劉 欣 曹廣添 陶 菲 張素銀 楊喆曦 李永德

（中國計量大學標準化學院 杭州310018）

食物過敏被視為一種嚴重的公共營養(yǎng)衛(wèi)生問題，引起全球廣泛的關(guān)注[1-2]。大豆是人類和動物主要的蛋白質(zhì)來源之一，同時也是聯(lián)合國規(guī)定的8類主要致過敏食物之一。研究顯示，大豆中的致敏因子極大地影響幼年動物對蛋白質(zhì)的有效吸收，可以引起人和幼年動物發(fā)生過敏反應(yīng)，因而限制了大豆及其制品在食品和飼料工業(yè)中的應(yīng)用[3-4]。

近年來試驗動物模型成為評價蛋白過敏性的一個重要手段。以小鼠、大鼠和豬為過敏動物試驗?zāi)Ｐ偷难芯烤袌蟮繹5-7]。然而，至今仍存在很多因素限制了動物模型的應(yīng)用，比如動物的種類、年齡、性別和對過敏原的敏感性，關(guān)于大豆蛋白的過敏試驗動物模型也鮮有報道。課題組前期試驗結(jié)果表明：Balb/c 小鼠模型是一種有效評估大豆蛋白過敏的動物模型[8-9]。王翠燕等[10]的研究也證明了Balb/c 小鼠動物模型可用于評價大豆球蛋白的致敏性。

雖然目前對食物引發(fā)個體過敏反應(yīng)的具體機制尚不清楚，但是許多研究顯示食物過敏原的致敏途徑是通過胃腸道[11-12]。而食物過敏中黏膜免疫反應(yīng)的產(chǎn)生一般是由腸黏膜本身對食物抗原口服耐受失敗而造成的[13]。黏膜中具有調(diào)節(jié)、抑制功能的T 淋巴細胞亞群 （Th3，Tr1，CD4+CD25+T 細胞）數(shù)量及功能下調(diào)，對CD4+T 效應(yīng)細胞的主動抑制作用降低，導致黏膜中免疫介導的炎癥-抗炎平衡破壞，是細胞免疫反應(yīng)亢進造成腸道損傷的重要原因[14]。目前關(guān)于大豆蛋白過敏原誘導的腸道過敏反應(yīng)發(fā)生機理尚未清楚。

基于此背景，在現(xiàn)有研究基礎(chǔ)上，針對目前食品中常見的大豆蛋白中主要過敏成分——大豆球蛋白（glycinin）和β-伴球蛋白（β-conglycinin），用易致敏的Balb/c 小鼠作為試驗動物，通過連續(xù)5周的灌胃方式建立過敏試驗動物模型。從腸黏膜免疫的角度探討大豆球蛋白和β-伴球蛋白誘導Balb/c 小鼠黏膜過敏反應(yīng)的機制，以期為進一步研究大豆球蛋白和β-伴球蛋白的過敏機理以及預(yù)防大豆過敏的發(fā)生提供科學依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

大豆球蛋白和β-伴球蛋白提取方法參照劉欣[15]的試驗方法。T 細胞亞群免疫組化檢測試劑盒：EnVisionTM+加強試劑盒產(chǎn)品，CD3、CD4 和CD8 均為鼠來源的單克隆抗體及IgA 免疫組化染色盒，均來自丹麥DAKO 公司；α4β7 整合素為鼠來源，美國Santa Cruz；原位凋亡細胞檢測試劑盒（In Situ Cell Death Detection Kit，Code DMK500 Lot：BK1502），TaKaRa 公司。

1.2 儀器與設(shè)備

XDS-1B 型生物倒置顯微鏡，德國萊卡；DK-8D 型水浴鍋和78HW-1 型恒溫磁力攪拌器，常州金壇市水北康輝實驗廠；MH-1 型微量振蕩器，江蘇海門市麒麟醫(yī)用儀器廠；臺式高速低溫冷凍離心機5810R，德國Eppendorf；PTC-200 型熱循環(huán)儀，北京東勝創(chuàng)新生物科技有限公司；流式細胞儀（BD FACSCalibur TM），美國 Bection Dickinson 公司。

1.3 試驗動物

清潔級雌性小鼠Balb/c，體重（20±2）g，6 周齡，購自浙江省醫(yī)學科學院試驗動物中心（動物生產(chǎn)許可號22-2001001），按Kinpples 等[16]的方法連續(xù)傳兩代，以第3 代雌鼠（6 周齡）作為試驗對象。Balb/c 小鼠按組分籠飼養(yǎng)，自由飲用去離子水與進食。動物房溫度19～25 ℃，濕度55%～65%，（不含豆粕）喂養(yǎng)，光照10～12 h/d，鼠籠每周清洗消毒2 次。

1.4 試驗方法

1.4.1 動物分組及模型建立 將6 周齡雌性Balb/c 小鼠隨機分為3 組共96 只，每組32 只，每組4 個重復，每個重復8 只，分籠飼養(yǎng)。飼喂顆粒飼料，預(yù)試7d 后，進入正式期。按如下方法設(shè)計：

對照組（Saline）：每天分別灌胃1 mL/只生理鹽水；

試驗組 （Glycinin）：每天分別灌胃1 mg/mL glycinin/只；

試驗組（β-conglycinin）：每天分別灌胃1 mg/mL β-conglycinin/只。

連續(xù)灌胃35 d，每天自由采食和飲水，按試驗動物飼養(yǎng)方法飼養(yǎng)。在試驗第33 天進行大豆球蛋白腸道激發(fā)后48 h 處死小鼠，以排除速發(fā)型過敏反應(yīng)對小鼠小腸的影響。

1.4.2 腸黏膜相關(guān)淋巴組織的測定 腸黏膜Peyer's 結(jié)數(shù)量的觀察：參考周華[17]的方法。處死動物后，小心取出全小腸，肉眼計數(shù)小腸Peyper's 結(jié)的數(shù)量。

1.4.3 小鼠小腸絨毛CD3+、CD4+、CD8+T 淋巴細胞觀察及計數(shù) 采用T 細胞亞群免疫組化檢測試劑盒（EnVisionTM+加強試劑盒產(chǎn)品）。陽性結(jié)果和分布情況：在小腸黏膜層內(nèi)主要在固有層內(nèi)，定位于單個核細胞的胞膜和/或胞漿，陽性呈現(xiàn)棕黃色或黃色；量化：顯微鏡下隨機選取5～10 個高倍視野（400 倍），細胞總數(shù)大于500 個，計算各視野內(nèi)的陽性細胞百分數(shù)，再取均數(shù)。陽性細胞的百分數(shù)=視野內(nèi)陽性細胞數(shù)/視野內(nèi)總細胞數(shù)×100%，然后進行整理及統(tǒng)計分析。

1.4.4 TUNEL 法檢測小鼠小腸絨毛上皮細胞凋亡 采用原位凋亡細胞檢測試劑盒測試腸絨毛上皮細胞凋亡的情況。TUNEL 的測量：每張切片在200 倍視野下計數(shù)200 個以上細胞。每只小鼠選取3 張切片，每組均觀察8 只小鼠。細胞中陽性的凋亡細胞數(shù)，換算成凋亡指數(shù)（AI），AI=視野內(nèi)的陽性細胞數(shù)/視野內(nèi)總的細胞數(shù)×100%，然后進行整理及統(tǒng)計分析。

1.4.5 小鼠小腸固有層中IgA+漿細胞檢測 免疫組化檢測試劑盒測試。結(jié)果：IgA+的陽性表達主要為腸黏膜固有層的炎癥細胞的胞漿內(nèi)等。陽性呈棕黃色定位于細胞漿內(nèi)，陰性細胞核呈藍色。

1.5 統(tǒng)計學處理

采用SPSS 19.0 軟件中的One-way ANOVA進行方差分析，試驗結(jié)果以平均數(shù)±SD 表示。方差分析差異顯著時采用鄧肯法（Duncan test）進行多重比較；差異顯著性水平為P＜0.05。

2 試驗結(jié)果

2.1 腸黏膜Peyer’s 結(jié)數(shù)量的觀察

腸黏膜淋巴集合小結(jié)（PP 結(jié)）數(shù)量的觀察結(jié)果如圖1所示。灌胃大豆球蛋白和β-伴球蛋白組小鼠的PP 結(jié)盡管差異不顯著，但有增加的趨勢（8.13 vs11.25；8.13 vs 11.63）。

2.2 小鼠小腸絨毛T 淋巴細胞觀察及計數(shù)

圖1 大豆球蛋白和β-半球蛋白對小鼠腸黏膜淋巴集合小結(jié)（PP 結(jié)）數(shù)量的影響Fig.1 Effect of soybean glycinin and β-conglycinin on the number of peyer's patches in the intestinal mucosa of mouse

圖2表明，灌胃glycinin 組的小鼠小腸絨毛固有層中CD3+、CD4+LPL 的數(shù)量顯著高于對照組（P＜0.01），CD8+的數(shù)量與對照組相比無顯著差異。灌胃β-伴球蛋白組的小鼠小腸絨毛固有層（LPL）中CD3+LPL 和CD8+LPL 的數(shù)量 （P＜0.05）以及CD4+ LPL 的數(shù)量（P＜0.01）顯著高于對照組；兩個試驗組中整合素α4β7 的數(shù)量顯著高于對照組；各組CD4+/CD8+的比值無顯著差異。灌胃大豆球蛋白組的小鼠小腸上皮淋巴細胞（IEL）中CD3+、CD4+IEL 數(shù)量顯著高于對照組（P＜0.05），及整合素α4β7的數(shù)量也顯著高于對照組（P＜0.01）；而CD8+IEL和CD4+/CD8+IEL 的數(shù)量均無顯著差異。灌胃β-伴球蛋白組的小鼠小腸中CD3+、CD4+和CD8+IEL數(shù)量及整合素α4β7 的數(shù)量顯著高于對照組（P＜0.01），CD4+/CD8+的比值也顯著高于對照組（P＜0.05）；CD8+IEL 的數(shù)量與對照組相比無顯著差異。

圖2 各組小鼠小腸絨毛T 淋巴細胞計數(shù)Fig.2 Effect of soybean glycinin and β-conglycinin on the number of T lymphocyte in intestine

2.3 小鼠小腸絨毛上皮細胞凋亡觀察及檢測

高倍鏡下觀察顯示灌胃大豆球蛋白和β-伴球蛋白組小鼠小腸出現(xiàn)連續(xù)性陽性染色，固有層中可見大量漿細胞及淋巴細胞等炎性細胞浸潤，多見陽性染色的淋巴細胞。對照組中少見陽性染色，LP 中無明顯炎性細胞浸潤（如圖3所示）。

圖3 各組小鼠小腸絨毛上皮細胞凋亡觀察 （10×20 倍）Fig.3 Apoptotic cellular observation in murine intestinal epithelium of groups

圖4表明，與對照組相比，灌胃大豆球蛋白和β-伴球蛋白組小鼠上皮細胞凋亡率顯著增加（P＜0.01）。

2.4 小鼠小腸固有層IgA+漿細胞檢測

圖5表明灌胃大豆球蛋白和β-伴球蛋白的小鼠小腸固有層IgA+漿細胞檢測情況。由IgA 免疫組化圖片可看出，致敏組小鼠小腸固有層IgA+漿細胞呈現(xiàn)明顯的連續(xù)陽性染色，說明腸道的炎癥較高。

圖4 各組小鼠小腸絨毛上皮細胞凋亡率檢測Fig.4 Apoptotic ratio observation in murine intestinal epithelium of groups

圖5 小鼠小腸固有層IgA+漿細胞檢測（10×20 倍）Fig.5 IgA+ plasmacyte count in the lamina propria （LP）of Balb/c mice

3 討論

Peyer's 結(jié)是小腸內(nèi)淋巴組織的集結(jié)區(qū)域，單個Peyer's 結(jié)包含有5 個以上的淋巴濾泡，在人體內(nèi)主要集中在回腸末端[18]。濾泡具有中心區(qū)域，富含B 細胞，其外由混合細胞包圍。濾泡間含有聚集的T 細胞，濾泡相關(guān)上皮覆蓋著Peyer's 結(jié)，這有利于其接受腸腔內(nèi)抗原的刺激。濾泡的圓頂區(qū)含有一系列II 型主要組織相容性復合物（Major histocompatability complex，MHC），這表明抗原呈遞在這些部位發(fā)生。盡管本試驗中致敏組的PP 結(jié)數(shù)量與對照組差異不顯著，但有明顯的增加趨勢，說明大豆球蛋白刺激了小鼠的免疫反應(yīng)。

在食物過敏過程中，腸道是變態(tài)反應(yīng)發(fā)生的主要場所。腸道黏膜免疫是機體防御的第一防線，正常機體的胃腸道生理及免疫屏障能夠避免大多數(shù)食物引起的可能有害的免疫反應(yīng)[19-20]。腸道的上皮部分由上皮細胞和上皮內(nèi)淋巴細胞（Intraepithelial lymphocytes，IEL）構(gòu)成。腸腔內(nèi)存在大量不同的抗原，固有層有許多作用強烈的免疫效應(yīng)細胞，IEL 則位于腸腔與固有層之間這樣一個特殊的位置。絕大多數(shù)IEL 帶有全T 細胞的標志CD3[21]。固有層的淋巴組織是由一系列的細胞，包括T、B 淋巴細胞、漿細胞、巨噬細胞、主細胞和少量的中性粒細胞組成。固有層的T 細胞可能在腸黏膜非正常破裂時充當反應(yīng)細胞和效應(yīng)細胞的角色，這種作用有可能被T 細胞分泌的炎癥介質(zhì)（如細胞因子協(xié)同）。來源于人類和其他靈長類動物的固有層T 細胞均可合成IL-1α、IL-2β、IL-2、IL-4和IL-5 等細胞因子[22]。

本試驗研究結(jié)果表明，灌胃大豆球蛋白組的小鼠小腸固有層和上皮間淋巴細胞CD3+、CD4+、CD8+淋巴數(shù)量以及CD4+/CD8+細胞比值均較正常組增高，提示食物過敏時小鼠小腸固有層存在大量淋巴細胞浸潤，以CD4+T 細胞亞群為主。Dreau等[23]研究表明，在飼喂含大豆球蛋白和β-伴球蛋白豆粕的斷奶仔豬腸黏膜上皮細胞和固有層里，CD4+和CD8+T 細胞數(shù)量均高于對照組。增加的CD3+、CD4+、CD8+T 細胞和血清里高水平的Ig 抗體表明大豆蛋白能夠同時誘導細胞和體液免疫，其它一些文獻也證明了這一點[24-25]。

CD4+和CD8+效應(yīng)T 細胞的選擇位點與CCR9和α4β7 的表達量有關(guān)[26]。整合素α4β7（α4β7 integrin）是與食物過敏密切相關(guān)的黏附分子[27]。本試驗發(fā)現(xiàn)灌胃大豆球蛋白組的小鼠小腸固有層和腸道上皮組織間α4β7 的陽性細胞數(shù)量顯著高于對照組，提示食物過敏時黏膜中免疫效應(yīng)細胞大量浸潤現(xiàn)象與腸道粘附系統(tǒng)功能異常亢進關(guān)系密切。食物過敏時小腸炎癥部位的一系列炎癥因子可上調(diào)粘附系統(tǒng)，加劇病理性T 細胞向固有層遷移，同時炎癥導致的毛細管擴張，血流速度下降又可使得淋巴細胞暴露于毛細血管內(nèi)皮細胞的時間延長，導致T 細胞表面的整合素得以與黏膜內(nèi)皮粘附分子作用愈發(fā)充分[28]。

細胞凋亡是由基因調(diào)控的，不同于壞死的正常生理性細胞死亡形式，它對維持機體穩(wěn)態(tài)方面起著重要作用。但細胞異常凋亡如凋亡增強或凋亡延遲將會對機體造成嚴重的病理損害。當致病菌感染機體時，由于內(nèi)毒素、細胞因子以及其它炎性介質(zhì)的過度釋放，可以誘導不同細胞內(nèi)凋亡相關(guān)基因過度表達，使這些細胞出現(xiàn)異常凋亡而損害細胞的功能[29]。腸道黏膜上皮細胞及腸道內(nèi)淋巴細胞均是分化迅速的細胞，因此也是凋亡比較活躍的細胞。在某些病理情況下，一旦出現(xiàn)細胞死亡，就無法逆轉(zhuǎn)。因此，不可避免地對機體造成嚴重損害。本試驗?zāi)c道黏膜凋亡的原位觀察中可見灌胃大豆球蛋白組的小鼠小腸上皮細胞出現(xiàn)多處細胞連續(xù)性陽性著色現(xiàn)象，提示食物過敏時小鼠小腸上皮細胞病理性凋亡亢進，上皮屏障功能受損。說明過敏反應(yīng)嚴重時腸淋巴組織易于發(fā)生細胞凋亡，這可能是導致過敏后腸道免疫功能低下的重要原因。

IgA 是腸黏膜表面最重要的抗體，至少有80%的漿細胞位于腸黏膜固有層，分泌大量的IgA，遠遠多于其它類型的免疫球蛋白[30]。黏膜系統(tǒng)中sIgA 反應(yīng)涉及B 細胞的一系列活動。smIgA+B細胞是IgA+漿細胞的前體，離開PP 誘導部位后，經(jīng)淋巴管、淋巴結(jié)到達胸導管最后進入血液循環(huán)，在粘附分子系統(tǒng)（如MadCAM-1/α4β7）的引導下回到腸黏膜固有層。固有層smIgA+B 細胞在IL-4，IL-5，IL-6 等一系列細胞因子的作用下最終分化為IgA+漿細胞，進而向腸腔分泌sIgA 抗體，同時少量smIgA+B 細胞則儲存在固有層中，成為IgA持續(xù)分泌的重要來源[31]。前期的試驗已經(jīng)證明灌胃β-伴球蛋白組的小鼠小腸黏膜sIgA 含量顯著增加（0.17 μg/mL vs 0.37 μg/mL）（P＜0.01）[11]。本試驗結(jié)果證實致敏組小鼠腸道固有層中B 細胞向IgA+漿細胞的分化增加，腸黏膜中sIgA 分泌增加，即表明sIgA 反應(yīng)的一系列體液免疫活動得以加強。這種sIgA 升高等高功能的抗體反應(yīng)過程仍然可能與炎癥狀態(tài)下腸道黏膜“CD8α（-）DC-前體細胞-CD8α（-）DC-Th2-IL-4-B cell（Plasmacyte）-Ig”軸激活有關(guān)。

4 結(jié)論

大豆球蛋白和β-伴球蛋白過敏小鼠腸黏膜CD3+、CD4+和CD8+T 淋巴細胞的數(shù)量顯著增加，腸上皮細胞α4β7 表達量的增加，表明過敏小鼠發(fā)生以腸黏膜CD4+T 細胞浸潤為主的免疫炎癥反應(yīng)，腸黏膜上皮細胞凋亡亢進是造成腸道通透性加強進而破壞腸黏膜屏障功能的重要原因。同時致敏組固有層IgA+漿細胞的增加和腸黏膜中sIgA 含量的增加表明大豆球蛋白同時引發(fā)腸道sIgA 體液免疫反應(yīng)。結(jié)果表明大豆球蛋白和β-伴球蛋白可以同時介導細胞免疫和體液免疫變態(tài)反應(yīng)的發(fā)生。