[16]及《常見細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊》[17]對ZYY-4 進(jìn)行生理生化鑒定。

16S rDNA 序列分析：用SK8255 試劑盒對30 ℃下培養(yǎng)2d 的菌落提取基因組DNA，送往上海生工股份有限公司測序。細(xì)菌16S rDNA 通用引物為27F：5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3'和 1492R：5'-GGTTACCTTGTTACGACTT-3'。以提取的基因組DNA 為模板進(jìn)行PCR 擴增測序[18]。將測定的序列在GenBank 中進(jìn)行 BLAST 比對。 使用 MEGA7.0 進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育樹構(gòu)建。

1.2.4 拮抗細(xì)菌ZYY-4 的防治效果測定

將煙草炭疽病病原接種到PDA 培養(yǎng)基上培養(yǎng)5～10 d，制成 1.0×106cfu/mL 的菌懸液，備用。接ZYY-4 菌落于 LB 液體培養(yǎng)基內(nèi) 28 ℃，220 r/min 條件下培養(yǎng)48 h，配置得濃度為3×108cfu/mL 的ZYY-4發(fā)酵液。溫室盆栽試驗在西北農(nóng)林科技大學(xué)植物保護(hù)學(xué)院溫室內(nèi)進(jìn)行。將滅過菌的基質(zhì)營養(yǎng)土和滅菌的土壤等體積混合后鏟入育苗盤里。在育苗溫室內(nèi)培育煙苗至4～5 葉期時進(jìn)行防治效果實驗。將長勢一致的煙苗隨機分組，每組10 株。采用葉面噴施的方法進(jìn)行防治效果測定。

預(yù)防實驗：對盆栽煙苗噴施ZYY-4 發(fā)酵液（3×108cfu/mL），以 50%多菌靈可濕性粉劑（800 倍液）、80%炭疽福美可濕性粉劑（300 倍液）及無菌水作為對照。48 h 后再噴施煙草炭疽病孢子懸浮液，每處理重復(fù)4 組。溫室內(nèi)培養(yǎng)7 d，觀察并記錄發(fā)病情況，參照（GB/T 17980.112-2004）進(jìn)行煙草炭疽病病情調(diào)查[19]。計算病情指數(shù)及防治效果。

治療實驗：先噴施煙草炭疽病孢子懸浮液到盆栽煙苗上。6 h 后再分別接種ZYY-4 發(fā)酵液（3×108cfu/mL），以 50%多菌靈可濕性粉劑（800 倍液）、80%炭疽福美可濕性粉劑（300 倍液）及無菌水作為對照。每處理重復(fù)4 組。溫室內(nèi)培養(yǎng)7d，觀察并記錄發(fā)病情況。 計算病情指數(shù)及防治效果。

病情分級按0 級，無??；1 級，病斑面積占整片葉面積的5%以下；3 級，病斑面積占整片葉面積的6%～10%；5 級，病斑面積占整片葉面積的11%～25%；7 級，病斑面積占整片葉面積的 26%～50%；9 級，病斑面積占整片葉面積的50%以上。

病情指數(shù)/%= [Σ（各級發(fā)病病葉數(shù)×相應(yīng)級數(shù)）]/[調(diào)查總?cè)~數(shù)×9]×100%

防治效果/%=（對照病情指數(shù)-處理病情指數(shù)）/對照病情指數(shù)×100 %

1.2.5 數(shù)據(jù)分析

使用SPSS17.0 軟件對實驗數(shù)據(jù)進(jìn)行處理分析，采用Duncans 氏新復(fù)極差法進(jìn)行差異顯著性檢驗。

2 結(jié)果與分析

2.1 拮抗細(xì)菌的分離篩選

從秦嶺森林土壤中采集共得到20 份土樣，分離出143 株細(xì)菌。以煙草炭疽病為靶標(biāo)，通過平板對峙初篩和生長速率法復(fù)篩得到3 株對煙草炭疽病抑制能力較強的菌株，抑制率均大于50%，如下表1 所示。其中ZYY-4 菌株對煙草炭疽病拮抗作用最強，其抑菌率達(dá)69.93%，因此選擇ZYY-4 作為后續(xù)實驗菌株。

對ZYY-4 的廣譜抑菌活性進(jìn)行測定，使用棉花枯萎病菌（Fusarium oxysporium）、煙草赤星病菌（Al-ternaria alternata）、馬鈴薯早疫病菌（Alternaria solani.Sorauer）、玉米大斑病菌（Exserohilum turcicum）、小麥根腐病菌（Bipolaris sorokiniana）5 種病原菌作為靶標(biāo)，ZYY-4 對煙草赤星病菌、小麥根腐病菌、馬鈴薯早疫病菌、玉米大斑病菌4 種病原菌的抑制率均達(dá)到60%以上，因此ZYY-4 具有良好的廣譜抑菌活性。結(jié)果如下表2 所示。

表1 拮抗菌株對煙草炭疽病菌的抑制作用Table 1 Inhibitory effect of antagonistic strains on tabaco anthracnose

2.2 ZYY-4的生理生化特性

ZYY-4 單孢菌落在LB 平板上生長良好，革蘭氏染色呈陽性。培養(yǎng)24 h 菌落呈圓形表面有光澤略黏稠，無色透明；培養(yǎng)48 h 呈乳白色，表面干褶不光滑不透明，有褶皺，邊緣不整齊鋸齒狀。鏡檢細(xì)胞呈桿狀產(chǎn)芽孢，如圖1 所示。初步認(rèn)定ZYY-4 為芽孢桿菌屬細(xì)菌。其生理生化特性如下表3 所示。

表2 ZYY-4 的廣譜抑菌活性Table 2 Inhibition rate of ZYY-4 towards plant pathogens

圖1 單孢培養(yǎng)下ZYY-4 形態(tài)（A）、革蘭氏染色（B）、芽孢革蘭氏染色（C）Figure 1 Morphology of ZYY-4 under Monospore culture(A)、Gram's staining(B)、Gram's spore staining(C)

表3 菌株ZYY-4 的生理生化特征Table 3 Physiological and biochemical characteristics of strain ZYY-4

2.3 ZYY-4的分子生物學(xué)鑒定

以ZYY-4 基因組DNA 為模板擴增得到的DNA 片段如下圖2所示，ZYY-4 的 16S rDNA 核苷酸序列長度為1372bp。將測序得到的序列與GenBank 中的序列進(jìn)行Blast 比對，發(fā)現(xiàn)ZYY-4 與甲基營養(yǎng)型芽孢桿菌（Bacillus methylotrophicus）同源性達(dá)到99%以上。使用MEGA 7.0 軟件構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹如圖3 所示，結(jié)果表明ZYY-4 與甲基營養(yǎng)型芽孢桿菌相似性高達(dá)100%。

2.4 ZYY-4對煙草炭疽病的盆栽防效結(jié)果

ZYY-4 的溫室防效實驗結(jié)果如下圖4 及表4所示。與無菌水處理相比，其他3 種處理都有一定的防治效果，并且預(yù)防實驗防效均大于治療實驗防效。預(yù)防試驗中：施藥7 d 后ZYY-4 發(fā)酵液（3×108cfu/mL）、50%多菌靈800 倍液、80%炭疽福美可濕性粉劑300 倍液的防治效果分別為77.83%、86.6%、77.5%，ZYY-4 發(fā)酵液的效果位于第 2，高于炭疽福美。說明ZYY-4 對煙草炭疽病有較好的預(yù)防防治作用。治療實驗中：施藥7d 后ZYY-4 發(fā)酵液（3×108cfu/mL）、50%多菌靈 800 倍液、80%炭疽福美可濕性粉劑300 倍液的防治效果均在60%以上，50%多菌靈800 倍液的防治效果達(dá)到75.85%，ZYY-4 發(fā)酵液結(jié)果為62.77%，而炭疽福美的防治效果為67.23%，略高于ZYY-4。在溫室盆栽條件下50%多菌靈在預(yù)防實驗和治療實驗中均對煙草炭疽病的防治效果最好，ZYY-4 的防治效果基本和80%炭疽福美達(dá)到了同等防治水平。

圖2 ZYY-4 菌株16S rDNA 序列的PCR 擴增結(jié)果Figure 2 PCR amplification of 16S rDNA sequence of Strain ZYY-4

3 討論

本文從秦嶺太白山森林土壤中分離、篩選得到一株對煙草炭疽病有良好防效的ZYY-4 菌株。對峙實驗中ZYY-4 對煙草炭疽病的抑制率達(dá)到69.93%。經(jīng)廣譜抑菌活性測定，結(jié)果顯示ZYY-4 對煙草赤星病菌、小麥根腐病菌、馬鈴薯早疫病菌、玉米大斑病菌4 種其他植物病原菌也有較好的抗性，有較好應(yīng)用前景。經(jīng)過培養(yǎng)特性、生理生化分析及16S rDNA 鑒定確定ZYY-4 為甲基營養(yǎng)型芽孢桿菌（Bacillus methylotrophicus）。溫室盆栽實驗表明該ZYY-4 液體發(fā)酵液對煙草炭疽病的預(yù)防效果達(dá)77.83%。雖然低于化學(xué)藥劑多菌靈，但是與化學(xué)藥劑炭疽福美的防效相當(dāng)，證明其具有進(jìn)一步研究微生物菌劑的潛力。

現(xiàn)階段對煙草炭疽病的防治主要通過化學(xué)藥劑，目前針對煙草炭疽病的生防菌劑研究較少，萬秀清等[20]報道一株熒光假單孢菌株對煙草炭疽病有拮抗作用，陳越等[21]發(fā)現(xiàn)貝萊斯芽孢桿菌菌株C-4的發(fā)酵液對煙草炭疽病有生防活性，短小芽孢桿菌AR03[22]被報道對煙草炭疽病菌絲生長和孢子萌發(fā)均有抑制作用。目前雖然已發(fā)掘出了許多生防資源，但至今仍無高效防治煙草炭疽病的生防菌劑廣泛投入實際農(nóng)業(yè)應(yīng)用。ZYY-4 菌株是一株被報道的對煙草炭疽病有較強拮抗活性的甲基營養(yǎng)型芽孢桿菌，具有較大的研發(fā)潛力。但該菌的拮抗機制尚不清楚，且溫室盆栽條件與大田條件存在較大差異，要將其進(jìn)一步推廣到大田實際應(yīng)用，還需對其抗菌機制、發(fā)酵條件、劑型加工及田間應(yīng)用技術(shù)進(jìn)一步研究。

表4 ZYY-4 溫室盆栽防效實驗Table 4 Result of greenhouse pot experiment of ZYY-4